Как оформить выписку из протокола образец: срок действия, образец, как выглядит

Как оформить выписку из протокола образец: срок действия, образец, как выглядит

Содержание

срок действия, образец, как выглядит

С помощью протокола документируют происходящее на собрании или заседании. В организации, созданной на основе членства участников — физических и юридических лиц — коллегиальные решения обязательны для исполнения. Собрание как высший орган управления существует в коммерческих (ООО, АО, ПАО) и некоммерческих (педсовет, профсоюз, садовое товарищество, родительский комитет, ТСЖ и др.) учреждений. Протокол может содержать несколько листов текста. Если необходимо донести какое-либо из принятых решение до заинтересованной стороны, используют выписки из него.

И сегодня мы узнаем, какова форма выписки из протокола, как проходит ее оформление, и что для этого потребуется.

Общая информация

Понятие и особенности выписки из протокола

Выписка из протокола — копия его отдельных частей, сформированная и заверенная установленный образом. В законодательстве нет особых норм, регулирующих порядок составления выписки. Часто правила по подготовке, оформлению и заверению документа содержатся в локальных нормах — принятых в организации инструкциях по делопроизводству.

Если таких нет, руководствуются:

  • ГОСТ Р 7.08-2013. В нем есть определение понятия «выписка из документа», которое применяется в отношении выписки из протокола;
  • ГОСТ Р 6.30-2003. Включает правила оформления документов, в том числе порядок заверения, внесения реквизитов;
  • действующим до сих пор Указом Президиума ВС РФ СССР № 9779-X от 04.08.1983. Он определяет, что выписка из документов (в т. ч. протоколов) должна выдаваться по требованию любого гражданина или организации, чьи права затронуты обозначенными там решениями;
  • нормами, регулирующими деятельность разных юридических лиц. В отношении ООО к таким относится, например, ФЗ № 14 от 08.02.1998 г.

Заполнение документа

ГОСТом рекомендовано делать выписку на фирменном бланке организации. Она состоит из нескольких частей:

  • вводной (наименование, дату и место проведения собрания, список присутствующих с распределением по ролям, отметку о кворуме). Воспроизводится в соответствии с протоколом;
  • основной — нужные абзацы из повестки дня, разделы «СЛУШАЛИ», «ВЫСТУПИЛИ»;
  • результирующей части (решение) из раздела «ПОСТАНОВИЛИ»;
  • блок «Подписи»: перечень участников, подписавших протокол, их ФИО.

В конце синей шариковой или гелиевой ручкой проставляется заверение.

Выписка из протокола общего собрания трудового коллектива о награждении (ее образец) доступен для просмотра ниже, скачать его можно здесь.

Выписка из протокола общего собрания трудового коллектива о награждении

Выписка из протокола трудового коллектива о награждении — 1 Выписка из протокола трудового коллектива о награждении — 2

Скачать выписку из протокола педагогического совета (ее образец) можно здесь.

Выписка из протокола педсовета (образец)

Выписка из протокола профсоюзного собрания также доступна для скачивания.

Выписка из протокола профсоюзного собрания (образец)

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии также доступна для скачивания.

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии — 1 Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии — 2

Функции

Выписка необходима для предоставления заинтересованным сторонам, контрагентам, государственным структурам. Чаще всего ее оформляют в двух случаях:

  • в протоколе содержится информация, представляющая коммерческую или личную тайну;
  • полный текст протокола слишком большой.

Выписки, посвященные какому-либо решению, могут рассылаться заинтересованным сторонам (работникам, филиалам организации). Часто таким образом руководство доносит предписания и приказы до исполнителей.

О том, как оформить выписку из протокола, читайте ниже.

Порядок получения документа

Составление

Протокол подшивается в тетрадь и хранится в архиве организации. Выписки из него готовит секретарь по запросу заинтересованного лица, он же чаще всего ее заверяет (если в уставе не определено иное).

Как правильно составить выписку:

  • Вводная часть воспроизводится, как в протоколе. Проставляется дата, место, наименование документа («Выписка из протокола общего собрания ООО «Цветочек» № XX»). Указываются председатель, секретарь, присутствующие на заседании участники. Особо отмечается, есть ли кворум.
  • Основная часть включает цитату из повестки дня с указанием порядкового номера в очереди вопросов. Далее иду разделы «СЛУШАЛИ» (ФИО докладчика), «ВЫСТУПАЛИ» (имена тех, кто высказывался по вопросу).
  • Резолютивная часть — принятое решение («ПОСТАНОВИЛИ»).
  • Перечень участников, подписавших протокол, без проставления реальных автографов (необходимо заменить на слова «Личная подпись»), напротив — их ФИО.

Заверение

Заверение необходимо для того, чтобы выписка получила юридическую значимость. Оно оформляется согласно ГОСТ Р 6.30-2003. Секретарь или иное должностное лицо, уполномоченное подписывать документы, вносит:

  • слово «Верно»;
  • должность составителя;
  • подпись и расшифровку;
  • дату составления и заверения;
  • пометку, где находится оригинал протокола.

Если выписка предназначена для предоставления в стороннюю организацию, проставляют печать. Ее нужно ставить так, чтобы частично покрывать должность и роспись составителя.

Выписку готовят как в отношении одного вопроса, так и нескольких. Она бесплатна; срок изготовления зависит от того, кто заверяет документ. В некоторых организациях принципы ведения делопроизводства определены в локальных инструкциях. Иногда лица, имеющие право заверения, прописаны в уставе. Ими могут быть генеральный директор, руководитель подразделения, председатель правления.

Важная информация

  1. Есть ли разница между выписками из протокола собраний коммерческой или некоммерческой организации (педсовета, СНТ)? Выписки из протокола составляются унифицированным образом. Разница может заключаться в специфике самого протокола. Например, если уставом определено правило ведения подробного документирования, помимо основных разделов могут быть приведено обсуждение вопроса: реплики, особые мнения, ход голосования.
    На оперативных или внеплановых собраниях ведут краткий протокол, поэтому выписка может не содержать раздел «ВЫСТУПИЛИ», а только «СЛУШАЛИ» и принятое решение.
  2. Нужно ли заверять выписку у нотариуса? Практика показывает, что финансовые и государственные структуры (налоговая и ПФР) часто требуют нотариального заверения выписок по примеру протоколов. Согласно ФЗ № 14, документирование хода собрания ООО должно быть удостоверено присутствующим на нем нотариусом, если в уставе не прописан иной порядок. Обязательно заверение протокола, если решения касаются финансовых вопросов деятельности ЮЛ или смена руководства. Не каждый нотариус готов заверить выписку, если он не следил за ходом заседания. Те, кто соглашаются, требуют оригинал протокола, в котором удостоверены подписи участников. Даже если в уставе прописан договорной порядок принятия решений, при обсуждении важных вопросов рекомендуется приглашать нотариуса. В спорных ситуациях можно сослаться на устав, в котором прописано проведение собраний без юриста, и определено должностное лицо, имеющее право заверять документы.

срок действия, образец, как выглядит в 2019

С помощью протокола документируют происходящее на собрании или заседании. В организации, созданной на основе членства участников — физических и юридических лиц — коллегиальные решения обязательны для исполнения. Собрание как высший орган управления существует в коммерческих (ООО, АО, ПАО) и некоммерческих (педсовет, профсоюз, садовое товарищество, родительский комитет, ТСЖ и др.) учреждений. Протокол может содержать несколько листов текста. Если необходимо донести какое-либо из принятых решение до заинтересованной стороны, используют выписки из него.

И сегодня мы узнаем, какова форма выписки из протокола, как проходит ее оформление, и что для этого потребуется.

После прочтения статьи у вас остались вопросы? Задайте вопрос прямо сейчас через форму (внизу), и в течение часа профильный специалист перезвонит вам, чтобы оказать бесплатную консультацию.

Общая информация

Понятие и особенности выписки из протокола

Выписка из протокола — копия его отдельных частей, сформированная и заверенная установленный образом. В законодательстве нет особых норм, регулирующих порядок составления выписки. Часто правила по подготовке, оформлению и заверению документа содержатся в локальных нормах — принятых в организации инструкциях по делопроизводству. Если таких нет, руководствуются:

  • ГОСТ Р 7.08-2013. В нем есть определение понятия «выписка из документа», которое применяется в отношении выписки из протокола;
  • ГОСТ Р 6.30-2003. Включает правила оформления документов, в том числе порядок заверения, внесения реквизитов;
  • действующим до сих пор Указом Президиума ВС РФ СССР № 9779-X от 04.08.1983. Он определяет, что выписка из документов (в т. ч. протоколов) должна выдаваться по требованию любого гражданина или организации, чьи права затронуты обозначенными там решениями;
  • нормами, регулирующими деятельность разных юридических лиц. В отношении ООО к таким относится, например, ФЗ № 14 от 08.02.1998 г.

Заполнение документа

ГОСТом рекомендовано делать выписку на фирменном бланке организации. Она состоит из нескольких частей:

  • вводной (наименование, дату и место проведения собрания, список присутствующих с распределением по ролям, отметку о кворуме). Воспроизводится в соответствии с протоколом;
  • основной — нужные абзацы из повестки дня, разделы «СЛУШАЛИ», «ВЫСТУПИЛИ»;
  • результирующей части (решение) из раздела «ПОСТАНОВИЛИ»;
  • блок «Подписи»: перечень участников, подписавших протокол, их ФИО.

В конце синей шариковой или гелиевой ручкой проставляется заверение.

Выписка из протокола общего собрания трудового коллектива о награждении (ее образец) доступен для просмотра ниже, скачать его можно здесь.

Выписка из протокола общего собрания трудового коллектива о награждении

Выписка из протокола трудового коллектива о награждении — 1 Выписка из протокола трудового коллектива о награждении — 2

Скачать выписку из протокола педагогического совета (ее образец) можно здесь.

Выписка из протокола педсовета (образец)

Выписка из протокола профсоюзного собрания также доступна для скачивания.

Выписка из протокола профсоюзного собрания (образец)

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии также доступна для скачивания.

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии — 1 Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии — 2

Функции

Выписка необходима для предоставления заинтересованным сторонам, контрагентам, государственным структурам. Чаще всего ее оформляют в двух случаях:

  • в протоколе содержится информация, представляющая коммерческую или личную тайну;
  • полный текст протокола слишком большой.

Выписки, посвященные какому-либо решению, могут рассылаться заинтересованным сторонам (работникам, филиалам организации). Часто таким образом руководство доносит предписания и приказы до исполнителей.

О том, как оформить выписку из протокола, читайте ниже.

Не обязятельно искать ответ на свой вопрос в этой длинной статье! Напишите свой вопрос через форму (внизу), и наш юрист перезвонит вам в течение 5 минут, бесплатно проконсультирует.

Порядок получения документа в 2019

Составление

Протокол подшивается в тетрадь и хранится в архиве организации. Выписки из него готовит секретарь по запросу заинтересованного лица, он же чаще всего ее заверяет (если в уставе не определено иное).

Как правильно составить выписку:

  • Вводная часть воспроизводится, как в протоколе. Проставляется дата, место, наименование документа («Выписка из протокола общего собрания ООО «Цветочек» № XX»). Указываются председатель, секретарь, присутствующие на заседании участники. Особо отмечается, есть ли кворум.
  • Основная часть включает цитату из повестки дня с указанием порядкового номера в очереди вопросов. Далее иду разделы «СЛУШАЛИ» (ФИО докладчика), «ВЫСТУПАЛИ» (имена тех, кто высказывался по вопросу).
  • Резолютивная часть — принятое решение («ПОСТАНОВИЛИ»).
  • Перечень участников, подписавших протокол, без проставления реальных автографов (необходимо заменить на слова «Личная подпись»), напротив — их ФИО.

Заверение

Заверение необходимо для того, чтобы выписка получила юридическую значимость. Оно оформляется согласно ГОСТ Р 6.30-2003. Секретарь или иное должностное лицо, уполномоченное подписывать документы, вносит:

  • слово «Верно»;
  • должность составителя;
  • подпись и расшифровку;
  • дату составления и заверения;
  • пометку, где находится оригинал протокола.

Если выписка предназначена для предоставления в стороннюю организацию, проставляют печать. Ее нужно ставить так, чтобы частично покрывать должность и роспись составителя.

Выписку готовят как в отношении одного вопроса, так и нескольких. Она бесплатна; срок изготовления зависит от того, кто заверяет документ. В некоторых организациях принципы ведения делопроизводства определены в локальных инструкциях. Иногда лица, имеющие право заверения, прописаны в уставе. Ими могут быть генеральный директор, руководитель подразделения, председатель правления.

Узнайте, как решить именно вашу проблему. Напишите свой вопрос через форму (внизу), и один из наших юристов перезвонит вам, чтобы оказать бесплатную консультацию.

Важная информация в 2019

  1. Есть ли разница между выписками из протокола собраний коммерческой или некоммерческой организации (педсовета, СНТ)? Выписки из протокола составляются унифицированным образом. Разница может заключаться в специфике самого протокола. Например, если уставом определено правило ведения подробного документирования, помимо основных разделов могут быть приведено обсуждение вопроса: реплики, особые мнения, ход голосования. На оперативных или внеплановых собраниях ведут краткий протокол, поэтому выписка может не содержать раздел «ВЫСТУПИЛИ», а только «СЛУШАЛИ» и принятое решение.
  2. Нужно ли заверять выписку у нотариуса? Практика показывает, что финансовые и государственные структуры (налоговая и ПФР) часто требуют нотариального заверения выписок по примеру протоколов. Согласно ФЗ № 14, документирование хода собрания ООО должно быть удостоверено присутствующим на нем нотариусом, если в уставе не прописан иной порядок. Обязательно заверение протокола, если решения касаются финансовых вопросов деятельности ЮЛ или смена руководства. Не каждый нотариус готов заверить выписку, если он не следил за ходом заседания. Те, кто соглашаются, требуют оригинал протокола, в котором удостоверены подписи участников. Даже если в уставе прописан договорной порядок принятия решений, при обсуждении важных вопросов рекомендуется приглашать нотариуса. В спорных ситуациях можно сослаться на устав, в котором прописано проведение собраний без юриста, и определено должностное лицо, имеющее право заверять документы.

