Биржа транскрибации: Заработок на транскрибации: лучшие сайты для транскрибаторов

Обсуждение

INO80 распознают свободные области

нуклеосом около +1 нуклеосомы. Cell 154,

1246–1256 (2013).

65. D’Arcy, S. etal. Шаперон Nap1 экранирует поверхности гистонов

, используемых в нуклеосомах, и может превращать h3A-h3B

в нетрадиционную тетрамерную форму.Мол. Cell 51,

662–677 (2013).

66. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J.E. И Альмоузни, G.

Шапероны гистонов: сеть сопровождения, регулирующая трафик гистонов

. Структура природы. Мол. Биол. 14,

997–1007 (2007).

67. Hondele, M. etal. Структурная основа узнавания гистона h3A–

h3B эссенциальным шапероном FACT.

Природа 499, 111–114 (2013).

68. Bowman, A. etal. Гистоновые шапероны Nap1 и

Vps75 связывают гистоны h4 и h5 в тетрамерной конформации

.Мол. Cell 41, 398–408 (2011).

69. Swaminathan, V., Kishore, A.H., Febitha, K.K. &

Кунду, T.K. Шаперон гистонов человека нуклеофозмин

усиливает транскрипцию зависимого от ацетилирования хроматина

. Мол. Клетка. Биол. 25, 7534–7545 (2005).

70. Лук, E. etal. Chz1, ядерный шаперон для гистона

h3AZ. Мол. Cell 25, 357–368 (2007).

71. Вс, D. etal. Структурная основа распознавания h4K56-

ацетилированного гистона h4 – h5 шапероном Rtt106.

Nature 483, 104–107 (2012).

72. Owen-Hughes, T. И Уоркман, J.L. Ремоделирование структуры хроматина

массива нуклеосом с помощью нацеленного на транскрипционный фактор

гистонов. EMBO J. 15, 4702–4712 (1996).

73. Lorch, Y., Maier-Davis, B. И Корнберг, R.D. Ремоделирование хроматина

путем разборки нуклеосом invitro.

Proc. Natl Acad. Sci. USA 103, 3090–3093 (2006).

74.Курян, Б.Г. etal. Плотность гистонов поддерживается

во время транскрипции, опосредованной ремоделером хроматина

RSC и гистоновым шапероном NAP1 in1vitro.

Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 1931–1936 (2012).

75. Han, J. etal. Rtt109 ацетилирует гистон h4 лизин 56

и участвует в репликации ДНК. Science 315,

653–655 (2007).

76. Driscoll, R., Hudson, A. И Джексон, S.P. Дрожжи Rtt109

способствуют стабильности генома за счет ацетилирования гистона h4

по лизину 56.Science 315, 649–652 (2007).

77. Rufiange, ,A., Jacques, P.E., Bhat, W., Robert, F. &

Нурани, A. Независимый от репликации по всему геному обмен

гистона h4 происходит преимущественно на промоторах

и вовлекает ацетилирование h4 K56 и

Asf1. Мол. Cell 27, 393–405 (2007).

78. Schwabish, M.A. И Struhl, K. Asf1 опосредует выселение и отложение гистона

во время элонгации с помощью РНК

полимеразы II.Мол. Cell 22, 415–422 (2006).

79. Колонько, E.M. etal. Каталитическая активация ацетилтрансферазы Rtt109 гистона

гистоновым шапероном.

Proc. Natl Acad. Sci. USA 107, 20275–20280

(2010).

80. Цубота, T. etal. Ацетилирование гистона h4K56

катализируется гистоновыми шаперон-зависимыми комплексами.

Мол. Cell 25, 703–712 (2007).

81. Каплан, T. etal. Регуляция включения h4K56ac в дрожжах, опосредованная клеточным циклом и шаперонами

.PLoS

Genet. 4, e1000270 (2008).

82. Youdell, M.L. etal. Роли Ctk1 и Spt6 в

, регулирующих различные состояния метилирования гистона

h4 лизина 36. Mol. Клетка. Биол. 28, 4915–4926

(2008).

83. Йох, S.M., Cho, H., Pickle, L., Evans, R.M. &

Jones, K.A. Домен Spt6 Sh3 связывает Ser2P

RNAPII для управления Iws1-зависимым сплайсингом мРНК и экспортом

. Genes Dev. 21. С. 160–174 (2007).

84. Du, H.N., Fingerman, I.M. И Бриггс, S.D. Метилирование гистона h4

K36 опосредуется путем метилирования трансгистона

, включающим взаимодействие между

Set2 и гистоном h5. Genes Dev. 22, 2786–2798

(2008).

85. Du, H.N. И Бриггс, S.D. Поверхность нуклеосомы, образованная остатками

гистона h5, h3A и h4, необходима для метилирования

собственного гистона h4 Lys36, ацетилирования гистона

и репрессии криптической транскрипции.

J.Biol. Chem. 285. С. 11704–11713 (2010).

86. Carrozza, M.J. etal. Метилирование гистона h4 с помощью Set2

направляет деацетилирование кодирующих областей с помощью Rpd3S, чтобы

подавляли ложную внутригенную транскрипцию. Cell 123,

581–592 (2005).

87. Kaplan, C.D., Laprade, L. И Уинстон, Ф. Транскрипция

факторов элонгации подавляют инициацию транскрипции из

криптических сайтов. Science 301, 1096–1099 (2003).

88.Хасан, A.H., Нили, K.E. И Уоркман, J.L.

Комплексы гистонацетилтрансферазы стабилизируют

Связывание SWI / SNF с промоторными нуклеосомами. Cell 104,

817–827 (2001).

89. Schneiderman, J.I., Orsi, G.A., Hughes, K.T.,

Loppin, B. & Ахмад, K. Истощенные нуклеосомами

хроматиновых промежутков привлекают факторы сборки для варианта гистона h4.3

. Proc. Natl Acad. Sci. USA 10 9,

19721–19726 (2012).

90.Дрю, H.R. И Трэверс, A.A. Изгиб ДНК и его отношение

к позиционированию нуклеосом. J.Mol. Биол. 186,

773–790 (1985).

91. Segal, E. etal. Геномный код для позиционирования нуклеосомы

. Nature 442, 772–778 (2006).

92. Hartley, P.D. И Мадхани, H.D. Механизмы

определяют расположение и идентичность промоторных нуклеосом.

Cell 137, 445–458 (2009).

93. Гангули, О.Д., Череджи, И.Р.В., Ибен, О.Дж.R., Cole, H.A. &

Clark, D.J. RSC-зависимая конструктивная и

деструктивная интерференция между противостоящими массивами

фазированных нуклеосом в дрожжах. Genome Res. 24,

1637–1649 (2014).

94. Ranjan, A. etal. Область, свободная от нуклеосом, доминирует над ацетилированием гистона

при нацеливании SWR1 на промоторы

для замены h3A.Z. Cell 154, 1232–1245

(2013).

Ссылки 54–56 и 94 определяют факторы

, регулирующие функцию SWR при замене гистона

вариант h3A.Z.

95. Yuan, G.C. etal. Идентификация в масштабе генома

позиций нуклеосом в S.viscerevisiae. Science 309,

626–630 (2005).

96. Маврич, T.N. etal. Модель барьерной нуклеосомы для статистического позиционирования

нуклеосом по всему геному дрожжей

. Genome Res. 18, 1073–1083

(2008).

97. Zofall, M. etal. Гистон h3A.Z взаимодействует с РНКи

факторов гетерохроматина подавляют антисмысловые РНК.

Nature 461, 419–422 (2009).

98. Zhang, H., Roberts, D.N. И Кэрнс, B.R. Общегеномная динамика

Htz1, варианта гистона h3A, который уравновешивает

репрессированных / базальных промоторов для активации через потерю

гистонов. Cell 123, 219–231 (2005).

99. Dion, M.F. etal. Динамика репликационно-независимого оборота гистонов

у почкующихся дрожжей. Science 315,

1405–1408 (2007).

Ссылки 77 и 99 определяют концепцию, геномное распределение

и факторы, регулирующие оборот гистонов

в дрожжах дикого типа.

100. Durant, M. И Пью, B.F. NuA4-направленный хроматин

транзакций по всему геному Saccharomyces

cerevisiae. Мол. Клетка. Биол. 27, 5327–5335

(2007).

101. Альтаф, М. etal. NuA4-зависимое ацетилирование

нуклеосомных гистонов h5 и h3A непосредственно

стимулирует включение h3A. Z комплексом SWR1

. J.Biol. Chem. 285, 15966–15977

(2010).

102. Halley, J.E., Kaplan, T., Wang, A.Y., Kobor, M.S. &

Райн, J. Роли для h3A. Z и его ацетилирование в транскрипции GAL1

и индукции гена, но не в транскрипционной памяти

GAL1. PLoS Biol. 8, e1000401

(2010).

103. Draker, R. etal. Комбинация h3A.Z и ацетилирования h5

рекрутирует Brd2 на хроматин во время транскрипционной активации

. PLoS Genet. 8, e1003047

(2012).