Выписка из протокола общего собрания, выписка из протокола образец, выписка из протокола собрания, Вопросы и ответы

___________________________________________________________________________________________________________________________________________

 

ВЫПИСКА ИЗ ПРОТОКОЛА ОБРАЗЕЦ 

 

                             ОБРАЗЕЦ

     Выписки из протокола заседания Консультационного совета

    по промышленно-производственным особым экономическим зонам

                 от "__" ________ 20__ г. № _____

Место проведения заседания _______________________________________

                                                                  (почтовый адрес)

Присутствовали:

Члены Консультационного совета __________________________________;

                                                                      (фамилия, инициалы)

                               __________________________________.

                                  (фамилия, инициалы, должность

                                    и место работы других лиц)

Повестка дня:

__________________________________    ___________________________.

    (тема доклада/выступления)            (фамилия, инициалы)

Консультационный   совет  по  промышленно-производственным  особым

экономическим   зонам,   действующий   на  основании  Положения  о

Консультационном  совете  по  промышленно-производственным  особым

экономическим   зонам,  утвержденного  Приказом  Минэкономразвития

России  от  26  июня  2006  г.   № 161,  на своем заседании провел

экспертную      оценку          бизнес-плана               проекта

__________________________________________________________________

                  (полное наименование проекта)

_________________________________________________________________,

представленного __________________________________________________

                  (полное наименование коммерческой организации)

для         заключения         соглашения         о        ведении

промышленно-производственной  деятельности  в особой экономической

зоне     промышленно-производственного    типа    на    территории

______________________________________________________________, на

        (наименование субъекта РФ, области, города)

соответствие критериям, установленным Министерством экономического

развития  и торговли Российской Федерации (Приказ от 23 марта 2006

г. № 75), и условиям заявки (от 2 июня 2006 г.),

    считает, что _________________________________________________

__________________________________________________________________

    (заключение относительно соответствия бизнес-плана проекта

__________________________________________________________________

            установленным критериям и условиям заявки)

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

    Итоговая  оценка представленного бизнес-плана - __ балл(а/ов).

    Исходя из вышеизложенного,  комиссия Консультационного  совета

рекомендует _____________________________________________________.

                (поддержать/отказать в поддержке бизнес-плана)

    Данное решение принято _______________________________________

                             (единогласно/большинством голосов)

_________________________________________________________________.

Должность ответственного лица    _________     ____________

                                                  Ф.И.О.

Ответственный секретарь          _________     ____________

                                                  Ф.И.О.

 

Образец оформления выписки из протокола заседания кафедры

 

БАШКИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ (филиал) УралГУФК

Кафедра теории и методики зрелищных видов спорта и восточных единоборств

ВЫПИСКА ИЗ ПРОТОКОЛА ЗАСЕДАНИЯ КАФЕДРЫ ТЕОРИИ И МЕТОДИКИ ЗРЕЛИЩНЫХ ВИДОВ СПОРТА, И ВОСТОЧНЫХ ЕДИНОБОРСТВ ОТ 15. 01.2012. N7

 

ПРИСУСТВОВАЛИ: зав. каф. ТиМ ЗВС и восточных ед-в, к.п.н., доцент А.С. Мавлеткулова, доцент кафедры, к.п.н. В.А. Абрамов, доцент кафедры, к.б.н. Л.Р. Шафикова, ст. преподаватель каф. Е.Р. Муфтиева, ст. преподаватель каф. М.В. Тарасова, преподаватель каф. А.В. Абдуллина, преподаватель каф. А.Х. Гайсина, преподаватель каф. О.М. Тимербаев.

СЛУШАЛИ: Тарасову М.В., которая представила на обсуждение учебное пособие «Шейпинг» для студентов 1 курса очного и 5 курса заочного обучения, обучающихся по специальности 032102 «Физическая культура для лиц с отклонениями в состоянии здоровья».

ВЫСТУПИЛИ: Мавлеткулова А.С. зав. каф. ТиМ ЗВС и восточных ед-в, к.п.н., доцент.

  • Каким образом в учебном пособии отражена специфика занятий для лиц с отклонениями в состоянии здоровья?

Шафикова Л.Р. к.б.н., доцент.

  • Присутствуют ли в учебном пособии вопросы для самоконтроля?

Заслушали вопросы по содержанию пособия, получили четкие ответы.

РЕШИЛИ:

  1. Учебное пособие рекомендовано для студентов 1 курса очного и 5 курса заочного обучений по специальности 032102 «Физическая культура для лиц с отклонениями в состоянии здоровья. (читательский адрес).
  1. Учебное пособие соответствует программе дисциплин «шейпинг».

ПОСТАНОВИЛИ: Ходатайствовать перед Экспертным советом о рассмотрении учебного пособия Тарасовой М.В. и утверждении его к печати.

  

Зав. каф. Т и М ЗВС и вост.ед-в: к.п.н., доцент

А.С. Мавлеткулова

Секретарь

Е.Г. Огуречникова

Выписка из протокола общего собрания образец 2021

Общее собрание – это инструмент решения вопросов различных сообществ, предприятий и организаций. Согласно уставу сообщества, подобная форма является высшим органом управления, то есть может влиять на совместную деятельность. Список рассматриваемых вопросов и принятие решений зависит от полномочий заседающих лиц. Обычно проведение собраний актуально для следующих структур:

  • ТСЖ, СНТ, ЖСК;
    ООО, АОО;
    некоммерческие союзы и партнерства.

Процедура созыва и проведения общего собрания должна соответствовать действующим нормам законодательства и уставу организации. Инициаторы проведения — это, как правило, группа участников (их количество определяется в процентном соотношении к общему числу членов сообщества и закрепляется приказом), либо исполнительный орган, избранный на учредительном собрании.
Организация мероприятия предполагает заблаговременное уведомление о дате и месте его проведения. Поскольку вопросы решаются голосованием, важно наличие кворума, поэтому в таких случаях проводится процедура регистрации. В этом случае составляется список участников, которые должны предъявить документ, удостоверяющий личность, и поставить подпись напротив своей фамилии.

Скачать выписка из протокола общего собрания — образец 2021 в doc

Скачать выписка из протокола общего собрания — образец 2021 в docx

Скачать выписка из протокола общего собрания — образец 2021 в pdf

Что такое протокол мероприятия

В начале заседания необходимо выбрать председателя и секретаря, на которого возлагается ответственность за ведение протокола. Назначение документа – отражение хода собрания с фиксацией всего происходящего. Если у выбранного секретаря нет опыта проведения подобных мероприятий, он может использовать образец выписки из протокола общего собрания, разработанный инициативной группой, или воспользоваться бланком, доступным на различных онлайн-ресурсах.

Протокол содержит вводную часть с общими сведениями, и основную часть. Последняя пошагово фиксирует ход мероприятия: выступления, прения по повестке дня, результаты голосования и итоговые решения по каждому вопросу. Допускается составление краткого варианта протокола, содержащего только пункт повестки дня и решение, принятое по нему. На создание окончательного варианта протокола дается 3-5 дней.

В каких случаях нужна выписка

Решения на общих советах обычно принимаются путем определения простого большинства голосов. При этом рассматриваются такие важные вопросы, как:

  • создание или ликвидация ООО;
  • реорганизация структуры;
  • утверждение уставных документов;
  • внесение изменений в устав;
  • прием новых членов;
  • образование и выборы исполнительных и управленческих структур;
  • утверждение отчетной документации за год;
  • назначение комиссий, проверок финансово-экономической деятельности, и т. п.

Вполне естественно, что значимость решений сказывается и на требованиях, предъявляемых к документированию процесса их принятия. При этом дело касается не только основной отчетности, но и выписки из протокола, образец которой должен использоваться для корректного оформления бумаг. Зачастую они становятся базовыми элементами в дальнейшем развитии сообщества.

Как оформить выписку из протокола

Выписка – это полная копия части протокола, касающейся определенного вопроса или части повестки дня. Перед тем, как оформить выписку из протокола, образец следует изучить и внести в него коррективы, адаптировав к условиям работы конкретной структуры. Органы управления обязаны оформить и передать документ не позднее семи дней с момента получения запроса, который может подать любой член сообщества или его доверенное лицо. Это не ксерокопия, а отдельный документ, составленный так же, как и сам протокол: в нем присутствуют те же реквизиты.
Выписка из протокола заверяется руководителем структуры, секретарем заседания и скрепляется печатью, оригиналы документов хранятся в администрации учреждения.

Образцы

Изучая образцы выписок различных структур, не сложно создать шаблон документа, вводная часть которого выглядит следующим образом.

  1. Название («Выписка из протокола»).
  2. Номер, время и дата проведения общего собрания.
  3. Список участников заседания (ФИО и личная подпись).
  4. Пункты повестки дня.
  5. Тексты выступлений, прений, результаты голосования и принятые решения.
  6. Подписи (председательствующего и секретаря).
  7. Отметка о документах, присовокупленных к выписке в качестве приложений.

Требования к публикации протокола регламентированы сроками, которые зависят от формы организации – ООО, ОАО, ТСЖ и пр. Нарушения в этой части влекут за собой составление акта и административную ответственность лиц, ответственных за работу с документацией. Огласка содержания документа не является поводом отказать члену трудового коллектива или сообщества в выдаче выписки из протокола.

Скачать выписка из протокола общего собрания — образец 2021 в doc

Скачать выписка из протокола общего собрания — образец 2021 в docx

Скачать выписка из протокола общего собрания — образец 2021 в pdf

Протокол заседания трудового коллектива | Образец - бланк - форма

Протокол заседания трудового коллектива - это это из видов организационно-распорядительных документов, отражающий информацию о ходе обсуждения каких-то управленческих вопросов, фиксирующий ход обсуждения вопросов и принятия решений на заседаниях. Содержат постановляющую часть, используется для документирования постоянных заседаний.

Протокол заседания трудового коллектива обязательно должен включать в себя: наименование учреждения (организации предприятия), вид документа (протокол), места для проставления индекса документа, даты, места составления протокола (географический пункт), заголовка к тексту. Таким образом, заголовок имеет вид:

Общество с ограниченной ответственностью “________________”
П Р О Т О К О Л
заседания трудового коллектива
07.02.2011 ________________________________________________ № 1
Москва

Также в вводной части протокола после заголовка указываются фамилии и инициалы председателя и секретаря заседания, наименование должности можно не указывать.

Далее с новой строки печатают слово “Присутствовали:” и перечисляют в алфавитном порядке фамилии и инициалы постоянных участников заседания, членов комиссии и других сотрудников данной организации (структурного подразделения) без указания должностей. Если на заседании присутствуют должностные лица из сторонних организаций, в протоколе с новой строки печатают слово “Приглашенные:”, а также фамилии, инициалы и должности с указанием организации приглашенных на заседание.

При оформлении протокола расширенного заседания фамилии участников не перечисляются, а указывается цифрой их общее количество.

Протокол оформляется на основе записей, которые велись на заседании секретарем или специально выбранным или назначенным лицом, выполняющим его функции, вручную или с использованием диктофона. Секретарь заседания должен использовать документы, возникшие в ходе его подготовки, – повестку дня, списки участников, тексты докладов или выступлений, проекты решений.

Датой протокола является дата заседания! Если заседание трудового коллектива продолжалось несколько дней, то дата протокола включает даты начала и окончания, например: 21–24.09.2000 или 21–24 сентября 2000 г. Номером (регистрационным индексом) протокола является порядковый номер заседания. Нумерация протоколов ведется в пределах календарного года или срока полномочий коллегиального органа.

Следующим абзацем указывается перечень вопросов, подлежащих обсуждению. Он начинается словами “Повестка дня”. Повестка дня содержит перечисление вопросов, которые обсуждаются на заседании, и фиксирует последовательность их обсуждения и фамилии выступающих (докладчиков).

Повестка дня заседания трудового коллектива, как правило, составляется заранее и должна включать в себя оптимальное количество вопросов, которые можно рассмотреть и обсудить на заседании. Правильно составленная повестка дня позволяет грамотно спланировать проведение совещания, добиться наибольшей эффективности от этого вида деятельности. Включение в повестку дня нескольких крупных вопросов (или большого количества мелких) приводит к затягиванию совещания, потерям времени его участников, снижению качества принимаемых решений. Исходя из этого не рекомендуется включать в повестку дня пункт “Разное”, обсуждение которого может требовать значительного времени.

Основная часть протокола заседания состоит из нескольких разделов, каждый из которых относится к соответствующему пункту повестки дня. Каждый раздел состоит из трех частей: “СЛУШАЛИ”, “ВЫСТУПИЛИ”, “ПОСТАНОВИЛИ” ( или “РЕШИЛИ”), в каждой из этих частей выделяют запись речи основного докладчика, участников обсуждения вопроса и постановляющую часть, формулирующую решение собрания. Каждую фамилию и инициалы выступающего печатают с новой строки с абзаца в именительном падеже. Вопросы к докладчику или выступающим вносятся в протокол в порядке их поступления, каждый вопрос печатается с красной строки. Фамилии при этом допускается не указывать.

Решения, выработанные на совещании, вносят в протокол после слова “ПОСТАНОВИЛИ” ( или “РЕШИЛИ”). Решение принимается коллегиально, что зачастую предполагает голосование участников. Однако в управленческой практике результаты голосования в протоколах обычно не отражают. Если же такая необходимость возникает, то результаты голосования указываются отдельно по каждому пункту решения. Например, “Единогласно” или “За – 14, против – 1, воздержались – 3”.

Протокол оформляет секретарь заседания, перепечатывая текст, редактируя его и согласовывая с председателем совещания или руководителем структурного подразделения. Юридическую силу протокол приобретает только при наличии двух подписей – председателя и секретаря.

Подписывается первый экземпляр протокола, который подшивается секретарем в дело и хранится в соответствии со сроком, определенным номенклатурой дел. Однако нередко возникают случаи, когда работнику необходимо представить в другую организацию (или структурное подразделение) принятое решение. В таком случае оформляется выписка из протокола.

Выписка из протокола представляет собой точную копию части текста подлинного протокола, относящегося к тому вопросу повестки дня, по которому готовят выписку. При этом воспроизводят все реквизиты бланка, вводную часть текста, вопрос повестки дня, по которому готовится выписка, и текст, отражающий обсуждение вопроса и принятое решение. Заголовок имеет вид:

Общество с ограниченной ответственностью “_______________ ”
В Ы П И С К А  И З  П Р О Т О К О Л А
заседания трудового коллектива
07.02.2011 ________________________________________________ № 1
Москва

Выписку из протокола подписывает только секретарь, он же составляет заверительную надпись. Она состоит из слова “Верно”, указания должности лица, заверяющего копию (выписку), личной подписи, фамилии, инициалов и даты. Если выписка дается для представления в другую организацию, то она заверяется печатью.

Документы ТСЖ - Выписка из протокола общего собрания собственников помещений

Требования к оформлению выписки из протоколов общих собраний собственников помещений в многоквартирных домах

Зарегистрировано в Минюсте России 14 апреля 2016 г. N 41802

МИНИСТЕРСТВО СТРОИТЕЛЬСТВА И ЖИЛИЩНО-КОММУНАЛЬНОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРИКАЗ

от 25 декабря 2015 г. N 937/пр

ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ТРЕБОВАНИЙ К ОФОРМЛЕНИЮ ПРОТОКОЛОВ ОБЩИХ СОБРАНИЙ СОБСТВЕННИКОВ ПОМЕЩЕНИЙ В МНОГОКВАРТИРНЫХ ДОМАХ И ПОРЯДКА ПЕРЕДАЧИ КОПИЙ РЕШЕНИЙ И ПРОТОКОЛОВ ОБЩИХ СОБРАНИЙ СОБСТВЕННИКОВ ПОМЕЩЕНИЙ В МНОГОКВАРТИРНЫХ ДОМАХ В УПОЛНОМОЧЕННЫЕ ОРГАНЫ ИСПОЛНИТЕЛЬНОЙ ВЛАСТИ СУБЪЕКТОВ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЕ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЖИЛИЩНЫЙ НАДЗОР

В соответствии с "частями 1", "1.1 статьи 46" Жилищного кодекса Российской Федерации (Собрание законодательства Российской Федерации, 2005, N 1, ст. 14; 2009, N 39, ст. 4542; 2015, N 27, ст. 3967, N 48, ст. 6724) приказываю:

1. Утвердить:

а) "Требования" к оформлению протоколов общих собраний собственников помещений в многоквартирных домах согласно Приложению N 1 к настоящему приказу;

б) "Порядок" передачи копий решений и протоколов общих собраний собственников помещений в многоквартирных домах в уполномоченные органы исполнительной власти субъектов Российской Федерации, осуществляющие государственный жилищный надзор, согласно Приложению N 2 к настоящему приказу.

2. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на заместителя Министра строительства и жилищно-коммунального хозяйства Российской Федерации А.В. Чибиса.

Министр

М.А.МЕНЬ

Приложение N 2

к приказу Министерства строительства и жилищно-коммунального хозяйства Российской Федерации

от 25 декабря 2015 г. N 937/пр

ПОРЯДОК ПЕРЕДАЧИ КОПИЙ РЕШЕНИЙ И ПРОТОКОЛОВ ОБЩИХ СОБРАНИЙ СОБСТВЕННИКОВ ПОМЕЩЕНИЙ В МНОГОКВАРТИРНЫХ ДОМАХ В УПОЛНОМОЧЕННЫЕ ОРГАНЫ ИСПОЛНИТЕЛЬНОЙ ВЛАСТИ СУБЪЕКТОВ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЕ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЖИЛИЩНЫЙ НАДЗОР

1. Настоящий Порядок устанавливает требования к осуществлению передачи копий решений и протоколов общих собраний собственников помещений в многоквартирных домах в уполномоченные органы исполнительной власти субъектов Российской Федерации, осуществляющие государственный жилищный надзор (далее - органы государственного жилищного надзора).

2. Управляющая организация, правление товарищества собственников жилья, жилищного или жилищно-строительного кооператива, иного специализированного потребительского кооператива обязаны направить копии решений и протоколов общего собрания собственников помещений, представленных им в соответствии с "частью 1 статьи 46" Жилищного кодекса Российской Федерации (Собрание законодательства Российской Федерации, 2005, N 1, ст. 14; 2009, N 39, ст. 4542; 2015, N 27, ст. 3967, N 48, ст. 6724) лицом, инициировавшим общее собрание собственников помещений в многоквартирном доме (далее - копии решений, протокола), в орган государственного жилищного надзора субъекта Российской Федерации, на территории которого находится многоквартирный дом, собственники помещений в котором проводили общее собрание.

3. Передача копий решений, протокола осуществляется в течение пяти дней с момента получения управляющей организацией, правлением товарищества собственников жилья, жилищного или жилищно-строительного кооператива, иного специализированного потребительского кооператива от лица, инициировавшего общее собрание собственников помещений в многоквартирном доме, данных копий.

Передача копий решений, протокола должна осуществляться способами, позволяющими подтвердить факт и дату ее получения органом государственного жилищного надзора, а также путем размещения в государственной информационной системе жилищно-коммунального хозяйства (далее - система) электронных образов решений, протокола в электронной форме.

4. Копии решений, протокола считаются переданными в случае, когда электронный образ решений, протокола находится в открытом доступе и доступен для обозрения в системе, а также при передаче копий решений, протокола иным способом, кроме размещения в системе, - в случае наличия у управляющей организации, правления товарищества собственников жилья, жилищного или жилищно-строительного кооператива, иного специализированного потребительского кооператива документа, подтверждающего факт и дату их передачи в орган государственного жилищного надзора.

Образец выписки из протокола общего собрания собственников жилья

ВЫПИСКА ИЗ ПРОТОКОЛА №___ от ___________

общего собрания собственников помещений в доме

г. __________

«__» _________ 200_ г.

ул. ______________, д. ____

__чч:_мин – _чч:_мин

Зарегистрировано _______ бюллетеней заочного голосования

Признано недействительными ___________ бюллетеней (полностью или в части)

Представлено ____% голосов

Общее собрание правомочно принимать решения по повестке дня.

Общее собрание собственников помещений проводится в форме заочного голосования.

Общее собрание собственников помещений в доме созвано по инициативе _______________________.

_____________________________________________ _________________________________
Председатель собрания /Ф.И.О. полностью/ /адрес места жительства/

_____________________________________________ _________________________________
Секретарь /Ф.И.О. полностью/ /адрес места жительства/

Повестка дня:

7. Создание товарищества собственников жилья ________________________________
(наименование, улица и № дома(ов)
8. Утверждение Устава товарищества собственников жилья

9. Избрание Правления товарищества собственников жилья

10. Избрание председателя Правления товарищества собственников жилья

7. Создание товарищества собственников жилья __________________/наименование/

Голосовали:

«за» ____ % голосов;
«против» ___ % голосов;
«воздержался» ____ % голосов.

Принято единогласно/большинством голосов/не принято

РЕШИЛИ: Создать товарищество собственников жилья _____________________/наименование/

8. Утверждение устава товарищества собственников жилья _____________________.

Голосовали:

«за» ____ % голосов;
«против» ___ % голосов;
«воздержался» ____ % голосов.

Принято единогласно/большинством голосов/не принято

РЕШИЛИ: Утвердить устав товарищества собственников жилья ______________________.

9. Избрание правления товарищества собственников жилья

Ф.И.О.____________________________________.
Ф.И.О.____________________________________.
Ф.И.О.____________________________________.
Ф.И.О.____________________________________.
Ф.И.О.____________________________________.

ЗА список - ___(%)

ПРОТИВ списка - ____ (%)

Принято единогласно/большинством голосов/не принято

РЕШИЛИ:

Избрать в состав правления ТСЖ:

Ф.И.О. _____________________________________.
Ф.И.О. _____________________________________.
Ф.И.О. _____________________________________.
Ф.И.О. _____________________________________.
Ф.И.О. _____________________________________.

10. Избрание председателя правления товарищества собственников жилья.

Ф.И.О.______________________________ за - ___(%)
Ф.И.О.______________________________ за - ___(%)
Ф.И.О.______________________________ за - ___(%)

Принято единогласно/большинством голосов/не принято

РЕШИЛИ:

Избрать председателем правления ТСЖ: Ф. И.О. ____________________________________.

ИТОГОВЫЕ РЕШЕНИЯ ПО ПОВЕСТКЕ ДНЯ:

7. Создать товарищество собственников жилья __________________________.

8. Утвердить устав товарищества собственников жилья __________________.

9. Избрать в состав правления ТСЖ:

Ф.И.О. _____________________________________.
Ф.И.О. _____________________________________.
Ф.И.О. _____________________________________.
Ф.И.О. _____________________________________.
Ф.И.О. _____________________________________.

10. Избрать председателем Правления ТСЖ: Ф.И.О. ____________________________________.

Протокол общего собрания собственников «______________________» составлен в ___(_________) экземплярах.

Подписи:

Председатель собрания _____________________/____________

Секретарь собрания _____________________/____________

 Образец выписки из протокола общего собрания собственников жилья в форме заочного голосования

ВЫПИСКА ИЗ ПРОТОКОЛА
внеочередного общего собрания собственников помещений по выбору управления в многоквартирном доме № 5 по пр. Энергетиков
в форме заочного голосования

г. Новочебоксарск

«14» августа 2013 года

Согласно статей 47, 48 Жилищного кодекса РФ общее собрание собственни-ков многоквартирного дома проведено в форме заочного голосования.

Инициатор собрания: совет многоквартирного дома № 5 по пр. Энергетиков

Место передачи решений собственников: пр. Энергетиков, дом № 5 кв. 10

Время проведения собрания:

Начало приема решений собственников: с 01 июля 2013 года.

Окончание приема заполненных решений собственников: 12 августа 2013 года до 22 ч. 00 мин.

Общая площадь помещений многоквартирного дома составляет 3461,2 м2, в том числе жилых помещений 2602,7 м2, из них в муниципальной собственности 858,5 м2.

Всего в общем собрании в форме заочного голосования принимали участие собственники помещений, обладающие голосами в количестве 2754,95 м2, что составляет 79,6%от общего числа голосов. Всего поступило решений 79 собственников помещений, обладающих голосами.

Представитель собственника по жилым и нежилым помещениям, находящимся в собственности муниципального образования г. Новочебоксарск Тихонова Олеся Вячеславовна, действующая на основании доверенности № 605 , выданной Администрацией г. Новочебоксарск Чувашской Республики, от « 10 » июля 2013 г. Получено решение собственника по жилым и нежилым помещениям, находящимся в собственности муниципального образования в письменном виде (учтено при голосовании).

Кворум имеется. Собрание правомочно.

ПОВЕСТКА ДНЯ:

19. Утверждение ТСЖ и наименования ТСЖ: «Товарищество собственников жилья «Энергетиков-5».

ИТОГИ ГОЛОСОВАНИЯ:

19. Утверждение ТСЖ и наименования ТСЖ: « Товарищество собственников жилья «Энергетиков-5»

Проголосовало:
«за» 2754,95 голосов, что составляет 100,00 % от участвующих в собрании;
«против» - голосов, что составляет 0,00 % от участвующих в собрании;
«воздержался» - голосов, что составляет 0,00 % от участвующих в собрании

Принято решение:

Утвердить ТСЖ и наименование ТСЖ: «Товарищество собственников жилья «Энергетиков-5».

Председатель собрания
_____________________ Васильев В.Ф.

Секретарь собрания
_____________________ Александрова С.В.

Члены счетной комиссии
______________________ Крайнов А.Н.

____________________ Кошкин В.М.

______________________ Иконникова С.А.

протоколов экстракции ДНК | McCouch RiceLab

I. Протокол экстракции гомогенизатора HT

II. Протокол крупномасштабной экстракции ДНК

III. Протокол Extract-N-Amp


A. Материалы и реагенты

1. Материалы

  • а. Три бокса для 96-луночных пробирок для каждого набора из 96 образцов
  • г. Две пробирки для хранения ДНК с крышками для каждого образца
  • г. 1 шарик из нержавеющей стали на образец для каждой измельчающей трубки
  • г.Ножницы и / или пинцет для сбора тканей
  • e. Рабочий лист карты планшета для записи ID образца каждой лунки / пробирки
  • ф. Ведро для льда или контейнер из пенопласта со льдом, сухим льдом или жидким азотом
  • г. Крупные и мелкие ступки для взвешивания ящиков с трубами в водяной бане.
  • ч. Бумажные полотенца
  • я. HT Гомогенизатор для измельчения тканей
  • Дж. Водяная баня, 65 ° C
  • к. Центрифуга, оснащенная поворотным ковшовым ротором A-2-DWP для 96-луночных планшетов / коробок
  • л.Морозильная камера, -20˚C
  • г. Инкубатор, температура 37C

2. Реагенты

  • а. Лед, сухой лед или жидкий азот
  • г. Буфер для экстракции
  • i. 100 мМ Трис-HCl pH 8
  • ii. 50 мМ ЭДТА, pH 8
  • iii. 500 мМ NaCl
  • iv. 1,25% SDS (мас. / Об.)
  • об. 8,3 мН NaOH
  • vi. 0,38 г бисульфата натрия (на 100 мл буфера) *
  • * добавить непосредственно перед использованием
  • г. 24: 1: Хлороформ: изоамиловый спирт
  • г.Изопропанол
  • e. 70% этанол об / об
  • ф. Буфер TE, ph 8

B. Процедура

1. Пометьте коробку с 96-луночной пробиркой для ориентации.