104. Chen, P. etal.h4.3 активно маркирует энхансеры и активирует транскрипцию гена

посредством открытия более высокого порядка

хроматина. Genes Dev. 27, 2109–2124

(2013).

105. Heinz, S. etal. Выбор и функция клеток

типоспецифических энхансеров. Nature Rev. Mol. Cell Biol.

http://dx.doi.org/10.1038/nrm3949 (2015).

106. Conerly, M.L. etal. Изменения в занятости h3A.Z и метилировании ДНК

во время В-клеточного лимфомагенеза.

Genome Res. 20. С. 1383–1390 (2010).

107. Зильберман, О.Д., Коулман-Дерр, О.Д., Баллинджер, О.Т. &

Henikoff, S. Гистон h3A.Z и метилирование ДНК представляют собой

взаимно антагонистических меток хроматина. Nature 456,

125–129 (2008).

108. Пчелинцев, N.A. etal. Размещение шаперонного комплекса HIRA histone

в хроматиновом ландшафте.

Cell Rep. 3, 1012–1019 (2013).

109. Киреева, M.L. etal. Ремоделирование нуклеосом, индуцированное

РНК-полимеразой II: потеря димера h3A / h3B

во время транскрипции.Мол. Cell 9, 541–552

(2002).

110. Кулаева, О.И. etal. Механизм ремоделирования и восстановления хроматина

при пассаже РНК

полимеразы II. Структура природы. Мол. Биол. 16,

1272–1278 (2009).

111. Белоцерковская, мкр. etal. FACT способствует транскрипционно-зависимому изменению

нуклеосом.

Science 301, 1090–1093 (2003).

ОТЗЫВЫ

ОТЗЫВЫ ПРИРОДЫ

|

ОНЛАЙН-ПУБЛИКАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ КЛЕТОК

|

11

В ФОКУСЕ ТРАНСКРИПЦИИ

© Macmillan Publishers Limited, 2015.Все права защищены

Nexiwave — Голосовая почта в текст / Транскрипция голосовой почты

Введение

Как администратор Exchange, вы можете создать правило на стороне сервера Exchange для автоматической пересылки сообщений голосовой почты ваших пользователей в Nexiwave для обработки транскрипции голосовой почты.

Примечание для пользователей Office365: Nexiwave предлагает использовать нашу прямую интеграцию с Office365.

Льготы

• Внешний вид / компьютер пользователей не обязательно должны быть постоянно открытыми.
• Одноразовая конфигурация для всех ваших пользователей.

Отлично подходит для

• Все версии Microsoft Exchange и учетные записи Office365.

Реквизит

• Аккаунт Nexiwave.
• Зарегистрируйте пользователей на странице «Дополнительные учетные записи».
• Ваш исходящий транспорт Exchange позволяет доставлять электронную почту в Nexiwave.
• Ваш входящий транспорт Exchange (и любые спам-фильтры) позволяет доставлять электронную почту от Nexiwave.
• (Примечание: это НЕ работает с Mitel NuPoint Advanced UM. Подробнее см. Ниже.)

Как

( Автоматическая пересылка — одна из самых основных функций в Exchange и поддерживается всеми версиями обмена ВСЕ и Office365. Снимки экрана ниже сделаны с использованием Exchange 2016. Точные шаги очень похожи / идентичны для всех других версий Exchange и Office 365 / Exchange Online )

1. Центр администрирования Open Exchange (ECP) для вашей среды Exchange.Вот ссылка на Office365 / Exchange Online.
2. Щелкните поток почты на левой панели.
3. Перейдите на вкладку rules и щелкните значок «+». Откроется список действий. Нажмите Создать новое правило .
   
4. В окне новое правило настройте параметры правила. Назовите правило как угодно, затем перейдите к разделу Применить это правило, если… и щелкните Отправитель… .
   
5. Выберите адрес электронной почты сервера голосовой почты, для которого вы хотите настроить правило. Выделите его в списке и нажмите кнопку add-> . Если адрес электронной почты вашего сервера голосовой почты отсутствует в списке, введите его в текстовое поле после «Проверить имена» и нажмите «Проверить имена». Затем нажмите OK .
   
6. Щелкните Дополнительные параметры… внизу. Это открывает больше действий.
   
7. ( Необязательно ) Используйте «добавить условие», чтобы при необходимости добавить дополнительную фильтрацию.
   
   Например, во время начального теста попробуйте добавить условие, чтобы это правило сначала применялось только к некоторым тестовым пользователям (или группам).
   
   Примечание: не забудьте удалить это условие после завершения тестирования.
8. В Выполните следующий раздел , выберите Перенаправить сообщение на действие … .
   
9. В следующем окне введите «[email protected]» в качестве получателя и нажмите «Проверить имена»:
10. (Правило в основном гласит: сначала перенаправляйте сообщения голосовой почты, отправленные моим сервером голосовой почты, на Nexiwave)
11. Подтвердите свой выбор, нажав кнопку OK .Затем нажмите Сохранить , чтобы завершить настройку правила.

Вот и все — сообщения голосовой почты ваших пользователей теперь будут сначала отправляться в Nexiwave для расшифровки. Nexiwave расшифрует и отправит транскрибированную версию электронного письма (включая стенограмму и аудио) обратно вашему пользователю.

Примечание: после проверки того, что все работает, не забудьте удалить условия тестирования, если они есть, которые вы добавили на шаге 6 выше.

Банкноты

• Включите «Автоматическую регистрацию» или вручную укажите своих пользователей на странице дополнительных учетных записей Nexiwave, в противном случае их сообщения голосовой почты будут игнорироваться.
• Убедитесь, что в вашей установке Exchange есть правило транспорта, разрешающее исходящую доставку и входящее получение от Nexiwave.
• Это НЕ будет работать с функцией Mitel NuPoint Advanced UM. Это связано с тем, что расширенная единая система обмена сообщениями доставляет сообщения через веб-службу Exchange вместо стандартного протокола электронной почты. Вы можете: 1) если вы используете Office365, включить прямую интеграцию Nexiwave O365 для своей учетной записи O365 Enterprise; 2) Или используйте стандартную единую систему обмена сообщениями NuPoint для доставки сообщений через стандартный почтовый протокол.

Вопросы и ответы

• Нужно ли мне менять адрес электронной почты голосовой почты каждого пользователя на собственный адрес электронной почты Nexiwave?
  Нет. Когда электронное письмо отправляется на «[email protected]», наша система достаточно умна, чтобы проверять других получателей в заголовках электронной почты и находить их соответствующие учетные записи Nexiwave.
• Содержит ли электронное письмо с транскрипцией Nexiwave как стенограмму, так и аудио?
  Да, копия Nexiwave всегда содержит: расшифровку стенограммы, аудио-вложение и исходный текст электронного письма (прилагается под расшифровкой).Вся информация переносится.
• Могу ли я выбрать только BCC на Nexiwave, кроме перенаправления?
  Да, конечно. На шаге 6 выше просто выберите «Добавить получателей» и BCC на «[email protected]». Одна из проблем заключается в том, что ваши пользователи будут получать два сообщения электронной почты с одной и той же голосовой почтой: одно с вашего сервера голосовой почты и одно расшифрованное сообщение от Nexiwave. Выбор за вами.

Быстрый обмен глюкокортикоидного рецептора на промоторе связан с транскрипцией и регулируется шаперонами и протеасомами

На основании восстановления флуоресценции после анализа фотообесцвечивания (FRAP) сейчас известно, что большинство ядерных белков являются очень мобильными (28).Список быстро перемещающихся белков включает факторы сплайсинга (17), ядрышковые белки (9), гистон h2 (19, 23) и несколько факторов транскрипции стероидных рецепторов (8, 22, 31, 34, 43). Во всех случаях подвижность факторов транскрипции медленнее, чем подвижность одного GFP, демонстрируя, что все эти белки временно взаимодействуют с сайтами связывания ядер того или иного типа. Большинство этих сайтов не могут быть специфическими промоторами, учитывая количество экспрессируемых молекул (34). Скорее, связывание с хроматином или ядерным матриксом более вероятно (34, 43).Таким образом, эти ядерные данные FRAP дают представление о перемещении белков внутри ядра, но они не касаются непосредственно связывания фактора транскрипции с промотором.

В ограниченном числе случаев было изучено связывание факторов транскрипции со специфическими промоторами. Здесь снова была обнаружена подвижность, что указывает на то, что факторы транскрипции не остаются постоянно связанными с промотором, а скорее подвергаются циклам связывания и расцепления. Первое доказательство этого было получено в экспериментах с FRAP с использованием тандемного массива промоторных сайтов вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), визуализированных с помощью (GFP) -меченного глюкокортикоидного рецептора (GR) (22).Наблюдался быстрый обмен этого рецептора с общим временем восстановления менее минуты. Более поздние исследования с использованием иммунопреципитации хроматина (ChIP) показали, что рецептор эстрогена (ER) циклически действует на нескольких разных промоторах, но с заметно большей периодичностью, порядка 1 часа (31, 37). В дополнение к самим факторам транскрипции, связанные факторы также демонстрируют обмен на промоторах, но опять же с очень разными временными масштабами в зависимости от того, является ли экспериментальный подход FRAP, где наблюдается быстрый обмен (3, 42), или ChIP, где в целом более медленный обнаружено циклирование (4, 31, 37).Когда временное разрешение ChIP было доведено до предела, реципрокная цикличность двух комплексов коактиватора ER (DRIP и p160) могла быть обнаружена на временной шкале всего 2,5 мин (4). Эти данные предполагают, что в других системах существует гораздо более быстрый обмен, но на уровне или ниже пределов временного разрешения чипа.