2. Поместите 96-луночный бокс, содержащий по одному bb из нержавеющей стали, в каждую пробирку в коробке со льдом, толкая лед вверх по бокам, чтобы охладить пробирки. (Вы можете положить его в ящик с небольшим количеством жидкого азота или ящик с небольшим количеством сухого льда.)

3. Возьмите таблицу с 96-луночной сеткой и расположите ее так же, как планшет.Обозначьте по мере заполнения поля.

4. Вырежьте образец листа риса размером 3–4 см, сложите его пополам и сдвиньте пинцетом примерно на 5 мм выше bb. Не кладите салфетку вертикально (BB просто пройдет мимо нее при встряхивании. Ткань должна перекрывать путь BB, но не плотно).

5. Плотно наденьте колпачки на пробирки и бумажное полотенце, сложенное втрое поверх колпачков, затем накройте крышкой. (Плотно заклейте скотчем.)

6. Переходите ко второму этапу или сохраняйте при –20, пока вы не будете готовы измельчить ткань.

7. Поместите вашу тарелку (и) в неглубокий контейнер с жидким азотом (не погружайте тарелку - в ящике должно быть около 1 дюйма азота).

8. Используйте пустой 96-луночный бокс и крышку, чтобы отрегулировать герметичность геногриндера, пока ваш бокс остывает.

9. Поместите коробку (с очень плотными крышками и крышкой) на гомогенизатор и зафиксируйте ее на месте.

10. Закройте крышку машины и заблокируйте ее. Включите машину на 2 минуты на настройке 8.

11. Выключите машину и снимите коробку.Убедитесь, что шлифование завершено. (примечание: если еще раз попытаться измельчить, коробка может треснуть !!)

12. Если некоторые из ваших образцов не измельчились, используйте пару металлических пинцетов, чтобы раздавить образец (сначала вы должны повторно заморозить в азоте). Обязательно очищайте щипцы между каждым образцом, чтобы избежать загрязнения.

** примечание: каждый образец измельчается редко. Обычно есть один или два, которые вам нужно сделать вручную. Скорее всего, это результат неправильного размещения образца ткани.**

13. Храните коробки в морозильной камере (-20 ° C) до момента экстракции.

** примечание: на этом этапе у вас должно быть две коробки - разделите образцы, если у вас только одна коробка. (следите за порядком!) Вы должны сделать это, чтобы иметь возможность центрифугировать (при желании вы можете создать пустую ячейку баланса, но обычно более эффективно разделять образцы). **

14. Центрифугируйте коробки, чтобы ткань опустилась на дно пробирки (всего одну или две минуты на умеренной скорости).

15. Отметьте верхний (или нижний) край всех труб несмываемым маркером и отметьте, какой край вы отметили - всегда делайте это одинаково !!

* образцы должны быть при –20, не жидкими и замороженными, когда вы добавляете буфер !! *

16. Осторожно снимайте крышки, по одному ряду за раз, стараясь не «выбросить» ткань и не загрязнить другие пробирки. Отложите шапки в ведро для стирки.

17. Добавьте 400 мкл предварительно нагретого до 65 градусов буфера для экстракции в каждую пробирку с помощью многоканальной пипетки или пипетки с повторителем.

18. Наденьте на пробирки чистые колпачки, положите на них бумажное полотенце, сложенное втрое, и закройте крышку. Встряхните на вортексе, пока большая часть ткани не будет ресуспендирована. * держитесь за него, сильно прижимая крышку *.

19. Поместите ящики в водяную баню с температурой 65 градусов и сразу же положите на тарелку большой раствор, внутри которого находится маленький раствор. (бумажное полотенце должно оставаться на колпачках - постарайтесь не опускать его в воду.)

* не более 1.5 дюймов воды в ванне *

20. Дайте планшету инкубироваться примерно 30 минут. Нет необходимости встряхивать коробки в течение этого времени, если вы успешно ресуспендировали ткань с помощью вортекса.

21. Выньте коробки и строительный раствор из водяной бани и положите на бумажные полотенца. Дайте им постоять около 2 минут, затем удалите небольшой раствор и дайте им постоять еще 2 минуты. К тому времени давление в трубках упадет, и вы сможете легко снять колпачки.Снимите колпачки с противоположной от вас стороны, чтобы они не брызнули на вас. Остерегайтесь загрязнения и опускайте грязные колпачки в ведро для мытья.

22. В вытяжном шкафу добавьте 400 мкл смеси 24: 1: хлороформ: изоамиловый спирт в каждую пробирку.

23. Наденьте новые крышки на пробирки. (очень плотно!) Добавьте в каждую коробку сложенное втрое бумажное полотенце и закройте крышку. Заклеить их скотчем (очень плотно !!)

24. Плотно удерживая две коробки вместе, осторожно переверните их в вытяжном шкафу в течение 5 минут.Если вы заметили мокрые бумажные полотенца, закройте колпачки и замените полотенца.

25. Взвесьте коробки и уравновесите их, тарировав самые тяжелые, а затем доведя партнера до нуля с помощью bb, установленного в колпачках (или с помощью бумажных полотенец). Положите 2 бумажных полотенца, сложенных втрое, на каждую тарелку и закройте крышку. Лента закрыта (убедитесь, что это не влияет на баланс коробок). Центрифугируйте планшеты при 3500 об / мин в течение 10 минут.

26. В вытяжке осторожно снимите колпачки (чтобы брызги ушли от вас).Выбросьте крышки в ведро в вытяжке - они не будут использоваться повторно.

27. Аккуратно удалите 250 мкл верхней фазы с помощью многоканальной пипетки с наконечниками на 300 мкл. Поместите образец в новый 96-луночный планшет.

* убедитесь, что новая пластина находится в той же ориентации, что и исходная *

28. Отметьте пластину линией, как вы делали в начале, и промаркируйте коробку.

29. Добавьте 2/3 объема изопропанола (комнатной температуры) в каждую пробирку для осаждения ДНК.Закройте пробирки крышкой. Уравновесить, взвесив, как описано выше, и накрыть бумажным полотенцем крышкой. Аккуратно переворачивайте, пока ДНК не выпадет из раствора. Вы можете оставить их на –20 на ночь (или на какое-то время) или перейти непосредственно к следующему шагу.

30. Центрифугируйте планшеты в течение 10 минут при 3500 об / мин.

31. В капоте снимаем колпачки осторожно (подальше от себя). Вылейте жидкость в стакан, по одному ряду пробирок за раз, и осторожно постучите пробирками о бумажное полотенце. Следите за тем, чтобы гранула не выскользнула.Лучше всего это сработает, если вы не раздумываете при сливе супернатанта. Вставьте ряд трубок обратно в коробку в правильной ориентации.

32. Добавьте 200 мкл 70% этанола комнатной температуры в каждую пробирку и снова наденьте чистые крышки. Осторожно постучите. Оставьте на ночь (или некоторое время) при комнатной температуре. Вы можете приступить к работе немедленно, если ваши образцы выглядят очень чистыми, а их чистота не является абсолютно критичной.

33. Слейте этанол, как и раньше, и постучите по трубкам, чтобы удалить как можно больше жидкости, не выливая гранулы.Вы можете центрифугировать перед этим этапом, но часто в этом нет необходимости, если только гранулы не начнут соскальзывать по стенкам пробирки во время сброса. Поместите пробирки обратно в коробки и поместите в инкубатор с температурой 37 градусов, не встряхивая, чтобы высохнуть. (это просто дует воздух.) Это займет несколько часов. Кроме того, вы можете оставить их в вытяжном шкафу и включить кнопку аварийной вентиляции (пожалуйста, отключите ее). Это повысит поток воздуха и поможет им высохнуть быстрее, но это будет медленнее, чем в инкубаторе.

34. Если в образцах нет остатков спирта, добавьте 50 мкл буфера te для концентрированного исходного раствора или 500 мкл буфера te для рабочего разведения. (они ресуспендируются быстрее, если вы нагреете буфер te до 65c.)

35. Хранить с крышками при температуре –20 или 4 градуса Цельсия в зависимости от использования.


A. Материалы и реагенты

1. Материалы

  • а. Конверты бумажные коричневые
  • г. Контейнер Дьюара для жидкого азота или пенополистирола
  • г.Ступка и пестик
  • г. Конические пробирки 50 мл
  • e. Кисть (тип кисти)
  • ф. Стеллажи на 80 пробирок
  • г. Стеклянная пипетка Пастера с крючковатым наконечником
  • ч. Центрифуга
  • я. Пипетки с наконечниками, включая наконечники с широким отверстием.
  • Дж. Водяная баня
  • к. Холодильник и морозильник (до -20˚C)

2. Реагенты

  • а. Лед, сухой лед или жидкий азот
  • г. Буфер для экстракции
  • i.100 мМ Трис-HCl pH 8
  • ii. 50 мМ ЭДТА, pH 8
  • iii. 500 мМ NaCl
  • iv. 1,25% SDS (мас. / Об.)
  • об. 8,3 мН NaOH
  • vi. 0,38 г бисульфата натрия (на 100 мл буфера) *
  • * добавить непосредственно перед использованием
  • г. 24: 1: Хлороформ: изоамиловый спирт
  • г. Изопропанол
  • e. 70% этанол об / об
  • ф. Буфер TE, ph 8
  • i. 10 мМ Трис-HCl pH 8
  • ii. 1 мМ ЭДТА

Б.Процедура

1. Соберите ткань:

  • а. Соберите свежую ткань листьев (достаточно, чтобы сделать шар размером с яйцо).
  • г. Поместите его в конверт из коричневой бумаги и погрузите в жидкий азот.
  • г. Затем эту ткань можно хранить при -20 ° C или -80 ° C до тех пор, пока она не понадобится, или вы можете сразу перейти к следующему этапу.

2. Охладите ступку, поместив ее в морозильную камеру на несколько часов перед использованием или поместив ее в ящик с жидким азотом примерно на 5 минут.(* Будьте осторожны при извлечении его из коробки, так как он будет очень холодным - вам нужно будет вытащить его с помощью какого-либо инструмента.)

3. Измельчить образец:

  • а. Налейте в ступку немного жидкого азота и поместите в нее один из образцов ткани.
  • Протоколы экстракции ДНК из лаборатории Маккача, 2 июня 2010 г.
  • г. Измельчите ткань пестиком, пока она не станет тонкой порошкообразной консистенции (весь азот испарится, и вам нужно продолжить измельчение в этой точке, чтобы получить достаточно мелкую массу. )
  • г. Перенесите измельченную ткань в коническую пробирку объемом 50 мл (помеченную и охлажденную) с помощью кисти.
  • г. Положите около 15 мл измельченной ткани в каждую пробирку. Закройте пробирку крышкой и поместите в азот или в морозильную камеру.
  • e. Быстро очистите ступку и пестик сухими бумажными полотенцами, прежде чем они начнут таять. Если они оттают, к ним прилипнет ткань. Если это произойдет, вы можете удалить ткань с помощью наждачной бумаги.
  • ф. Не погружайте замороженную ступку и пестик в воду - он разобьется! Вы можете приступить непосредственно к экстракции или хранить измельченные ткани при -20 или -80 ° C.

4. Добавьте бисульфит натрия в буфер для экстракции и нагрейте до 65 ° C на водяной бане.

5. Добавьте примерно от 20 до 25 мл буфера для экстракции в каждую пробирку с измельченной тканью.

  • а. Его можно добавить с помощью устройства для повторного дозирования или просто отмерив буфер в конической пробирке на 50 мл и вылив его в пробирки, содержащие ткань. Точные измерения не важны.
  • г. Закройте пробирки крышкой и ресуспендируйте, осторожно постукивая (или при необходимости перемешивая чистой металлической лопаткой.) Ткань должна иметь температуру -20 ° C, когда вы будете готовы добавить буфер (чем холоднее, тем труднее будет ресуспендировать ткань).

6. Поместите образцы в водяную баню с температурой 65 ° C примерно на 30 минут. Время от времени перемешивайте вручную.

7. Снимите образцы с температуры 65 ° C. Дайте остыть в вытяжном шкафу для химикатов в течение 10–15 минут (в этом может помочь снятие крышек).

8. Добавьте примерно 15 мл хлороформа: изоамиловый спирт, 24: 1, в каждый образец. Закройте каждую пробирку, убедившись, что крышки правильно закрыты, чтобы избежать утечки.

9. Поместите пробирки в штатив, затем поместите на них другую штатив (или другой твердый предмет), чтобы закрепить пробирки. Осторожно переверните пробирки и покачивайте взад и вперед, чтобы перемешать. Делайте это в течение 5 минут. Вся эта работа должна выполняться в вытяжном шкафу, поскольку хлороформ является потенциальным канцерогеном.

10. Центрифугируйте образцы в настольной центрифуге (от 2500 до 3000 об / мин в течение 10 минут).

11. Перенесите верхнюю водную фазу в новую пробирку на 50 мл.

  • а.Если граница раздела между верхним водным слоем и нижним органическим слоем стабильна, верхний слой может быть перенесен путем декантации. Если нет, переведите пипеткой.
  • г. Эту работу также следует проводить в химическом вытяжном шкафу, поскольку в водном слое можно обнаружить некоторое количество хлороформа.
  • г. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ЭТАП: Добавьте 10 мкл раствора РНКазы в пробирки, осторожно перемешайте и оставьте при комнатной температуре примерно на 15 минут. Переходите к следующему шагу.

12. Добавьте 2/3 объема изопропанола в каждый образец (например,грамм. если 15 мл водной фазы переносится в новую пробирку, добавляют 10 мл изопропанола).

  • а. Хорошо перемешайте, перевернув пробирку несколько раз.
  • Протоколы экстракции ДНК из лаборатории Маккача, 2 июня 2010 г.
  • г. В этот момент должен быть виден беловатый, вязкий осадок, состоящий из ДНК и РНК.
  • г. Образцы можно хранить при температуре 4 ° C или -20 ° C в течение нескольких часов или в течение ночи, чтобы способствовать осаждению или в качестве точки остановки в протоколе.В качестве альтернативы вы можете перейти непосредственно к следующему шагу.

13. Удалите осадок.

  • а. Если осадок можно извлечь с помощью стеклянной пипетки Пастера, имеющей форму крючка, переходите к этапу 14.
  • г. Если осадок не всплывает или не образует связную массу, его можно собрать центрифугированием, как на этапе 10. Затем переходите к этапу 14.b.

14. Ресуспендируйте осадок ДНК.

  • а. Окуните ДНК на крючок в холодный 70% этанол.Он останется на крючке. Удалите его и аккуратно промокните кимвипом. (Делайте это очень осторожно, чтобы нуклеиновая кислота не прилипла к кимвипе!)
  • г. Поместите почти сухой осадок в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 200-1000 мкл буфера ТЕ. (Необходимое количество ТЕ зависит от размера осадка нуклеиновой кислоты.)
  • г. * ПРИМЕЧАНИЕ. В осадке не может быть ЛЮБОГО этанола, иначе это может отрицательно повлиять на реакцию ПЦР. Если необходимо, дайте осадку немного посидеть в пробирке, чтобы он высох, прежде чем добавлять буфер ТЕ.Обычно при использовании этого метода в этом нет необходимости, так как кажется, что на кимвипе вытягивается достаточное количество этанола. Переходите к шагу 15.
  • г. (из шага 13.b) Слейте жидкость из центрифугированной пробирки и добавьте несколько мл холодного 70% этанола.
  • e. Осторожно постучите и оставьте на несколько минут до ночи при комнатной температуре, в зависимости от ваших потребностей и временных ограничений. (Если ДНК действительно выглядит «грязно», вы можете оставить ее на ночь, но обычно мы так не поступаем.) Снова центрифугируйте пробирку при 2500 - 3000 об / мин, но только в течение 5 минут.
  • ф. Слейте жидкость и дайте всему этанолу испариться. (Вы можете оставить трубки в вытяжном шкафу.) Это займет некоторое время! Когда гранула высохнет, добавьте 200-1000 мкл буфера ТЕ (в зависимости от размера гранулы). Используя наконечник с широким отверстием, перенесите раствор в пробирку на 1,5 мл. Переходите к шагу 15.

15. Ресуспензия может занять несколько часов, и вы можете просто оставить пробирки в холодильнике на ночь, если у вас есть время.

  • а. Чтобы помочь с повторным суспендированием ДНК, буфер TE можно нагреть до 65 ° C перед добавлением к осадку.
  • г. В качестве альтернативы, пробирки объемом 1,5 мл, содержащие ДНК, можно немного нагреть в водяной бане при 65 ° C (не погружайте пробирки в воду, а установите их над водой, чтобы их окружал теплый воздух) в течение 15-30 минут. (используйте как можно меньше времени для сохранения целостности ДНК).
  • Примечание: если вы добавили еще TE и ваша гранула больше не переходит в раствор:
  • Некоторые образцы могут содержать большое количество полисахаридов, которые не растворяются и могут создавать впечатление, что осадок ДНК не перешел в раствор. В этих случаях образцы следует центрифугировать на максимальной скорости (13 000 об / мин) в микроцентрифуге в течение 10 минут, а супернатант, содержащий ДНК, следует перенести в чистую пробирку.

A. Материалы и реагенты

1. Материалы

  • а. 96-луночный микротитровальный планшет и пломбы
  • г. Пинцет и ножницы для сбора тканей
  • г. Ведро для льда или ящик из пенополистирола
  • г. Термоциклер
  • e. Центрифуга с ротором для микротитровальных планшетов и адаптером
  • ф.-20 ˚C Морозильная камера
  • г. Кормушки для раствора

2. Реагенты

  • а. Лед
  • г. Деионизированная дистиллированная вода (ddh3O)
  • г. Буфер для экстракции Extract-N-Amp
  • г. Буфер для разбавления Extract-N-Amp

B. Процедура

1. Соберите образцы ткани размером ~ 1 мм2 в 96-луночный микротитровальный планшет на льду.

2. Храните запечатанный планшет с образцами тканей при -20 ˚C до экстракции.

3. Добавьте 10 мкл экстракционного буфера Extract-N-Amp в каждую лунку тканевого планшета, убедившись, что каждый образец хотя бы частично погружен в этот буфер.Кратковременно перемешайте на вортексе, центрифугируйте в течение 10 секунд при 3000 об / мин, чтобы при необходимости погрузить образец ткани в буфер.

4. Проведите запечатанный планшет через короткую программу инкубации на термоциклере при 94 ° C в течение 10 минут.

5. Добавьте 10 мкл буфера для разведения Extract-N-Amp. Коротко перемешайте на вортексе, затем центрифугируйте

6. Добавьте 80 мкл ddh3O (чтобы концентрация ДНК в образце составляла 1: 4 по сравнению с первоначально выделенной ДНК из образца).

Протокол экстракции клеток

| Thermo Fisher Scientific

Первичные ткани - ценные инструменты для изучения внутриклеточных и внеклеточных маркеров, которые характеризуют болезненные состояния. Мы разработали протокол для быстрого выделения цитокинов и сигнальных молекул из интактной ткани. Этот метод предназначен для экстракции общего белка и использует неабразивный реагент для экстракции тканей. С помощью этого протокола можно извлечь образцы тканей размером всего 10 мг. Этот метод чувствителен и позволяет обнаруживать связанные с заболеванием колебания биомаркеров. Это эффективная система для извлечения белков из различных типов тканей. Сердце, легкие, почки, селезенка, мозг, печень, тимус и гладкомышечные ткани были успешно извлечены с помощью этого протокола.Приготовленные экстракты совместимы с различными иммуноанализами, такими как ELISA и Invitrogen ™ Luminex ™, а также со всеми традиционными анализами белка. Наш метод экстракции недорогой, универсальный и может быть выполнен менее чем за 15 минут. Мы предлагаем буфер для экстракции клеток для экстракции общего белка из различных типов тканей.

Приготовьте 1x буфер для экстракции клеток, используя следующий состав:

Состав буфера для экстракции клеток

* 10 мМ Трис, pH 7. 4
* 2 мМ Na 3 VO 4
* 100 мМ NaCl
* 1% Thermo Scientific ™ Triton ™ X-100
* 1 мМ ЭДТА
* 10% глицерин
* 1 мМ EGTA
* 0,1% SDS
* 1 мМ NaF
* 0,5% дезоксихолат
* 20 мМ Na 4 P 2 O 7

Доступен этот буфер для экстракции клеток - кат. нет. FNN0011.

Этот буфер для экстракции клеток можно разделить на аликвоты 1x в микроцентрифужных пробирках и хранить при –20 ° C до использования.Перед извлечением клеток разморозьте на льду.

Необходимые дополнительные реагенты:

1 мМ PMSF
Коктейль ингибиторов протеазы, Sigma (каталожный номер P-2714)

Этот буфер для экстракции клеток должен быть дополнен 1 мМ PMSF (не входит в комплект) и коктейлем из ингибиторов протеазы ( не входит в комплект) непосредственно перед использованием для приготовления буфера для полной экстракции клеток. Добавление коктейля ингибиторов протеазы и PMSF необходимо для подавления протеолиза в клеточных экстрактах. Для добавления PMSF мы рекомендуем установить 0.3 М исходного раствора в ДМСО и добавление достаточного объема для конечной концентрации 1 мМ (т.е. 17 мкл на 5 мл буфера для экстракции клеток). PMSF очень нестабилен и должен быть добавлен непосредственно перед использованием, даже если был добавлен ранее. Для добавления коктейля ингибиторов протеазы мы рекомендуем Sigma (каталожный номер P-2714), восстановленный в соответствии с инструкциями производителя, и добавление 250 мкл на 5 мл буфера для экстракции клеток. Стабильность буфера для экстракции клеток с добавлением ингибитора протеазы составляет 24 часа при 4 ° C.

Обработка клеток

Этот метод можно использовать для получения относительно больших количеств клеточных экстрактов с каждым из изученных режимов стимуляции.Этапы промывки, включенные в эту процедуру, помогают минимизировать компоненты среды в экстрактах клеток.

  1. Оцените плотность клеток: Клетки суспензии: Подсчитайте клетки суспензии путем подсчета на гемацитометре. Адгезивные клетки: Оцените плотность клеток путем визуального осмотра под микроскопом. Уровни конфлюэнтности 70–80% считаются оптимальными для многих исследований передачи сигналов.

  2. Стимулируйте клетки по желанию.

  3. Перенесите клетки в чистые конические пробирки на 15 мл: Клетки-суспензии: Разберите аликвоты желаемого количества клеток в среде в чистые конические пробирки на 15 мл. Прилипшие клетки: Удалите клетки из сосуда соскабливанием. Перенести среду, содержащую отделившиеся клетки, в чистые конические пробирки на 15 мл.

  4. Соберите клетки центрифугированием при 300 x g в течение 7 минут.

  5. Аспирируйте среду.

  6. Ресуспендируйте гранулу в ледяном PBS.

  7. Соберите клетки центрифугированием при 300 x g в течение 7 минут при 4 ° C.

  8. Аспирируйте PBS.

  9. Лизируйте клетки, нанося пипеткой буфер для полной экстракции клеток в каждую пробирку. Мы рекомендуем использовать 1 мл буфера для полной экстракции клеток на 10 8 клеток. Важно отметить, что это значение может потребовать оптимизации для каждого конкретного приложения.

  10. Перенесите лизаты в чистые микроцентрифужные пробирки.

  11. Смесь перемешайте на вортексе, затем инкубируйте смесь на льду в течение 30 минут, периодически встряхивая.

  12. Осветите лизаты центрифугированием при 14 000 об / мин (13 000 x g) при 4 ° C в течение 10 минут.

  13. Перенесите осветленные экстракты клеток в чистые микроцентрифужные пробирки.

  14. Осветленные экстракты клеток следует хранить при –80 ° C до готовности к анализу. Избегайте повторяющихся циклов замораживания-оттаивания. При подготовке к анализу дайте образцам оттаять на льду. Хорошо перемешайте перед анализом.

  15. Определите концентрацию белка с помощью подходящего метода, такого как набор для количественного определения белка Invitrogen ™ Quant-iT ™ (№ по каталогу Q33210). Клеточные экстракты, полученные этим методом, обычно имеют концентрацию белка от 1 до 10 мг / мл.

  16. Для некоторых аналитов требуется этап обработки пробы.Пожалуйста, обратитесь к протоколу анализа аналита для получения подробной информации о рекомендациях по обработке образцов.

  17. Все клеточные экстракты требуют разбавления как минимум 1:10 в стандартном буфере для разбавления перед анализом с помощью наборов Invitrogen ™.

ДНК для исследования микробиома человека: вопрос стандартизации | Genome Biology

  • 1.

    Sinha R, Abu-Ali G, Vogtmann E, Fodor AA, Ren B, Amir A, Schwager E, Crabtree J, Ma S, Abnet CC, et al. Оценка вариации в последовательности ампликонов микробного сообщества консорциумом проекта Microbiome Quality Control (MBQC).Nat Biotechnol. 2017; 35: 1077–86.

    CAS Статья Google ученый

  • 2.

    Costea PI, Zeller G, Sunagawa S, Pelletier E, Alberti A, Levenez F, Tramontano M, Driessen M, Hercog R, Jung FE и др. К стандартам обработки образцов фекалий человека в метагеномных исследованиях. Nat Biotechnol. 2017; 35: 1069–76.

    CAS Статья Google ученый

  • 3.

    Консорциум проекта «Микробиом человека».Структура, функции и разнообразие микробиома здорового человека. Природа. 2012; 486: 207–14.

    Артикул Google ученый

  • 4.

    Цинь Дж., Ли Р., Раес Дж., Арумугам М., Бургдорф К.С., Маничан С., Нильсен Т., Понс Н., Левенез Ф., Ямада Т. и др. Каталог микробных генов кишечника человека, созданный путем метагеномного секвенирования. Природа. 2010; 464: 59–65.

    CAS Статья Google ученый

  • 5.

    Marotz C, Amir A, Humphrey G, Gaffney J, Gogul G, Knight R. Экстракция ДНК для упрощения метагеномики различных образцов окружающей среды. Биотехники. 2017; 62: 290–3.

    CAS Статья Google ученый

  • 6.

    Весоловска-Андерсен А., Баль М.И., Карвалью В., Кристиансен К., Зихериц-Понтен Т., Гупта Р., Лихт TR. Выбор метода выделения бактериальной ДНК из фекального материала влияет на структуру сообщества, определяемую метагеномным анализом.Микробиом. 2014; 2:19.

    Артикул Google ученый

  • 7.

    Франзоса Е. А., Морган XC, Сегата Н., Уолдрон Л., Рейес Дж., Эрл А.М., Джаннукос Г., Бойлан М.Р., Чиулла Д., Геверс Д. и др. Связь метатранскриптома и метагенома кишечника человека. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2014; 111: E2329–38.