Еще многое предстоит узнать о механизмах циклирования транскрипционных факторов. Медленный цикл ER требует протеасомной активности (31). В случае быстрого обмена GR ничего не известно, кроме намеков на участие шаперонов и ремоделеров хроматина.Freeman и Yamamoto (12) показали, что молекулярный шаперон p23 может вызывать разборку транскрипционных регуляторных комплексов тироидных рецепторов. Они также обнаружили, что нацеливание in vivo слитого белка gal4-p23 на промотор GR может значительно снизить там активацию транскрипции. Основываясь на этих и других экспериментах, они предположили, что p23 может участвовать в удалении GR во время быстрого обмена. Система ремоделирования хроматина in vitro показала, что рекрутирование Swi / Snf сопровождается потерей GR, что позволяет предположить, что ремоделеры хроматина могут играть роль в быстром обмене GR (11).

Функция обмена фактора транскрипции также недостаточно изучена. В случаях, выявленных на сегодняшний день, было высказано предположение, что цикл рецепторов на промоторе является механизмом определения изменений в уровнях гормонов (12, 22, 31, 37). Также было высказано предположение, что протеасомное удаление мощных факторов транскрипции с их промоторов может быть средством ограничения транскрипционного выхода (24). Однако, помимо этих гипотез, не было предложено никаких других функций для обмена фактора транскрипции.

Нашей целью в этом исследовании было изучить механизм и функцию быстрого обмена GR, наблюдаемого в живых клетках в тандемном массиве промоторных сайтов MMTV. Мы обнаружили, что в целевых сайтах присутствуют как шапероны, так и протеасомы. Нарушение любого из них приводит к противоположным изменениям обменного курса, указывая на то, что обменный курс обычно частично регулируется балансом между шаперонной и протеасомной активностями. Мы также обнаружили корреляцию между обменом GR и количеством транскрипции, предполагая, что более длительное время пребывания GR способствует большей транскрипции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии. В большинстве экспериментов использовали клеточную линию 3617. Клетки содержат 200 тандемных повторов элемента размером 9 т.п.н., состоящего из промотора MMTV, за которым следуют ras и гены BPV (16), и они стабильно экспрессируют GFP-меченый GR под контролем системы отключения тетрациклина (44). Контрольные эксперименты были выполнены с родительской клеточной линией 3134, которая содержит тандемные повторы, но не GR с меткой GFP. Для создания клеток, содержащих только GFP, 3134 клетки трансфицировали плазмидой GFP (pEGFPC1; Clontech).Для создания клеток, содержащих GFP-HP1α, 3134 клетки трансфицировали плазмидой для конструкции (любезный подарок T. Cheutin и T. Misteli, Лаборатория рецепторной биологии и экспрессии генов, Национальный институт рака, Бетесда, Мэриленд).

Клетки выращивали при 37 ° C с 5% CO. ₂ в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (Gibco BRL) с добавлением 2 мМ глутамина (Gibco BRL), 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone) и 5 ​​мкг тетрациклина / мл (для подавления экспрессии GFP-GR). При подготовке к экспериментам под микроскопом клетки переносили в эту среду и оставляли там на ночь, за исключением того, что тетрациклин не добавляли, фетальную бычью сыворотку обрабатывали древесным углем и декстраном (Gemini Bio-Product) для удаления стероидов, которые могли активировать GFP-GR, и Для устранения автофлуоресценции использовали среду, не содержащую фенолового красного.Непосредственно перед экспериментами GFP-GR активировался либо синтетическим гормоном дексаметазоном (Sigma), либо естественным гормоном кортикостероном (Sigma), либо антагонистом RU486 (любезный подарок Кэти Смит, Лаборатория биологии рецепторов и экспрессии генов), каждый в концентрации 100 нМ.

FRAP. Для экспериментов с FRAP клетки выращивали в течение ночи в камерах с покровным стеклом (Lab-Tech), а затем индуцировали гормоном в течение 30 мин. Для ингибирования hsp90 или протеасом после гормональной индукции применяли гельданамицин (2,5 мкг / мл) или MG-132 (100 мкМ) (Calbiochem) соответственно.В обоих случаях были проведены параллельные контрольные эксперименты с носителем (диметилсульфоксид). После обработки гелданамицином камеры с живыми клетками держали на предметном столике микроскопа не более 5 минут с кортикостероном или 30 минут с дексаметазоном, чтобы избежать стресса, приводящего к образованию агрегатов GFP-GR. Для экспериментов по истощению АТФ клетки обрабатывали 10 мМ азида натрия (Sigma) в DMEM без глюкозы с добавлением 6 мМ 2-дезоксиглюкозы (Sigma) или с DMEM без глюкозы без азида натрия и только с 6 мМ 2-дезоксиглюкозы.Эксперименты FRAP проводились на конфокальном микроскопе Zeiss 510 либо с числовой апертурой 40 × 1,3, либо с числовой апертурой 100 × 1,3. масляный иммерсионный объектив. Клетки поддерживали при 37 ° C, используя инкубатор с воздушным потоком (Nevtek). Отбеливание проводилось с помощью линий 488 и 514 нм аргонового лазера мощностью 45 мВт, работающего при мощности лазера 75%. Для отбеливающего импульса использовалась одна итерация, которая длилась 0,018 с для объектива 40x или 0,065 с для объектива 100x. Восстановление флуоресценции контролировали при низкой интенсивности лазера (0.2% для лазера мощностью 45 мВт) с интервалами от 40 до 500 мс, в зависимости от эксперимента.

Анализ FRAP. Было выполнено около 10 отдельных FRAP, которые затем усреднились для создания единой кривой FRAP. Временное разрешение оставалось постоянным, пока измерялось восстановление, но это привело к очень большому количеству близко расположенных точек на второй, более медленной фазе кривой восстановления. Чтобы решить эту проблему, мы усреднили от 3 до 10 соседних точек в этой более медленной части кривой. Это привело к созданию примерно одинаково расположенных точек вдоль кривой восстановления и, следовательно, позволило избежать чрезмерного взвешивания более медленной фазы кривой во время подгонки.

Эффективная диффузионная подгонка была выполнена с использованием теории Soumpasis для круглого пятна отбеливания (39), реализованной в Matlab с помощью программы nlinfit. В теории Soumpasis скорость FRAP определяется как τ = w ² /4 D , где w — радиус пятна отбеливания, а D — константа диффузии (или эффективной диффузии). Данные FRAP представлены как frap ( t ) = e ^{−2 r / t} [ I ₀ (2 r / t ) + I ₁ (2 r / t )], где t — время, а I ₀ и I ₁ — модифицированные функции Бесселя.Функции Бесселя и их варианты обычно возникают в дифференциальных уравнениях с цилиндрической симметрией (1), как это происходит для FRAP с круглым пятном отбеливания (15). Теория Soumpasis предполагает нормализованный FRAP, который находится в диапазоне от 0 до 1. Чтобы учесть это, мы перенормировали наши данные FRAP, установив глубину отбеливания на 0, а окончательный уровень восстановления на 1. Это исключает любые различия между восстановлением из-за отбеливателя. глубина или конечная неподвижная фракция. Таким образом, параметр τ напрямую измеряет скорость подъема кривой восстановления.Для каждого FRAP оценка τ дала стандартную ошибку, которая затем использовалась в тесте t для вычисления значения P при статистическом сравнении двух кривых восстановления. Эти значения P показаны на всех сравнительных графиках для извлечения GFP-GR.

Прогнозируемая константа диффузии может использоваться для оценки массы молекулы при условии отсутствия связывающих взаимодействий. Оценка Soumpasis для ядерной подвижности GFP-GR дает оценку D _GFP-GR из 1.05 мкм ² / с. Soumpasis, пригодный для GFP только в ядрах той же клеточной линии, дает оценку D _GFP 15 мкм ² / с (данные не показаны), в ~ 15 раз медленнее, чем GFP-GR. С D ∝ M ^-1/3 , где M — масса, данные FRAP предсказывают увеличение массы GFP-GR на 15 ³ по сравнению с GFP, или молекулярную массу на ~ 95 МДа для GFP-GR. Это намного больше, чем любой известный молекулярный комплекс, и поэтому подвижность GFP-GR в нуклеоплазме должна быть замедлена за счет связывающих взаимодействий.{{\ ast}} _ {on} / \ mathit {k} _ {off} \) $$ mathtex $$ . Тогда k _от изменяли, как указано в легенде к рисунку, чтобы получить новые значения для τ, которые затем использовались для построения новых кривых FRAP из уравнения Soumpasis, описывающего FRAP.