    CAS Статья Google ученый

  • 8.

    Horz HP, Scheer S, Huenger F, Vianna ME, Conrads G.Селективное выделение бактериальной ДНК из клинических образцов человека. J Microbiol Methods. 2008. 72: 98–102.

    CAS Статья Google ученый

  • 9.

    Marotz CA, Sanders JG, Zuniga C, Zaramela LS, Knight R, Zengler K. Улучшение метагеномики дробовика слюны за счет химического истощения ДНК хозяина. Микробиом. 2018; 6: 42.

    Артикул Google ученый

  • 10.

    Эйзенхофер Р., Миних Дж. Дж., Мароц К., Купер А., Найт Р., Вейрих Л.С.Загрязнение в исследованиях микробиома с низкой микробной биомассой: проблемы и рекомендации. Trends Microbiol. 2019; 27: 105–17.

    CAS Статья Google ученый

  • 11.

    Солтер С.Дж., Кокс М.Дж., Турек Е.М., Калус С.Т., Куксон В.О., Моффатт М.Ф., Тернер П., Паркхилл Дж., Ломан, штат Нью-Джерси, Уокер А.В. Загрязнение реагентов и лабораторий может критически повлиять на анализ микробиома на основе последовательностей. BMC Biol. 2014; 12: 87.

    Артикул Google ученый

  • 12.

    Glassing A, Dowd SE, Galandiuk S, Davis B, Chiodini RJ. Врожденное бактериальное загрязнение ДНК реагентов для экстракции и секвенирования может повлиять на интерпретацию микробиоты в образцах биомассы с низким содержанием бактерий. Gut Pathog. 2016; 8: 24.

    Артикул Google ученый

  • 13.

    Minich JJ, Zhu Q, Janssen S, Hendrickson R, Amir A, Vetter R, Hyde J, Doty MM, Stillwell K, Benardini J, et al. KatharoSeq обеспечивает высокопроизводительный анализ микробиома из образцов с низким содержанием биомассы.mSystems. 2018; 3.

  • 14.

    Morales E, Chen J, Greathouse KL. Композиционный анализ микробиома человека в исследованиях рака. Методы Мол биол. 1928; 2019: 299–335.

    Google ученый

  • 15.

    Dejea CM, Wick EC, Hechenbleikner EM, White JR, Mark Welch JL, Rossetti BJ, Peterson SN, Snesrud EC, Borisy GG, Lazarev M, et al. Организация микробиоты - отличительная черта проксимального колоректального рака. Proc Natl Acad Sci U S A.2014; 111: 18321–6.

    CAS Статья Google ученый

  • 16.

    Bullman S, Pedamallu CS, Sicinska E, Clancy TE, Zhang X, Cai D, Neuberg D, Huang K, Guevara F, Nelson T., et al. Анализ персистенции Fusobacterium и антибиотического ответа при колоректальном раке. Наука. 2017; 358: 1443–8.

    CAS Статья Google ученый

  • 17.

    Huseyin CE, Rubio RC, O'Sullivan O, Cotter PD, Scanlan PD.Грибковая граница: сравнительный анализ методов, используемых при изучении микобиома кишечника человека. Front Microbiol. 2017; 8: 1432.

    Артикул Google ученый

  • 18.

    Розенбаум Дж., Усик М., Чен З., Зольник С. П., Джонс Х. Э., Уолдрон Л., Дауд Дж. Б., Торп Л. Е., Бурк Р. Д.. Оценка методов выделения ДНК полости рта на бактериальную и грибковую микробиоту. Научный доклад 2019; 9: 1531.

    Артикул Google ученый

  • 19.

    Шкопоров А.Н., Райан Ф.Дж., Дрейпер Л.А., Форд А., Стокдейл С.Р., Дейли К.М., МакДоннелл С.А., Нолан Дж.А., Саттон ТДС, Далмассо М. и др. Воспроизводимые протоколы метагеномного анализа фекалий человека. Микробиом. 2018; 6: 68.

    Артикул Google ученый

  • 20.

    Ким Д., Хофштадтер С.Е., Чжао С., Маттей Л., Танес С., Кларк Е., Лаудер А., Шерилл-Микс С., Чехоуд С., Келсен Дж. И др. Оптимизация методов и устранение ошибок в исследовании микробиома. Микробиом. 2017; 5: 52.

    Артикул Google ученый

  • 21.

    Hornung BVH, Zwittink RD, Kuijper EJ. Проблемы и текущие стандарты контроля в исследованиях микробиома. FEMS Microbiol Ecol. 2019; 95. https://doi.org/10.1093/femsec/fiz045

  • 22.

    Sinha R, Ahsan H, Blaser M, Caporaso JG, Carmical JR, Chan AT, Fodor A, Gail MH, Harris CC, Helzlsouer K и др.: Следующие шаги в изучении микробиома человека и здоровья в перспективе исследования, Bethesda, MD, 16-17 мая 2017 г. . Microbiome 2018, 6 : 210.

  • 23.

    Sinha R, Abnet CC, White O, Knight R, Huttenhower C. Проект контроля качества микробиома: дизайн базового исследования и будущие направления. Genome Biol. 2015; 16: 276.

    Артикул Google ученый

  • Addgene: Набор для экстракции свободной РНК


    Введение

    Рисунок 1: Схема различных этапов экстракции РНК.

    Последнее обновление: 10 апреля 2020 г.

    Оборудование

    • Микроцентрифуга охлаждающая
    • Если у вас только микроцентрифуга без охлаждения, см. Шаг 4 любого протокола перед тем, как начать.
    • Гомогенизатор
    • Вихрь
    • -20 ° C морозильная камера
    • -80 ° C морозильная камера

    Реагенты

    • Решение D (для варианта протокола №1):
    • 4 M тиоцианат гуанидиния,
    • 25 мМ цитрат натрия, pH 7.0
    • 0,5% (мас. / Об.) N-лаурозилсаркозин (саркозил)
    • 0,1 М 2-меркаптоэтанол
    • TRIzol® или аналогичный продукт, такой как TRI Reagent®, RNAzol®, QIAzol® (для варианта протокола № 2)
    • Водонасыщенный фенол
    • 2 М ацетат натрия, pH 4
    • Хлороформ / изоамиловый спирт (49: 1)
    • 75% этанол
    • Вода без РНКазы или раствор TE
    • Пробирки без РНКазы: микроцентрифужные пробирки, полипропиленовые пробирки 4 мл
    • Раствор для дезактивации РНКаз, такой как RNase AWAY® или RNaseZAP®
    • Изопропанол (для стадии осаждения, вариант А)
    • 7.5 M хлорид лития (для стадии осаждения, вариант B)
    • Гликоген (необязательно)
    • * Осторожно * Обязательно прочтите паспорт безопасности (SDS), где указаны предупреждения и опасности, связанные с этими реагентами. При работе с летучими реагентами из списка выше работайте в хорошо вентилируемом помещении и под вытяжным шкафом.

    Процедура

    Вариант № 1 - Решение D Протокол

    Перед тем, как начать этот протокол, обязательно приготовьте раствор D (рецепт см. В разделе о реагентах выше).Если вы используете TRIzol®, перейдите к разделу Вариант №2 - Протокол TRIzol® ниже.

    1. Гомогенизируйте или лизируйте ткани или клетки в растворе D.
      • Для тканей: используйте 1 мл раствора D на 100 мг клеток.
      • Для культивированных клеток: используйте 1 мл раствора D на 1 X 10 7 клеток.
    2. Дайте образцу (-ам) отстояться при комнатной температуре в течение 5 минут для диссоциации нуклеопротеиновых комплексов.
      • Эффективность выделения вашей РНК будет зависеть от того, насколько эффективен ваш протокол лизиса клеток. Хотя простая гомогенизация эффективна для большинства тканей млекопитающих; Для более выносливых тканей, таких как кости или образцы бактерий / дрожжей / растений, потребуются дополнительные действия для эффективного лизирования открытых клеток.
    3. Извлеките РНК из гомогенизированного образца (ов). Перенесите лизат ткани / клеток в пробирку на 4 мл. Последовательно добавьте к 1 мл лизата следующее:
      • Добавить 0,1 мл 2 М ацетата натрия (pH 4,0), тщательно перемешать переворачиванием.
      • Добавить 1 мл водонасыщенного фенола, тщательно перемешать переворачиванием.
      • Добавить 0.2 мл смеси хлороформ / изоамиловый спирт (49: 1), а затем энергично встряхните рукой в ​​течение 10 секунд.
    4. Инкубируйте образец (ы) в течение 15 минут на льду и центрифугируйте образец (ы) в течение 15 минут при 12000 × g при 4 ° C, чтобы отделить РНК от остальной части лизата ткани / клетки.
    5. * Pro-Tip * Вращение образцов при 4 ° C помогает снизить деградацию РНК. Если у вас нет доступа к охлаждаемой центрифуге, вы можете осторожно перенести центрифугу в холодную комнату для центрифугирования.После того, как вы закончите использовать центрифугу, верните это оборудование к комнатной температуре, так как длительное хранение в холодной комнате может повредить его.

    6. С помощью пипетки перенесите верхнюю водную фазу в новую пробирку, свободную от РНКаз.
      • Смесь разделяется на нижний органический слой, межфазный слой и верхний водный слой. Следите за тем, чтобы не нарушить и не собрать межфазный слой наконечником дозатора.

      * Pro-Tip * Чтобы собрать как можно больше верхней водной фазы без нарушения межфазного слоя, рассмотрите возможность использования пипетки меньшего объема, например p200, для сбора большей части водной фазы.Возможно, вам придется собрать дважды или больше из одной и той же трубки, но, в отличие от использования наконечника p1000, он даст вам больше контроля над тем, куда вы направляете наконечник в трубке.

    7. Осыпьте образец (ы). На этом этапе можно использовать изопропанол или хлорид лития.
    8. Изопропанол (вариант A) - Добавьте 1 объем изопропанола к экстрагированному водному слою.Инкубируйте при -20 ° C в течение 1 часа.

      Хлорид лития (вариант B) - LiCl избирательно осаждает РНК, а не ДНК или белки. Добавьте необходимое количество 7,5 М раствора LiCl, чтобы довести концентрацию LiCl в экстрагированном водном слое до 2,5 М. Инкубировать при -20 ° C в течение 1 часа.

      * Pro-Tip * Если вы ожидаете, что ваш выход РНК будет небольшим, гликоген без РНКазы можно использовать в качестве носителя для облегчения осаждения РНК.Это не влияет на качество РНК или последующих приложений.

      * Pro-Tip * Для повышения выхода РНК вместо инкубации при -20 ° C в течение 1 часа вы можете попробовать инкубировать при -80 ° C в течение ночи.

    9. Центрифуга в течение 20 минут при 10 000 x g при 4 ° C и слить супернатант. На дне пробирки должен быть гелеобразный белый осадок общей РНК.
    10. Вымойте РНК, ресуспендируя осадок в 0. 5–1 мл 75% этанола и перемешайте на вортексе в течение нескольких секунд. Центрифуга в течение 5 минут при 10 000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
    11. Удалите как можно больше этанола, не повредив осадок. Сушите гранулы на воздухе в течение 5-10 минут.
      • * Критично * Важно не дать осадку слишком высохнуть перед ресуспендированием, так как это влияет на растворимость РНК.

      * Pro-Tip * Чтобы предотвратить пересушивание, наблюдайте за осадком и осторожно удалите остатки промывки этанолом и добавьте воду, не содержащую РНКаз, или ТЕ, как только вся пробирка высохнет, но пока белый осадок еще виден.

    12. Ресуспендировать осадок РНК в воде, свободной от РНКазы, или ТЕ. Количественно определите и оцените качество ваших образцов РНК с помощью спектрофотометра (например, Nanodrop), агарозного геля или биоанализатора. Для получения дополнительной информации о количественном определении нуклеиновых кислот см. Наш протокол количественного определения ДНК, который можно изменить для РНК. Храните образцы РНК при -80 ° C, чтобы предотвратить деградацию РНК и избежать многократных циклов замораживания-оттаивания.
    13. * Pro-Tip * Чтобы избежать многократных циклов замораживания-оттаивания всего образца РНК, подумайте о том, чтобы сделать аликвоты меньшего размера и хранить их при температуре -80 ° C.


    Вариант № 2 - Протокол TRIzol®
    1. Гомогенизируйте или лизируйте ткани или клетки в TRIzol® или подобном продукте.
      • Для тканей: используйте 1 мл TRIzol® на 100 мг клеток.
      • Для культивированных клеток: используйте 1 мл TRIzol® на 1 X 10 7 клеток.
    2. Дайте образцу (-ам) отстояться при комнатной температуре в течение 5 минут для диссоциации нуклеопротеиновых комплексов.
      • Эффективность выделения вашей РНК будет зависеть от того, насколько эффективен ваш протокол лизиса клеток. Хотя простая гомогенизация эффективна для большинства тканей млекопитающих; Для более выносливых тканей, таких как кости или образцы бактерий / дрожжей / растений, потребуются дополнительные действия для эффективного лизирования открытых клеток.

    3. Извлеките РНК из гомогенизированного образца (ов).Добавьте 0,2 мл хлороформа / изоамилового спирта (49: 1) на 1 мл использованного TRIzol®. Энергично встряхните рукой в ​​течение 10 секунд.
    4. Инкубируйте образец (образцы) в течение 2-3 минут на льду и центрифугируйте в течение 15 минут при 12000 × g при 4 ° C, чтобы отделить РНК от остальной части лизата ткани / клетки.
    5. * Pro-Tip * Вращение образцов при 4 ° C помогает снизить деградацию РНК.Если у вас нет доступа к охлаждаемой центрифуге, вы можете осторожно перенести центрифугу в холодную комнату для центрифугирования. После того, как вы закончите использовать центрифугу, верните это оборудование к комнатной температуре, так как длительное хранение в холодной комнате может повредить его.

    6. С помощью пипетки перенесите верхнюю водную фазу в новую пробирку, свободную от РНКаз.
      • Смесь разделяется на нижний органический слой, межфазный слой и верхний водный слой.При использовании TRIzol® нижний слой будет красно-розового цвета. Следите за тем, чтобы не нарушить и не собрать межфазный слой наконечником дозатора.

      * Pro-Tip * Чтобы собрать как можно больше верхней водной фазы без нарушения межфазного слоя, рассмотрите возможность использования пипетки меньшего объема, например p200, для сбора большей части водной фазы. Возможно, вам придется собрать дважды или больше из одной и той же трубки, но, в отличие от использования наконечника p1000, он даст вам больше контроля над тем, куда вы направляете наконечник в трубке.

    7. Осыпьте образец (ы). На этом этапе можно использовать изопропанол или хлорид лития.
    8. Изопропанол (вариант A) - Добавьте 1 объем изопропанола к экстрагированному водному слою. Инкубируйте при -20 ° C в течение 1 часа.

      Хлорид лития (вариант B) - LiCl избирательно осаждает РНК, а не ДНК или белки.Добавьте необходимое количество 7,5 М раствора LiCl, чтобы довести концентрацию LiCl в экстрагированном водном слое до 2,5 М. Инкубировать при -20 ° C в течение 1 часа.

      * Pro-Tip * Если вы ожидаете, что ваш выход РНК будет небольшим, гликоген без РНКазы можно использовать в качестве носителя для облегчения осаждения РНК. Это не влияет на качество РНК или последующих приложений.

      * Pro-Tip * Для повышения выхода РНК вместо инкубации при -20 ° C в течение 1 часа вы можете попробовать инкубировать при -80 ° C в течение ночи.

    9. Центрифуга в течение 20 минут при 10 000 x g при 4 ° C и слить супернатант. На дне пробирки должен быть гелеобразный белый осадок общей РНК.
    10. Вымойте РНК, ресуспендируя осадок в 0,5–1 мл 75% этанола и перемешивая на вортексе в течение нескольких секунд. Центрифуга в течение 5 минут при 10 000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
    11. Удалите как можно больше этанола, не повредив осадок. Сушите гранулы на воздухе в течение 5-10 минут.
      • * Критично * Важно не дать осадку слишком высохнуть перед ресуспендированием, так как это влияет на растворимость РНК.

      * Pro-Tip * Чтобы предотвратить пересушивание, наблюдайте за осадком и осторожно удалите остатки промывки этанолом и добавьте воду, не содержащую РНКаз, или ТЕ, как только вся пробирка высохнет, но пока белый осадок еще виден.

    12. Ресуспендировать осадок РНК в воде, свободной от РНКазы, или ТЕ. Количественно определите и оцените качество ваших образцов РНК с помощью спектрофотометра (например, Nanodrop), агарозного геля или биоанализатора. Для получения дополнительной информации о количественном определении нуклеиновых кислот см. Наш протокол количественного определения ДНК, который можно модифицировать для РНК. Храните образцы РНК при -80 ° C, чтобы предотвратить деградацию РНК и избежать многократных циклов замораживания-оттаивания.
    13. * Pro-Tip * Чтобы избежать многократных циклов замораживания-оттаивания всего образца РНК, подумайте о том, чтобы сделать аликвоты меньшего размера и хранить их при температуре -80 ° C.

    Вестерн-блот подготовка проб | Abcam

    Буферы для лизиса различаются по своей способности солюбилизировать белки, при этом буферы, содержащие додецилсульфат натрия (SDS) и другие ионные детергенты, считаются самыми жесткими и, следовательно, с наибольшей вероятностью дают самый высокий выход.

    Основное внимание при выборе буфера для лизиса - распознает ли выбранное антитело денатурированные образцы. Если это не так, это будет указано в таблице данных антител, и следует использовать буферы без детергента или с относительно мягкими неионными детергентами (NP-40, Triton X-100).

    9090- плазма
    Расположение белка Рекомендуемый буфер
    Целые клетки NP-40
    Цитоплазматический (растворимый) Связанный трис-HCl
    Triton
    Связанный с мембраной NP-40 или RIPA
    Ядерный RIPA или используйте протокол ядерной фракции *
    Митохондрии RIPA или используйте протокол митохондриальной фракции 909 9047 909 * которые обнаруживаются исключительно или преимущественно в субклеточном месте, будут более обогащены лизатом субклеточной фракции по сравнению с лизатами целых клеток или тканей. Это может быть полезно при попытке получить сигнал для слабо экспрессируемого белка. Пожалуйста, ознакомьтесь с нашими отдельными протоколами субклеточного фракционирования.

    Рецепты буфера для лизиса:

    буфер NP-40

    • 150 мМ хлорид натрия
    • 1,0% NP-40 (Тритон X-100 может быть заменен на NP-40)
    • 50 мМ Трис pH 8,0

    Это популярный буфер для изучения белков, которые являются цитоплазматическими или мембраносвязанными, а также для экстрактов целых клеток.Если есть опасения, что интересующий белок не полностью экстрагируется из нерастворимого материала или агрегатов, буфер RIPA может быть более подходящим, поскольку он содержит ионные детергенты, которые будут более легко переводить белки в раствор.

    Буфер RIPA (буфер для анализа радиоиммунопреципитации)

    • 150 мМ хлорид натрия
    • 1,0% NP-40 или Triton X-100
    • 0,5% дезоксихолат натрия *
    • 0,1% SDS (додецилсульфат натрия)
    • 50 мМ Трис, pH 8. 0

    * Может быть приготовлен как 10% основной раствор, который необходимо защищать от света.

    RIPA-буфер полезен для экстрактов целых клеток и мембраносвязанных белков и может быть предпочтительнее буферов, содержащих только NP-40 или Triton X-100, для экстракции ядерных белков. Это нарушит межбелковые взаимодействия и, следовательно, может быть проблематичным для иммунопреципитации и анализов с пониженным уровнем.

    В случаях, когда важно сохранить белок-белковые взаимодействия или минимизировать денатурацию, следует использовать буфер без ионных детергентов (например, SDS) и в идеале без неионных детергентов (например, Triton X-100).

    Лизис клеток буфером, не содержащим детергентов, достигается механическим сдвигом, часто с помощью гомогенизатора Даунса или пропусканием клеток через наконечник шприца. В этих случаях будет достаточно простого Трис-буфера, но, как отмечалось выше, для высвобождения белков, связанных с мембраной или цитоскелетом, требуются буферы с детергентами.

    Трис-HCl буфер

    Трис-Тритоновый буфер (цитоскелетные белки)

    • 10 мМ Трис, pH 7,4
    • 100 мМ NaCl
    • 1 мМ ЭДТА
    • 1 мМ ЭГТА
    • 1% Тритон X -100
    • 10% глицерин
    • 0.1% SDS
    • 0,5% дезоксихолат

    Все четыре из этих буферов будут храниться при 4 ° C в течение нескольких недель или до года, если их разделить на аликвоты и хранить при -20 ° C.



    Ингибиторы протеаз и фосфатаз

    Как только происходит лизис, начинается протеолиз, дефосфорилирование и денатурация. Эти события можно значительно замедлить, если образцы постоянно держать на льду или при 4 ° C, а соответствующие ингибиторы добавляются свежими в буфер для лизиса.

    Доступны готовые коктейли из ингибиторов от разных поставщиков, но вы можете приготовить свой коктейль.

    треонин
    Ингибитор Ингибитор протеазы /
    фосфатазы
    Ингибирование
    Конечная концентрация в буфере для лизиса Исходная концентрация (хранить при -20 ° C)
    Апротинин Трипсин, химотрипсин 2 мкг / мл Разбавить водой, 10 мг / мл. Не используйте повторно размороженные аликвоты.
    Леупептин Лизосомальный 5–10 мкг / мл Разбавить водой.Не используйте повторно размороженные аликвоты.
    Пепстатин A Аспарагиновые протеазы 1 мкг / мл Развести в метаноле, 1 мМ.
    PMSF Серин, цистеиновые протеазы 1 мМ Развести в этаноле. Вы можете повторно использовать ту же аликвоту.
    EDTA Металлопротеазы, требующие Mg 2+ и Mn 2+ 5 мМ Развести в dH 2 0, 0,5 М.Отрегулируйте pH до 8,0.
    EGTA Металлопротеазы, требующие Ca 2+ 1 мМ Разбавить в dH 2 0, 0,5 М. Отрегулировать pH до 8,0
    Фторид натрия Серин фосфат 5–10 мМ Разбавить водой. Не используйте повторно после разморозки.
    Натрий
    ортованадат
    Тирозинфосфатазы 1 мМ Разбавить водой.Не используйте повторно после разморозки.


    Приготовление ортованадата натрия

    Выполните все шаги в вытяжном шкафу.

    1. Приготовьте 100 мМ раствор в бидистиллированной воде.
    2. Установите pH на 9,0 с помощью HCl.
    3. Кипятить до бесцветного состояния. Сведите к минимуму изменение объема из-за испарения за счет неплотного покрытия.
    4. Охладить до комнатной температуры.
    5. Снова установите pH на 9,0.
    6. Кипятить до бесцветного состояния.
    7. Повторяйте этот цикл, пока pH раствора не останется 9.0 после кипячения и охлаждения.
    8. Довести водой до первоначального объема.
    9. Хранить аликвотами при -20 ° C. Отменить, если образцы пожелтели.


    Приготовление лизата из клеточной культуры
    1. Поместите чашку для клеточных культур на лед и промойте клетки ледяным PBS.
    2. Аспирируйте PBS, затем добавьте ледяной буфер для лизиса (1 мл на 10 7 клеток / 100 мм чашку / 150 см 2 колбы ; 0,5 мл на 5x10 6 клеток / 60 мм чашку / 75 см 2 колбы ).
    3. Соскребите прилипшие клетки с чашки с помощью холодного пластикового скребка для клеток, затем осторожно перенесите суспензию клеток в предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку. В качестве альтернативы клетки можно трипсинизировать и промывать PBS перед ресуспендированием в буфере для лизиса в микроцентрифужной пробирке.
    4. Поддерживайте постоянное перемешивание в течение 30 минут при 4 ° C.
    5. Центрифуга в микроцентрифуге при 4 ° C. Возможно, вам придется изменить силу и время центрифугирования в зависимости от типа клеток; Ориентировочное значение - 20 минут при 12000 об / мин, но это должно быть определено для вашего эксперимента (например,грамм. лейкоциты нуждаются в очень легком центрифугировании).
    6. Осторожно извлеките пробирки из центрифуги и поместите на лед, аспирируйте супернатант и поместите в свежую пробирку, хранящуюся на льду, и выбросьте осадок.


    Приготовление лизата из тканей
    1. Рассеките интересующую ткань чистыми инструментами, желательно на льду, и как можно быстрее, чтобы предотвратить разрушение протеазами.
    2. Поместите ткань в микроцентрифужные пробирки с круглым дном или пробирки Эппендорфа и погрузите в жидкий азот, чтобы быстро заморозить.Храните образцы при -80 ° C для дальнейшего использования или храните на льду для немедленной гомогенизации.
    3. Для кусочка ткани массой ~ 5 мг быстро добавьте в пробирку ~ 300 мкл ледяного буфера для лизиса, гомогенизируйте с помощью электрического гомогенизатора, дважды промойте лезвие еще 2 х 300 мкл буфера для лизиса, затем поддерживайте постоянное перемешивание в течение 2 дней. ч при 4 ° C (например, поместите на орбитальный шейкер в холодильник). Объемы буфера для лизиса должны определяться в зависимости от количества присутствующей ткани. Белковый экстракт не следует слишком разбавлять, чтобы избежать потери белка и больших объемов образцов, которые необходимо загрузить в гели. Минимальная рекомендуемая концентрация - 0,1 мг / мл, оптимальная концентрация - 1–5 мг / мл).
    4. Центрифуга в микроцентрифуге в течение 20 минут при 12000 об / мин при 4 ° C. Осторожно извлеките пробирки из центрифуги и поместите на лед, аспирируйте супернатант и поместите в свежую пробирку на льду. Выбросьте гранулы.


    Определение концентрации белка
    1. Выполните анализ Брэдфорда, анализ Лоури или анализ бицинхониновой кислоты (BCA). Бычий сывороточный альбумин (БСА) - часто используемый стандарт белка.
    2. После того, как вы определили концентрацию каждого образца, вы можете заморозить его при -20 ° C или -80 ° C для дальнейшего использования или подготовки к иммунопреципитации или для загрузки в гель.


    Подготовка образцов для загрузки в гели


    Денатурированные, восстановленные образцы

    Антитела обычно распознают небольшую часть интересующего белка (называемого эпитопом), и этот домен может находиться в трехмерной конформации белка. Чтобы обеспечить доступ антитела к этой части, необходимо развернуть белок, т.е. денатурировать его.

    Для денатурирования используйте загрузочный буфер с анионным детергентом додецилсульфатом натрия (SDS) и кипятите смесь при 95–100 ° C в течение 5 минут. Нагревание при 70 ° C в течение 5–10 мин также допустимо и может быть предпочтительным при изучении многопроходных мембранных белков. Они имеют тенденцию к агрегированию при кипячении, и агрегаты могут не входить в гель эффективно.

    Стандартный буфер загрузки называется 2X буфером Лэммли (Laemmli UK, 1970.Расщепление структурных белков при сборке головки батериофага Т4. Природа, 227, 680–5). Он также может быть изготовлен с 4-кратной и 6-кратной концентрацией, чтобы минимизировать разбавление образцов. 2X следует смешать с образцом в соотношении 1: 1.