FRAP в массиве MMTV и в других частях ядра зависят от размера пятна обесцвечивания и хорошо соответствуют модели эффективной диффузии. (а) Клетка 3617 после 30-минутной индукции 100 нМ дексаметазона. Массив MMTV виден как яркое пятно (обведено) возле одного из ядрышек.Шкала 10 мкм. (b) Для быстрого сбора данных во время FRAP изображения были собраны только в полосе, охваченной красным прямоугольником на панели a. Отображаются выбранные моменты времени (t). (c) Матрицы были обесцвечены с радиусом пятна 0,9 или 1,8 мкм. Во всех случаях массив был достаточно большим, чтобы полностью заполнить область пятна отбеливания. Более крупные пятна отбеливания приводят к значительно более медленному выздоровлению. Это указывает на то, что диффузия способствует FRAP. Для этих и всех последующих кривых FRAP стандартные ошибки для всех точек всегда были <0.01 и, следовательно, меньше, чем точки, используемые для построения. (d) Восстановление GFP-GR в другом месте ядра также показывает зависимость от размера пятна обесцвечивания, что указывает на роль диффузии GFP-GR в подвижности ядра. (e) Данные GFP-GR FRAP как в массиве, так и в другом месте ядра хорошо соответствовали однопараметрической модели для диффундирующей молекулы, обесцвеченной круглым пятном, со скоростью восстановления, задаваемой параметром подгонки τ. Восстановление в массиве постоянно происходит медленнее, чем где-либо в ядре.Эта разница статистически значима, как показывает тест t с использованием средних значений τ и их 95% доверительных интервалов. Вычисленное значение P (<0,0001) очень важно. (f) Модели FRAP, которые включают как диффузию, так и связывание, показывают, что значительные изменения параметров связывания приводят к небольшим изменениям в кривой FRAP. Это связано с тем, что диффузия остается неизменной после обработок, влияющих на связывание. Прогнозируемые кривые показаны для ряда отклонений.

Анализ транскрипции. Уровни транскрипции измеряли в матрице MMTV с помощью флуоресцентной гибридизации РНК in situ (FISH) точно так, как описано Müller et al. (25). Конкретные условия для каждого транскрипционного анализа были следующими. При изучении эффектов гелданамицина клетки индуцировали гормоном в течение 15 минут, чтобы позволить GFP-GR переместиться в ядро, а затем обрабатывали в течение 45 минут лекарственным средством или носителем (диметилсульфоксид). Чтобы определить уровни транскрипции после лечения препаратом, уровни РНК FISH корректировали с учетом транскрипции в первые 15 мин, когда присутствовал гормон, но до добавления какого-либо лекарства.Это было сделано путем измерения средних уровней транскрипции через 15 минут гормонального лечения и последующего вычитания этого значения из средней интенсивности РНК FISH после 45-минутного лечения лекарственными препаратами.

Для MG-132 клетки предварительно обрабатывали препаратом в течение 1,5 ч и индуцировали гормоном в течение 30 мин перед фиксацией. Во всех случаях средние уровни транскрипции были получены по крайней мере из 35 клеток. Когда измеряли уровни транскрипции конденсированных и деконденсированных массивов, добавляли 100 нМ дексаметазона, а затем через 3 часа клетки готовили для РНК FISH.Всего было исследовано 113 ячеек, и периметр диаметром 6 мкм был выбран в качестве порогового значения, отделяющего сконденсированные массивы от деконденсированных.

Иммунофлуоресценция. Клетки выращивали в течение ночи на 22-миллиметровых покровных стеклах ² , затем индуцировали 100 нМ дексаметазоном или кортикостероном и фиксировали абсолютным метанолом при -20 ^o C в течение 15 минут или в течение 5 минут в 1 части 37%. формальдегид и 9 частей буфера PEM (100 мМ PIPES, 5 мМ EGTA, 2 мМ MgCl ₂ , pH 6,8, плюс 0.2% Тритон Х-100). После любой фиксации клетки трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) по 10 мин каждый раз. Сходные результаты иммунофлуоресценции были получены с обоими протоколами фиксации, за исключением того, что фиксация метанолом требовалась для обнаружения любого окрашивания антителом hsp90.

Для обнаружения агрегатов GFP-GR индуцированные кортикостероном клетки обрабатывали в течение 10 мин 2,5 мкг гелденамицина / мл с последующими 20 мин тепловым (45 ° C) или холодным (на льду) шоком и фиксировали в 3 раза. .5% параформальдегид при комнатной температуре в течение 15 мин. После фиксации формальдегидом клетки подвергали проницаемости в течение 10 минут с помощью 0,5% Triton X-100 в PBS и трижды промывали в PBS по 10 минут каждый раз.

Для всех экспериментов по иммунофлуоресценции клетки инкубировали в течение ночи с первичным антителом, разведенным в PBS с 4% бычьим сывороточным альбумином и 0,1% Tween 20. После инкубации клетки промывали три раза в PBS по 10 мин каждый раз, а затем инкубировали в течение 1-2 часа с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным либо с техасским красным, либо с родамином.Затем клетки промывали еще три раза в PBS перед окончательной фиксацией в PBS и исследовали на микроскопе Leica DMRA с Leica 100 × 1,3-N.A. масляный иммерсионный объектив. Изображения были получены в зеленой (GFP-GR) и красной (антитела) флуоресценции с помощью камеры SenSys (Photometrics) с чипом KAF1400, сконфигурированным для сбора пикселей диаметром 0,067 мкм.

Были использованы следующие антитела: анти-hsp70 (MA3-006; аффинные биореагенты), анти-p23 (MA3-414; аффинные биореагенты), антипротеасома (19S субъединица S10B; аффинные биореагенты) и анти-hsp90 (SPA-835 ; Стрессген).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристика кривых FRAP. Для исследования механизма и функции быстрого обмена фактора транскрипции мы использовали линию клеток 3617, в которой обмен GR был ранее охарактеризован (22). Эти клетки представляют собой аденокарциномы мыши, содержащие ~ 200 тандемных копий промотора MMTV с ассоциированными репортерными генами (44). Путем количественной оценки уровней GFP в массиве MMTV мы подсчитали, что в среднем там присутствует ~ 700 GFP-GR, что согласуется с ожидаемым количеством сайтов связывания GR в массиве (10).

В клетках, обработанных гормоном, массив MMTV становится видимым как яркое пятно (25) (рис. 1a). FRAP на этом участке показывают очень быстрое восстановление с половиной времени (время до 50% восстановления) ~ 5 с (22). Для достижения хорошего временного разрешения этого восстановления данные FRAP собирались с интервалами ≥40 мс путем сбора изображений только в узкой полосе, охватывающей массив (рис. 1a и b). Приблизительно 10 клеток были усреднены для создания одной кривой FRAP для одного эксперимента, и все эксперименты, описанные здесь, были выполнены, по крайней мере, в три разных дня, чтобы гарантировать воспроизводимость.

FRAP измеряет подвижность за счет диффузии и, если присутствует, транспорта или связывания. Распространение способствует каждому выздоровлению, но в некоторых случаях этот вклад невелик и / или быстр, и его можно игнорировать. Чтобы проверить роль диффузии, мы выполнили отбеливание с различными размерами пятен на массиве и наблюдали различия в восстановлении (рис. 1c). Мы также обнаружили различия в скорости восстановления, когда другие области ядра были обесцвечены с помощью пятен разного размера, что указывает на то, что диффузия способствовала восстановлению GFP-GR повсюду в ядре (рис.1г).

Эти скорости восстановления, однако, были значительно ниже, чем у одного GFP, который восстанавливается почти мгновенно с размерами пятна, используемыми в наших экспериментах (данные не показаны). Если бы восстановление GFP-GR происходило за счет простой диффузии, то они предсказывали бы массу GFP-GR ~ 95 МДа, что значительно больше, чем у любого известного комплекса (подробности этого расчета см. В Материалах и Методах). Следовательно, связывающие взаимодействия должны задерживать GFP-GR FRAP как в ядре, так и особенно в массиве MMTV.

Самый простой сценарий для объяснения комбинированной диффузии и связывания — это эффективная диффузия (15). Здесь FRAP демонстрирует замедленную диффузию с «эффективной» константой диффузии, замедленной пропорционально аффинности связывания. В соответствии с эффективной диффузией, скорости GFP-GR FRAP хорошо соответствовали однопараметрической модели для диффундирующей молекулы, обесцвеченной круглым пятном (рис. 1e) (39).

Подгонки эффективной диффузии информативны по нескольким причинам. Во-первых, они обеспечивают однопараметрическую аппроксимацию скорости FRAP (τ), что позволяет проводить статистическое сравнение кривых на основе этого параметра.Например, при использовании того же размера пятна отбеливания τ в массиве значительно больше, чем τ в другом месте ядра (рис. 1e). Эти значения τ с их 95% доверительным интервалом могут использоваться в тесте t для вычисления значения P , чтобы оценить, существенно ли отличаются восстановления. Значение P для извлечения ядра по сравнению с извлечением массива очень важно ( P <0,0001). Это демонстрирует, что массив восстанавливается значительно медленнее, чем другие сайты в ядре, что указывает на более плотное связывание в массиве, как и ожидалось для локальной высокой концентрации там специфических сайтов связывания.

Во-вторых, теория эффективной диффузии дает представление о том, как такие кривые FRAP изменяются в ответ на изменения аффинности связывания. Удвоение или уменьшение вдвое скорости восстановления приводит к умеренным изменениям скорости восстановления, поскольку диффузия, которая не изменяется, также вносит свой вклад (рис. 1f). Таким образом, в сценарии эффективной диффузии данные FRAP должны быть собраны и проанализированы с точностью, чтобы обнаружить изменения в аффинности связывания при различных возмущениях.

Наконец, в своей простейшей форме теория эффективной диффузии предсказывает константу псевдоравновесного связывания (15), но только для случая, когда распределение флуоресценции является однородным.Это должно относиться к типичным местоположениям в ядре, но в настоящее время такие оценки не могут быть получены для массива, потому что теория должна быть расширена для учета такого неоднородного распределения флуоресценции, в котором яркая область (массив) окружена более тусклой областью. (остальное ядро). Дальнейшие теоретические исследования необходимы для извлечения оценок констант связывания из этих данных.

Во всех последующих экспериментах мы использовали оценки скорости извлечения τ на установке только как средство для сравнения кривых.Для любой пары восстановлений GFP-GR мы выполнили тест t для значений τ для скорости восстановления. На каждом графике мы сообщаем значение P как меру того, существует ли статистически значимая разница между кривыми.

Энергетическая зависимость восстановления GFP-GR. Простейшее объяснение обмена GFP-GR в массиве состоит в том, что он отражает пассивный процесс, определяемый простым равновесием связывания GFP-GR с промотором MMTV. Если это так, то процесс обмена должен быть энергетически независимым.Чтобы проверить это, мы истощили клеточные уровни АТФ с помощью азида натрия и дезоксиглюкозы. FRAPs как в массиве, так и в другом месте ядра были радикально изменены (рис. 2a и b). Оба участка показали восстановление <100% с более значительным замедлением в массиве MMTV, чем где-либо еще в ядре. Это предполагает, что для нормального обмена GFP-GR в массиве может потребоваться энергия, но большое влияние на восстановление в другом месте ядра вызвало беспокойство о неспецифических эффектах. Поэтому мы стремились определить условия для восстановления АТФ, которые минимизируют влияние на FRAP в других сайтах ядра.Это было достигнуто путем инкубации только с дезоксиглюкозой, которая блокирует только неокислительное фосфорилирование (36) и поэтому не так эффективна, как азид и дезоксиглюкоза вместе. FRAP были слегка затронуты во всем ядре после обработки дезоксиглюкозой, но восстановление в матрице теперь было качественно другим, поскольку они все еще демонстрировали неподвижную фракцию (рис. 2c и d). Эта неподвижная фракция исчезла после вымывания дезоксиглюкозы, демонстрируя, что неподвижность не была следствием токсичности (рис.2д).

GFP-GR в массиве является энергозависимым процессом. 30-минутная обработка 10 мМ азида натрия и дезоксиглюкозы приводит к заметному снижению скорости обмена в массиве (а) и в других местах ядра (б). Перенос клеток в среду без глюкозы (только дезоксиглюкозу) на 60-90 мин индуцирует около 5% неподвижной фракции в массиве (c), но обмен на других участках ядра не показывает неподвижную фракцию (d) . (e) Вымывание дезоксиглюкозы устраняет неподвижную фракцию в матрице.

Полное восстановление, наблюдаемое в другом месте ядра, предполагает, что пониженные уровни АТФ сначала влияют на подмножество сайтов, уникальных для массива MMTV, прежде чем повлиять на связывание общего GR-хроматина. Эта часть сайтов MMTV, по-видимому, требует энергии для выпуска GFP-GR. Однако быстрый обмен все еще происходит в оставшихся сайтах MMTV, тем самым определяя два класса сайтов: небольшая фракция, чувствительная к АТФ, и большая часть, которая относительно нечувствительна к АТФ. Эти результаты резко контрастируют со многими ядерными белками, которым не требуется энергия для своей подвижности (19, 28).

Роль шаперонов в восстановлении GFP-GR. Ряд факторов может вносить вклад в энергетическую зависимость АТФ-чувствительной фракции сайтов MMTV. АТФ-зависимый шаперонный комплекс, который включает hsp70, hsp90, p23 и несколько иммунофилинов, связывается с не связанными границами GR в цитоплазме, обеспечивая связывание лиганда (30). Как только лиганд связывается, шаперонный комплекс диссоциирует, но позже воссоединяется после того, как лиганд отделяется от GR. Эта ассоциация и диссоциация, вызванные потерей лиганда, называются шаперонным циклом.Помимо своей цитоплазматической роли, шаперонный комплекс также играет роль в рециклинге GR в ядре (7, 20). Более того, Freeman и Yamamoto (12) предположили, что шапероны разбирают транскрипционные регуляторные комплексы на промоторных сайтах. Если это имело место для GR в промоторе MMTV, то нарушение функции шаперона должно привести к замедлению FRAP в массиве MMTV.

В качестве первого теста на участие шаперонов мы использовали иммунофлуоресценцию для исследования субклеточного распределения hsp90, hsp70 и p23 в клеточной линии массива MMTV.Мы обнаружили, как и ожидалось, что эти молекулы были в основном цитоплазматическими, но также была обнаружена некоторая ядерная флуоресценция. Примечательно, что мы последовательно обнаружили ассоциацию hsp90, hsp70 и p23 с массивом MMTV. Антитела против этих молекул совместно локализовались с сигналом GFP-GR в матрице, а также обычно окрашивали область, окружающую матрицу (рис. 3). Размер области, окрашенной шаперонами, всегда был пропорционален размеру массива MMTV, с более крупными массивами, которые содержали больше GFP-GR, характеризуемых, соответственно, более крупными областями окрашивания шаперонов.Эти наблюдения демонстрируют, что шапероны рекрутируются на сайт MMTV, и предполагают, что шапероны способны влиять на обмен GFP-GR в массиве.

Иммунофлуоресцентное обнаружение белков-шаперонов на матрице MMTV (обведено). Антитела против hsp90 (от a до c), hsp70 (от d до f) или p23 (от g до i) окрашивают цитоплазму, как и ожидалось, но внутри ядер они также последовательно колокализуются с GFP-GR в массиве MMTV. Вставки содержат увеличенные изображения колокализации в массиве.Шкала 10 мкм.

Чтобы нарушить активность шаперона, мы сначала использовали антибиотик гелданамицин (32), который специфически блокирует активность hsp90, связываясь с его N-концевым сайтом АТФ и предотвращая связывание p23 (38). Как и ожидалось, гелданамицин (2,5 мкг / мл) блокировал импорт GFP-GR в клеточной линии массива (6), поэтому для изучения ядерных событий мы предварительно обработали клетки дексаметазоном, а затем добавили гелданамицин через 30 минут, когда ядерный импорт GR был завершен. Хотя массивы MMTV начали исчезать через 1 час лечения гелданамицином (рис.4a), нормальное количество массивов все еще было ясно видно после 30-60 мин обработки гелданамицином, что позволяло измерять с помощью FRAP обмен GFP-GR в матрице. В клетках, обработанных гелданамицином, FRAP в матрице были быстрее, чем в контрольных клетках (фиг. 5a). Более сильные эффекты можно было наблюдать при более высоких концентрациях гелданамицина, но они также приводили к значительным эффектам в других частях ядра (данные не показаны). Таким образом, используемая здесь концентрация гелданамицина сводит к минимуму воздействие на остальную часть ядра и, следовательно, должна отражать эффекты, уникальные для связывания GFP-GR с сайтами MMTV.Дальнейшие доказательства этого получены из клеток, трансфицированных другим ядерным белком, GFP-HP1α, и обработанных гелданамицином. Никакого влияния на восстановление GFP-HP1α обнаружено не было (рис. 5b). Аналогичные результаты были получены и для одного GFP (данные не показаны). Эти данные показывают, что гелданамицин в целом не изменяет подвижность белков в ядре.

Массивы (обведены) исчезают намного быстрее после лечения гелданамицином, когда кортикостерон является лигандом, чем когда дексаметазон является лигандом.В любом случае гельданамицин вызывает исчезновение массивов (красные линии) быстрее, чем обычно (черные линии). Пример исчезновения массива для каждого случая показан псевдоцветом, чтобы выделить массивы. (а) Когда дексаметазон является лигандом, исчезновение массива происходит постепенно и происходит в течение 2 часов. (b) Когда кортикостерон является лигандом, исчезновение матриц, вызванное гелданамицином, резко ускоряется и происходит в течение 10 минут. Эти результаты показывают, что эффекты гелданамицина усугубляются кортикостероном, предположительно из-за его более быстрого обмена с ГР.Они также предполагают, что в присутствии гелданамицина GR в конечном итоге становится лишенным лиганда и неспособным связываться с сайтами MMTV. Шкала 5 мкм.

Эффекты ингибирования hsp90. FRAP в массивах MMTV быстрее после обработки 2,5 мкг гелданамицина / мл (a) или 5 мкг радицикола / мл (c), чем в контрольных клетках, но ускорение обнаруживается сразу в кортикостероне (e), пока оно появляется только через 30-60 мин в дексаметазоне (а). (b) Эти изменения не вызваны общим влиянием на подвижность белка, поскольку клетки, трансфицированные GFP-HP1α, не проявляют никакого эффекта на FRAP после обработки гелданамицином.(Обратите внимание, что извлечение GFP-HP1α не соответствует эффективной диффузии [данные не показаны], поэтому тест t для вычисления значения P не может быть проведен.) (D) Эксперименты по отмене гормона демонстрируют это по сравнению с дексаметазоном. , кортикостерон намного быстрее обменивается с ГР. Показаны средние уровни транскрипции, измеренные с помощью РНК FISH для 35 клеток. Клетки индуцировали 100 нМ кортикостероном (CORT) или дексаметазоном (DEX) в течение 15 минут, а затем трижды промывали в течение 5-минутного периода в среде без гормонов и оставляли в этой среде на 45 минут.При использовании кортикостерона в качестве лиганда транскрипция отменяется после 5-минутной промывки, что указывает на полную замену лиганда на GR во время промывки. В тот же период отмывки значительное количество дексаметазона остается связанным, поскольку транскрипция снижается только на 50%. (f) Обработка гелданамицином вызывает прогрессирующую потерю GFP-GR из массива и уменьшение размера, что сопровождается потерей шаперонов. Показана потеря p23 из массива после обработки гелданамицином (GELD) дексаметазоном в качестве лиганда.Шкала 5 мкм.

Чтобы подтвердить результаты гелданамицина, мы также обрабатывали клетки другим препаратом, радициколом, который нарушает активность hsp90, блокируя его N-концевой сайт связывания АТФ (35). И снова мы обнаружили, что FRAP в массиве был быстрее (рис. 5c).

Известно, что гелданамицин и радицикол специфичны для hsp90 (32), но этот шаперон играет роль во многих клеточных процессах (29). Чтобы проверить, влияет ли гелданамицин напрямую на ГР, мы заменили дексаметазон естественным гормоном кортикостероном.Поскольку полупериод связывания кортикостероидов с GR при 0 ° C намного короче, чем у дексаметазона (14, 26), мы пришли к выводу, что кортикостерон должен усиливать любые эффекты гелданамицина, если они возникают из-за потери лиганда из GR и последующего прохождения через шаперонный цикл.

Чтобы подтвердить разницу в аффинности связывания этих двух стероидов с GFP-GR в клеточной линии массива MMTV при физиологических температурах, мы использовали кортикостерон или дексаметазон в качестве лиганда, промыли клетки три раза в течение 5-минутного периода в среда без лиганда, и сравнили транскрипционные выходы.После вымывания кортикостерона дополнительная транскрипция была отменена, в отличие от вымывания дексаметазоном, где транскрипция упала только на 50% (рис. 5d). Это демонстрирует, что в течение 5-минутного периода отмывки практически весь кортикостерон стал несвязанным с GR, тогда как значительные количества дексаметазона все еще были связаны. Эти результаты демонстрируют in vivo, что дексаметазон остается гораздо более тесно связанным с GR, чем кортикостерон.

Как и предполагалось, эффекты гелданамицина усиливались в присутствии кортикостерона.Исчезновение массивов GFP-GR происходило намного быстрее с кортикостероном (фиг. 4b), а FRAP становилось быстрее сразу после добавления гелданамицина (фиг. 5e). Этот немедленный ответ убедительно свидетельствует о том, что эффект гелданамицина специфичен для GR.

Затем мы спросили, влияет ли лечение гелданамицином на ассоциацию шаперонов с массивом MMTV. Используя иммунофлуоресценцию, мы обнаружили, что уровни p23 снижались пропорционально продолжительности лечения гелданамицином (рис. 5f).Аналогичные результаты наблюдались с hsp90 и hsp70. Постепенная потеря шаперонов всегда сопровождалась уменьшением размера массива и количества ассоциированного GFP-GR. Таким образом, наши данные не различают, приводит ли потеря шаперонов после лечения гелданамицином к потере GFP-GR или наоборот.

Более быстрые FRAP в присутствии гелданамицина также наблюдались после более продолжительного лечения (от 1 до 3 часов с дексаметазоном в качестве лиганда), хотя массивы стали труднее обнаруживать (рис.4а). После 30 мин визуализации этих клеток, обработанных гелданамицином в течение 1–3 ч, по всему ядру появились многочисленные пятна, обогащенные GFP-GR (рис. 6а). Эти пятна не были массивами, поскольку в ядре присутствуют только один или два массива. Пятна также могут возникать, когда лечение гелданамицином сочетается с холодом или тепловым шоком. Пятна совместно локализованы с протеасомным компонентом (Рис. 6b и c), указывая тем самым, что они могут отражать аномальные скопления неправильно свернутых белков (41). Как наблюдалось для этих других включений, связанных с протеасомами, FRAP в пятнах GFP-GR обнаруживали замедление с неподвижной фракцией (рис.6г). Это указывает на то, что некоторая фракция GR иммобилизуется в каждом пятне и образует белковый агрегат. Таким образом, мы обнаружили, что продолжительное лечение гелданамицином в сочетании с дополнительным стрессом (тепло, холод или визуализация) может вызывать неспецифические эффекты, которые приводят к более медленному FRAP на агрегатах GFP-GR. Как только эти агрегаты сформировались, массивы исчезли, но до этого момента FRAP в массивах всегда был быстрее, чем в элементах управления.

Ядерные агрегаты GFP-GR. (от a до c) Обработка гелданамицином в сочетании со стрессом (тепло, холод или длительная визуализация) вызывает исчезновение массивов и образование пятен GFP-GR, которые совместно локализуются с протеасомными антителами.(d) В этих пятнах иммобилизована часть GFP-GR по сравнению с другими областями ядра. Во время визуализации эти агрегаты появляются быстрее с кортикостероном, чем с дексаметазоном. Шкала 5 мкм.

В целом гелданамицин или радицикол вызывали более быстрое выздоровление в матрице. Это ускорение происходило мгновенно в присутствии кортикостерона, что убедительно свидетельствует о специфическом влиянии на GFP-GR. Следовательно, неподвижная фракция, наблюдаемая после истощения АТФ, не является результатом разрушения шаперонов.

Роль протеасомы в восстановлении GFP-GR. Протеасома является альтернативным кандидатом для регуляции АТФ-чувствительной фракции сайтов MMTV. И 19S, и 20S субъединицы протеасомы нуждаются в АТФ (18). Как отмечалось во введении, все больше данных указывает на роль протеасомы в регуляции факторов транскрипции, и, более того, протеасомы часто взаимодействуют с шаперонами.

В качестве первого теста на участие протеасом мы окрашивали клетки антителом против компонента 19S.Это антитело последовательно колокализовалось с массивом и окружающими областями, предполагая, что протеасома рекрутировалась в этот сайт и могла играть роль в обмене GFP-GR там (рис. 7a-c). Как было обнаружено для компонентов шаперонов, существует прямая корреляция между размером массива и степенью окрашивания протеасом (данные не показаны), предполагая, что увеличение количества GR привлекает больше протеасом к промотору.

Иммунофлуоресцентное обнаружение протеасомы в массиве MMTV (обведено) и FRAP после нарушения функции протеасомы.Обнаружено значительное окрашивание протеасом в цитоплазме. (от a до c) Внутри ядра постоянно наблюдалась совместная локализация с массивом MMTV. На вставке показан увеличенный вид колокализации в массиве. (d и e) Клетки, индуцированные дексаметазоном или кортикостероном и подвергшиеся действию ингибитора протеасом MG-132, проявляли более медленную FRAP в массивах MMTV. (f) Это различие не было вызвано общим замедлением подвижности белков в ядре, поскольку обработка MG-132 не влияла на восстановление GFP-HP1α.(Опять же, эти извлечения GFP-HP1α не соответствуют эффективной диффузии, поэтому ни скорость извлечения, τ, ни значение P для сравнения не могут быть рассчитаны.) Масштабная шкала, 10 мкм.

Чтобы проверить роль протеасомы в обмене GFP-GR в массиве MMTV, мы обработали клетки ингибитором протеасом MG-132 (18). Это привело к замедлению FRAPs с дексаметазоном или кортикостероном в качестве лиганда (рис. 7d и e). Более сильные эффекты с MG-132 можно было вызвать при более высоких концентрациях или более длительном лечении, но мы выбрали концентрацию и время лечения так, чтобы эффекты MG-132 были минимизированы в другом месте ядра.Это должно помочь гарантировать, что эффекты, наблюдаемые в массиве MMTV, были уникальными для привязки GFP-GR к сайтам MMTV. Кроме того, MG-132 не влиял на подвижность только GFP (данные не показаны) или GFP-HP1α (фиг. 7f), демонстрируя, что он не нарушал неспецифически подвижность белка по всему ядру.

Имея доказательства активности протеасом и шаперонов на сайтах MMTV, мы затем спросили, повлияло ли нарушение одной системы на другую. Мы использовали иммунофлуоресценцию для изучения уровней протеасомы 19S после лечения гелданамицином.Как было замечено ранее для компонентов шаперона, гелданамицин также приводил к прогрессирующей потере со временем протеасомы 19S из массива MMTV (фиг. 8a-f). Это всегда коррелировало с уменьшением размера самого массива и количества GFP-GR в нем, что делало невозможным различить, вызывает ли потеря GFP-GR протеасомную потерю или наоборот. Тем не менее, эта постепенная потеря протеасомы после лечения гелданамицином должна сама по себе приводить к более медленным FRAP, тем самым противодействуя обнаруженному нами эффекту, а именно более быстрым FRAP.Это говорит о том, что мы могли наблюдать даже более быстрое выздоровление после того, как гелданамицин не повлиял на уровни протеасом. В дополнительных экспериментах мы также использовали иммунофлуоресценцию для изучения уровней p23 после обработки MG-132 и не обнаружили изменений (рис. 8g-l). Этот эффект был замечен либо с дексаметазоном, либо с кортикостероном, хотя эти разные лиганды по-разному влияли на транскрипцию (см. Ниже). Мы пришли к выводу, что замедление, наблюдаемое после лечения MG-132, не связано с потерей p23.

Влияние лечения гелданамицином на протеасомы или лечения MG-132 на шапероны. (от a до f) Прогрессирующая потеря протеасомы 19S наблюдается на матрице MMTV (обведено кружком) при более длительной обработке гелданамицином (GELD). Четкое протеасомное окрашивание наблюдается через 15 мин обработки гелданамицином (b), тогда как более слабое окрашивание на уровнях, близких к ядерному фону, обнаруживается через 1 час обработки гелданамицином (e). (от g до l) MG-132 не влияет на уровни p23 ни с дексаметазоном (DEX) (от g до i), ни с кортикостероном (CORT) (от j до l).Для каждого лиганда показана только одна временная точка, поскольку, в отличие от обработки гелданамицином, нет потери GFP-GR из массива после ингибирования протеасом. Шкала 5 мкм.

В целом, наши результаты предполагают, что протеасома сама по себе обычно регулирует обмен GFP-GR на сайтах MMTV и отвечает, по крайней мере, за некоторую чувствительность к АТФ на части этих сайтов.

Уровень транскрипции и восстановление GFP-GR. Предыдущие эксперименты продемонстрировали, что нормальное восстановление GFP-GR зависит от энергии и требует функций протеасомы и шаперона.Это показывает, что обмен GFP-GR строго регулируется. Поскольку транскрипция является основной функцией связывания GR с промотором MMTV, мы спросили, существует ли какая-либо связь между транскрипцией и скоростью обмена.

Для начала мы исследовали, коррелирует ли скорость обмена с различными уровнями эндогенной транскрипции. Наши предыдущие исследования показали, что размер массива коррелирует с уровнем транскрипции, измеренным с помощью RNA FISH. Конденсированные массивы менее транскрипционно активны, чем деконденсированные (25) (рис.9а и таблица 1). Поэтому мы выполнили FRAP на конденсированных и деконденсированных массивах и обнаружили, что восстановление на конденсированных массивах было немного, но стабильно, быстрее, чем на деконденсированных массивах (рис. 9b). Хотя эта разница незначительна, эта разница дает очень значимое значение P ( P <0,001), потому что данные настолько хорошо соответствуют эффективной диффузии, что оценка скорости восстановления для каждой кривой имеет очень небольшую ошибку.

Ускоренный обмен GFP-GR связан с меньшей транскрипцией.(а) Примеры конденсированного массива и деконденсированного массива показаны с соответствующими сигналами РНК FISH. (б) FRAP конденсированных массивов последовательно выполнялись быстрее. (c и d) RU486 (100 нМ) и кортикостерон (100 нМ) также давали более быстрые FRAP, чем дексаметазон. Масштабная линейка, 1 мкм.

Изменения в восстановлении GFP-GR в массиве связаны с транскрипцией ^a

Для дальнейшего исследования связи между скоростью обмена и транскрипцией мы измерили FRAP в присутствии антагониста RU486.RU486 снижал транскрипцию в массиве MMTV до 10% от транскрипции с дексаметазоном (таблица 1). Этот пониженный уровень транскрипции с RU486 был связан с более быстрыми FRAP, чем с дексаметазоном (фиг. 9c).

Мы также обнаружили, что для промотора MMTV естественный гормон кортикостерон был менее эффективным агонистом, чем синтетический гормон дексаметазон (таблица 1). Снижение уровней транскрипции с кортикостероном снова было связано с более быстрым обменом GFP-GR в матрице, чем с дексаметазоном (рис.9г).

Таким образом, для чисто эндогенного различия (конденсированные и деконденсированные массивы) или для различий, вызванных агонистами или антагонистами, снижение транскрипционной активности сопровождалось более высокой скоростью обмена GFP-GR.

Затем мы исследовали уровни транскрипции после нарушения функции шаперона. После того, как активность hsp90 блокировалась гелданамицином или радициколом, уровни транскрипции падали на матрице MMTV (таблица 1). Это согласуется с предыдущими исследованиями (2), но в этих исследованиях не было ясно, является ли снижение транскрипции результатом неспособности GR связываться с его сайтами-мишенями или даже проникать в ядро.В наших условиях с гелданамицином GR остается связанным с массивом MMTV в течение 10 минут в кортикостероне и в течение 1 часа в дексаметазоне. Однако в эти периоды времени транскрипция все еще значительно снижается, демонстрируя более тонкий эффект на транскрипцию. Одна из возможностей — более высокий обменный курс, измеренный во всех этих случаях.

Наконец, мы измерили уровни транскрипции после ингибирования протеасом. Здесь мы обнаружили зависимость от лиганда. С дексаметазоном уровни транскрипции повысились, но с кортикостероном они снизились (таблица 1).Deroo et al. (8) обнаружили, что длительное лечение (от 22 до 28 часов) MG-132 увеличивало как уровни GR, так и транскрипцию в присутствии дексаметазона. Однако обнаруженные нами изменения транскрипции не были связаны с изменениями уровней белка GFP-GR, поскольку средняя интенсивность флуоресценции GFP-GR в ядрах, обработанных MG-132 в течение 1 часа (97% ± 11%), существенно не различалась. от интенсивности контрольных ядер (100% ± 8%). Несмотря на различия в транскрипции, FRAPs с дексаметазоном или кортикостероном показали замедление и неподвижную фракцию, что указывает на то, что лиганд может иметь совершенно разные эффекты на транскрипцию, когда часть рецепторов становится иммобилизованной.

В итоге, до сих пор мы видели, что во всех случаях изменения обменного курса связаны с изменениями на уровне транскрипции, что позволяет предположить, что они связаны.

ОБСУЖДЕНИЕ

Мы исследовали быстрый обмен GFP-GR в тандемном массиве промоторных сайтов MMTV и предоставили первое понимание его механизма и функции. Наши результаты показывают, что обмен контролируется, по крайней мере частично, балансом между функциями протеасомы и шаперона. Эти две системы часто действуют согласованно, например, обеспечивая баланс между повторной укладкой и деградацией клеточных белков (45).Наши данные предполагают, что сходное уравновешивающее действие осуществляется на промоторе MMTV, при этом шапероны помогают стабилизировать связывание GR, а протеасомы помогают катализировать удаление GR (рис. 10). Как именно достигается этот баланс, неизвестно, но могут быть задействованы такие факторы, как CHIP и BAG-1, которые, как известно, соединяют шаперонную и протеасомную системы (5, 21).

Модель взаимодействия протеасома-шаперон в матрице MMTV и ассоциации с транскрипцией. Связывание лигандированных GR с MMTV в конечном итоге приводит к образованию комплекса инициации.Формированию комплекса может способствовать более длительное пребывание GR в шаблоне MMTV. Продолжительность занятия GR в шаблоне частично определяется конкуренцией между функциями протеасомы и шаперона. Ингибирование протеасомы способствует занятости GR, что приводит к более медленному FRAP с неподвижной фракцией. Ингибирование шаперона гелданамицином способствует потере GR, что приводит к более быстрой FRAP. Равновесие между этими двумя компонентами помогает установить уровень транскрипции и может частично опосредоваться одним или несколькими факторами, которые, как известно, связывают шаперонную и протеасомную активности (5, 21).

Мы обнаружили, что и шапероны, и протеасомы присутствовали в массиве MMTV и вокруг него, демонстрируя, что оба класса молекул были специфически задействованы в этом сайте. Эти наблюдения согласуются с исследованиями ChIP, демонстрирующими, что либо шапероны (12), либо протеасомы (13, 31) обнаруживаются на сайтах промотора, хотя до сих пор не на одном и том же промоторе.

Функция протеасомы. После нарушения активности протеасомы мы обнаружили, что GFP-GR медленнее восстанавливается на сайтах MMTV и достигает только 95% от своей начальной интенсивности.Остаточные 5% соответствуют неподвижной фракции GFP-GR, которая остается стабильно связанной с промотором после протеасомного ингибирования. Мы пришли к выводу, что удаление по крайней мере части молекул GR обычно требует протеасомы. Поскольку и GR, и различные коактиваторы убиквитинируются (5, 46), потеря GR на промоторе может отражать прямое влияние протеасомы на GR или косвенное последствие потери тесно связанного коактиватора. Наши данные также не различают, включает ли потеря GR обычно деградацию этой 5% фракции GR на промоторе или просто выброс фракции из промотора.Мы не можем исключить возможность того, что обработка протеасом каким-либо иным образом косвенно изменяет подвижность GR, вызывая, например, стрессовую реакцию (40). Однако, используя более короткие процедуры лечения MG-132, которые нарушают преимущественно поведение FRAP в массиве MMTV, мы уменьшаем вероятность того, что наблюдаемые нами эффекты являются неспецифическими. Эта проблема может быть решена более непосредственно в будущих исследованиях путем идентификации и последующего нарушения специфических молекул, которые сочетают активность протеасом с GR.

Известно также, что ингибирование протеасом влияет на ядерную подвижность стероидных рецепторов, индуцируя связывание с ядерным матриксом (8, 34, 43).Однако при более коротких инкубациях с ингибитором протеасомы, который мы использовали, массив MMTV оставался видимым и транскрипция продолжалась, что указывает на то, что GR все еще был связан с ДНК на сайтах MMTV. Наше наблюдение неподвижной фракции в определенных местах после ингибирования дексаметазоном и протеасомами контрастирует с эффектом, обнаруженным для GR в другом месте ядра, где дексаметазон или другие лиганды с высоким сродством ослабляли неподвижную фракцию, вызванную ингибированием протеасом (34). Эти различия показывают, что одна и та же обработка может давать разные эффекты в зависимости от того, является ли сайт связывания специфическим промотором или ядерным матриксом.

Ряд биохимических подходов предполагает роль протеасом в удалении транскрипционного фактора с промоторных сайтов (27). Высокоактивные регуляторы транскрипции, такие как VP16 или myc, должны быть убиквитинированы для индукции транскрипции и после дальнейшего убиквитинирования разрушаются протеасомой (33). Эта деградация может происходить на промоторе, так как она усиливается связыванием ДНК (24). Недавние исследования показали, что медленный цикл ER сопровождается и зависит от цикла протеасомы (31).

Хотя есть интригующее сходство между этими результатами ChIP для ER и нашими данными FRAP для GR, они могут отражать совершенно разные процессы. Это связано с тем, что шкалы времени, исследуемые этими двумя методами, радикально различаются. FRAP GFP-GR на массиве MMTV завершается в течение 1 мин. Таким образом, среднее время пребывания GFP-GR на промоутере может быть не более 1 минуты и вполне может быть намного короче. Такой быстрый обмен не может быть обнаружен с помощью ChIP, поскольку этап фиксации формальдегида в процедуре обычно длится намного дольше (~ 10 мин), чем время цикла GR.Как следствие, ChIP обнаруживает периодичности во временных масштабах на 1-2 порядка больше, чем те, которые обнаруживаются FRAP. Возможно, что гораздо более медленная цикличность GR накладывается на более быструю циклическую смену, которую мы измеряем с помощью FRAP. Доля связанного GR на сайтах MMTV определяется аффинностью связывания GR с этими сайтами. Если это сродство медленно увеличивается, а затем медленно уменьшается, то количество связанного GR будет медленно меняться, даже если отдельные молекулы GR в любой момент будут демонстрировать быстрый обмен, который мы измеряем с помощью FRAP.В принципе, это можно обнаружить в нашей системе живых клеток двумя способами, ни один из которых не был тщательно исследован. Если аффинность связывания GR с MMTV постепенно увеличивается, тогда интенсивность массива должна постепенно увеличиваться, и в то же время скорость FRAP должна постепенно снижаться, поскольку более медленное восстановление отражает связывание с более высокой аффинностью. В общем, одна и та же система может работать как с быстрым, так и с медленным циклом. Быстрые циклы лучше всего обнаруживаются FRAP в целевом массиве промоторов, а медленные циклы лучше наблюдаются с помощью ChIP.

Функция шаперона. Нарушая активность шаперона гелданамицином или радициколом, мы наблюдали ускоренный обмен GFP-GR на сайтах промотора MMTV. Более быстрый обмен GFP-GR был обнаружен мгновенно в присутствии гелданамицина и кортикостерона, что убедительно подтверждает специфический эффект связывания GFP-GR с MMTV.

Нацеливание одного члена шаперонного комплекса, p23, на ряд сайтов промотора GR приводило к потере там связывания GR (12). Основываясь на этом и других наблюдениях, Фриман и Ямамото предположили, что p23 может многократно удалять GR из матрицы и, следовательно, вызывать быстрый процесс обмена GR, наблюдаемый в живых клетках.Однако, если бы это было так, то в простейшем сценарии мы должны были бы наблюдать более медленную FRAP после лечения гелданамицином, поскольку препарат предотвращает связывание p23 с шапероновым комплексом (38). Это, в свою очередь, должно было препятствовать тому, чтобы p23 выбрасывал GR из промотора. Вместо этого мы обнаружили более быстрый обмен GFP-GR, подразумевая, что шапероны обычно стабилизируют связывание GR, а не катализируют его удаление.

Возможен ряд объяснений этого несоответствия. Ключевое различие между двумя исследованиями заключается в том, что мы нарушили функцию hsp90, тогда как Фриман и Ямамото изменили активность p23.Хотя p23 и hsp90 обычно действуют согласованно внутри комплекса шаперонов, они не могут действовать вместе в промоторе. Если это так, то лечение гелданамицином будет напрямую влиять на hsp90, но не на p23. Затем наши данные FRAP в присутствии гелданамицина означают, что hsp90 необходим для стабилизации связывания GR на промоторе, тогда как данные ChIP Фримена и Ямамото предполагают, что p23 необходим для его дестабилизации. Такие антагонистические действия между hsp90 и p23 могут играть роль в установлении времен резидентности GR.В более общем плане должен существовать тонкий баланс между функциями шаперона и протеасомы в промоторе MMTV. Таким образом, даже если лечение гелданамицином также нарушает функцию p23 в MMTV, возможно, что конкретный метод, используемый для изменения активности p23, может изменить равновесие между шаперонами и протеасомами в ту или иную сторону, что приведет к противоположным эффектам на связывание GR. Эти несоответствия, вероятно, будут устранены путем выяснения молекулярного механизма, который устанавливает взаимодействие между шаперонами и протеасомами на промоторе MMTV.В настоящее время мы можем с уверенностью сказать, что как наши результаты, так и результаты Фримена и Ямамото строго подтверждают роль шаперонов в связывании GR на промоторе.

Функция быстрого обмена. Было высказано предположение, что цикл фактора транскрипции на промоторе является механизмом определения изменений окружающей среды, например, концентрации лиганда (12, 22, 31, 37). Через 5 минут после удаления кортикостерона мы обнаружили, что транскрипция с промотора MMTV практически прекратилась. Это согласуется с моделью восприятия для обмена, поскольку время цикла GR ~ 1 мин достаточно быстро, чтобы показать ответ в течение 5 минут после падения концентрации гормона.Обратите внимание, однако, что такое быстрое изменение уровней гормонов может быть обнаружено только с помощью механизма быстрого обмена, а не по более длительному времени цикла, наблюдаемому для ER с помощью ChIP (31, 37).

Помимо возможной роли в обнаружении измененных уровней гормонов, мы обнаружили связь между уровнем транскрипции и скоростью обмена. Во всех изученных до сих пор случаях, когда менялись уровни транскрипции, менялся и обменный курс. В настоящее время наши данные подтверждают простую форму связывания, а именно, что более медленный обмен связан с большей транскрипцией.Это могло произойти, потому что более длительное время пребывания GR может увеличить шансы на успешную загрузку полимеразы. Мы наблюдали эту корреляцию между скоростью обмена и уровнем транскрипции в семи из восьми двусторонних сравнений (таблица 1).

Единственным исключением были ингибитор протеасом MG-132 и лиганд кортикостерон. Эта комбинация приводила к более медленному обмену и снижению транскрипции, тогда как MG-132 и дексаметазон приводили к более медленному обмену и повышенной транскрипции.Одним из объяснений этого несоответствия является врожденная разница между временем пребывания лиганда, связывающегося с GR с дексаметазоном и кортикостероном. После ингибирования протеасомы MG-132 часть GR остается на матрице.