    Рецепт 2x буфера Лэммли

    • 4% SDS
    • 10% 2-меркаптоэтанол
    • 20% глицерин
    • 0,004% бромфеноловый синий
    • 0,125 M Трис HCl
    • Проверьте pH и доведите его до pH 6,8

    Когда SDS используется с белками, все белки становятся отрицательно заряженными из-за их присоединения к анионам SDS. SDS связывается с белками довольно специфично в массовом соотношении 1,4: 1. При этом SDS наделяет полипептид отрицательным зарядом пропорционально его длине. Денатурированные полипептиды становятся стержнями отрицательного заряда с равными плотностями заряда на единицу длины. Следовательно, миграция определяется молекулярной массой, а не собственным зарядом полипептида.

    Степень SDS важна для высококачественного разделения белков: окрашенный белком фон вдоль отдельных участков геля с нечеткими или слегка различимыми полосами белка указывает на старый или некачественный SDS.Включение 2-меркаптоэтанола или дитиотреитола в буфер снижает дисульфидные мостики, что необходимо для разделения по размеру.

    Глицерин добавляется в буфер для загрузки, чтобы увеличить плотность загружаемого образца и, следовательно, удерживать образец на дне лунки, ограничивая переполнение и неравномерную загрузку геля.

    Для визуализации миграции белков обычно включают небольшую молекулу анионного красителя в загрузочный буфер (например, бромфеноловый синий). Поскольку краситель является анионным и небольшим, он будет мигрировать быстрее всех из компонентов смеси, подлежащей разделению, и создает фронт миграции для отслеживания процесса разделения.

    Во время обработки образца белка образец следует перемешать встряхиванием до и после стадии нагревания для наилучшего разрешения.

    Нативные и невосстановленные образцы

    В качестве альтернативы антитело может распознавать эпитоп, состоящий из несмежных аминокислот. Хотя аминокислоты эпитопа отделены друг от друга в первичной последовательности, они близки друг к другу в сложенной трехмерной структуре белка, и антитело будет распознавать эпитоп только в том виде, в каком он существует на поверхности складчатая конструкция.

    В этих обстоятельствах важно проводить вестерн-блоттинг в неденатурирующих условиях, и это будет указано в таблице данных в разделе приложений. В общем, неденатурирующие условия просто означают исключение SDS из буферов для образцов и миграции и без нагревания образцов.

    Некоторые антитела распознают белок только в его невосстановленной форме (особенно по остаткам цистеина), и восстанавливающие агенты β-меркаптоэтанол и DTT должны быть исключены из загрузочного буфера и буфера для миграции.

    6 , естественный , с SDS , с SDS
    Состояние белка Состояние геля Загрузочный буфер Миграционный буфер
    Восстановленный, денатурированный Восстановленный и денатурирующий С 2-меркаптоэтанолом или DTTced и SDS Восстановительный и нативный С 2-меркаптоэтанолом или DTT и SDS Нет SDS
    Окисленный, денатурированный Невосстанавливающий и денатурирующий Без 2-меркаптоэтанола или DT906, с SDS
    Окисленный, нативный Невосстанавливающий и нативный Без 2-меркаптоэтанола или DTT, с SDS Без SDS

    Практическое правило: уменьшайте и денатурируйте, если в таблице данных не указано иное.

    Abcam предоставляет протоколы «AS-IS» на основе экспериментов в лабораториях Abcam с использованием реагентов и продуктов Abcam; ваши результаты при использовании протоколов вне этих условий могут отличаться.

    Безопасный протокол экстракции ДНК Подходит для изучения ...

    Абстрактные

    Мы представляем безопасный и недорогой метод, подходящий для выделения ДНК из образцов мицелия и тканей деревьев. После подготовки пробы экстракция занимает около 60 мин.Эффективность метода была проверена путем извлечения ДНК из различных образцов тканей деревьев и из мицелия, выращенного на твердых и жидких средах. ДНК выделяли из ювенильного и зрелого материала-хозяина ( Picea abies , Populus trichocarpa , Pseudotsuga menziesii ), инфицированных различными патогенами ( Heterobasidion annosum , Heterobasidion parviporum , . Кроме того, ДНК была выделена из чистых культур патогенов и нескольких эндофитных грибов. Успешность ПЦР составила 100% для образцов молодого тополя и грибов и 48-72% для образцов хвойных и зрелых лиственных растений. Мы рекомендуем использовать 10-50 мг свежего образца для достижения наилучших результатов. Этот метод предлагает безопасную и недорогую альтернативу экстракции ДНК для изучения взаимодействий древесных грибов и является потенциальным ресурсом для учебных целей.

    Ключевые слова: экстракция ДНК, ДНК растений, ДНК грибов, Патология леса, Взаимодействие растений и микробов, Низкая стоимость, Нетоксичность

    Предпосылки

    Экстракция ДНК является центральным методом исследования взаимодействия растений и микробов и для целей диагностики болезней растений.Обилие взаимодействий между растениями и грибами отражается в большом количестве культивируемых штаммов, выделенных из образцов растений (Arnold et al. , 2001; Higgins et al. , 2007; Terhonen et al. , 2011). Обработка большого количества образцов для стандартных реакций ПЦР с помощью коммерческих наборов может быть дорогостоящей. Кроме того, потребность в опасных химических веществах, таких как 2-меркаптоэтанол, хлороформ или фенол, может ограничивать пригодность протоколов для целей обучения и подготовки.

    Из-за высокого содержания вторичных метаболитов многие образцы растений, и в частности ткани деревьев, могут создавать проблемы для экстракции нуклеиновых кислот. В текущих протоколах экстракции ДНК из непокорных тканей растений используются органические растворители (хлороформ, 2-меркаптоэтанол) или поверхностно-активные вещества (, например, , цетилтриметиламмонийбромид) (Porebski et al. , 1997; Chiong et al. , 2017; Yi и др. , 2018). Несмотря на их преимущества для извлечения ДНК, эти химические вещества представляют опасность для здоровья пользователей и окружающей среды.Существует несколько версий недорогих, быстрых и низкоуровневых протоколов экстракции ДНК для мицелия (Chi et al. , 2009), тканей ювенильных растений (Edwards et al. , 1991; Lu, 2011), зерна (Saini et al. , 1999) и высушенные ткани растений (Chabi Sika et al. , 2015). Однако эти методы не применялись для изучения взаимодействий между древесными грибами и грибами, и много раз они были протестированы только на ограниченном количестве типов образцов. Нашей целью было разработать и протестировать безопасный и недорогой протокол выделения ДНК, который подходит для выделения ДНК из различных тканей деревьев и образцов грибов, связанных с деревьями.После подготовки пробы экстракция занимает около 60 мин. Выделенная ДНК подходит для последующих приложений на основе ПЦР, таких как обнаружение патогенов на основе ДНК с помощью видоспецифичных праймеров. Благодаря своей безопасности и доступности этот метод также является потенциальным ресурсом для обучения и тренингов.

    Материалы и реагенты

    1. Стандартные материалы и реагенты
      1. Стерильные микроцентрифужные пробирки, 1. 5 или 2,0 мл
      2. Наконечники для микропипеток: 10, 200, 1000 мкл
      3. Miracloth (Calbiochem, , например, , VWR, каталожный номер: 475855-1)
      4. Образцы растений или грибов
      5. Очищенная (RO, DI, MilliQ, Nanopure) и стерилизованная вода
      6. ДНК-лестница из 100 п.н. (Jena Bioscience, каталожный номер: M-214S)
      7. ДНК-лестница размером 1 т.п.н. (New England Biolabs, каталожный номер: N0552)
      8. NaCl
      9. KCl
      10. EDTA
      11. SDS
      12. Трис (pH 7.5)
      13. Поливинипирролидон (PVP, CAS 900-39-8, FW 40,000, , например, , Caisson Labs, номер по каталогу: P071-100GM)
      14. Изопропанол
      15. Этанол (EtOH)
      16. Буфер для экстракции (см. Рецепты)
      17. Промывочный буфер (см. Рецепты)
    2. Специальные материалы и реагенты для различных вариантов гомогенизации тканей B. Специальные материалы и реагенты для различных вариантов гомогенизации тканей
      1. Вариант 1 для мягких тканей листа и мицелия: без специальных материалов или реагентов
      2. Вариант 2 для различных тканей растений и мицелия более 100 мг: жидкий азот
      3. Вариант 3 для различных тканей и мицелия растений, менее 100 мг: Пробирки для взбивания шариков ( e. грамм. , Lysing Matrix I, MP Biomedicals, номер по каталогу: 1160-CF)
        Примечание. Чтобы уменьшить количество пластиковых отходов и сэкономить на расходах, пробирки для взбивания шариков можно мыть и использовать повторно (см. Примечания).

    Оборудование

    1. Стандартное оборудование
      1. Скальпели
      2. Пинцет
      3. Шпатели
      4. Весы (, например, , Metler-Toledo, модель: ML54T)
      5. Микропипетки: 1, 10, 100, 1000 мкл.
      6. Тепловой блок ( e.грамм. , VWR, каталожный номер: 12621-096)
      7. Vortex ( например, , VWR, каталожный номер: 10153-838)
      8. Микроцентрифуга (, например, , Eppendorf, модель: 5424)
      9. Один из следующих способов нагрева воды: микроволновая печь, водяная баня (, например, , VWR, модель: WB05) или горячая плита (, например, , VWR, каталожный номер: NO97042-642)
      10. Морозильная камера, -20 ° C или -80 ° C
    2. Специальное оборудование для различных вариантов гомогенизации тканей
      1. Вариант 1 для мягких тканей листа и мицелия: без специального оборудования
      2. Вариант 2 для различных тканей растений и мицелия, более 100 мг:
        Дьюар для жидкого азота
        Керамические ступки и пестики
      3. Вариант 3 для различных растительных тканей и мицелия, менее 100 мг:
        Bead beater ( e. грамм. , Biospec, модель: Mini-Beadbeater 16, каталожный номер: 607 / 607EUR)
      4. Для отбора проб ксилемной ткани взрослых деревьев: долото (, например, , Grainger, каталожный номер: 2AJA6) и молоток (, например, , Grainger, каталожный номер: 4YR61), разделочная доска

    Процедура

    1. Подготовка образца: взвесьте 10-50 мг образца (см. Рисунок 1).
      1. Растительная ткань: используйте пинцет и скальпель, чтобы разрезать образец на кусочки размером примерно 5 × 5 × 1 мм.Более мелкие и тонкие кусочки дают лучшее качество пробы.
      2. Мицелий: используйте скальпель / шпатель, чтобы соскоблить мицелий с поверхности чашек Петри, или используйте шпатель для сбора мицелия из жидкой культуры.
      3. Ткань ксилемы зрелых деревьев: поместите образец древесины на разделочную доску. Используйте долото и молоток, чтобы собрать кусочки ткани ксилемы. Нарежьте кусочки 5 × 5 × 1 мм скальпелем и шпателем.
      Примечание. Для мицелия минимизируйте количество агара для более высокого качества ДНК.


      Рис. 1. Примеры размеров образцов для выделения ДНК. A. Свежая флоэма с 8-недельных деревьев Populus trichocarpa . Вес 20 мг. Б. Свежая флоэма со зрелых деревьев P. trichocarpa . Вес 15 мг. C. Свежий мицелий Leptographium wagnerii , собранный из культур жидкого экстракта солода. Вес 20 мг. Интервал между вертикальными линиями = 1 мм.

    2. Гомогенизируйте образец и добавьте буфер для экстракции
      В зависимости от типа образца доступны три варианта.Полная гомогенизация не требуется.
      1. Вариант 1: мицелий и мягкая ткань листа
        1. Поместите образец в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 или 2,0 мл.
        2. Добавьте 1 мл буфера для экстракции.
        3. Тщательно перемешайте на вортексе в течение 20 с.
        4. Переходите к процедуре C.
      2. Вариант 2: различные ткани растений и мицелий ≥ 50 мг:
        1. Измельчите образец в ступке с пестиком и жидким азотом.
        2. Перенесите 10-50 мг гомогенизированной пробы шпателем или декантированием в микроцентрифужную пробирку на 1,5 / 2,0 мл.
        3. Добавьте 1 мл буфера для экстракции.
        4. Тщательно перемешайте на вортексе в течение 20 с.
        5. Переходите к процедуре C.
      3. Вариант 3: различные ткани растений и мицелий ≤ 50 мг:
        1. Перенесите образец в колотушку объемом 2,0 мл.
        2. Добавьте 1 мл буфера для экстракции.
        3. Обработка в миксере в течение 20 с.
        4. Переходите к процедуре C.
        Примечание. Используйте 1 мл буфера для экстракции на 50 мг или меньше ткани. Чтобы обеспечить достаточное перемешивание, используйте только 1 мл буфера на пробирку.
    3. Извлечение ДНК
      1. Нагрейте промывочный буфер на водяной бане или в стакане с теплой водой (примерно 65 ° C), чтобы растворить осадок. Температура не критична, пока не останется осадок.Перемешать переворачиванием.
      2. Лизис и удаление остатков: инкубируйте образцы в буфере для экстракции при 65 ° C в течение 15 минут. Один раз перемешайте на вортексе во время инкубации. Центрифуга при 6000 x g в течение 10 мин.
      3. Удаление мусора: после центрифугирования перенесите ок. 0,5 объема супернатанта в новую пробирку. Добавьте 1 объем предварительно нагретого промывочного буфера и перемешайте образцы на вортексе в течение 20 с. Центрифуга при 21000 x g в течение 10 мин.
        Примечание: полное удаление мусора не является критическим при пипетировании надосадочной жидкости.
      4. Осадки: Перенос ок. 0,7 объема надосадочной жидкости в новую пробирку, добавляют 0,85 объема изопропанола (комнатная температура) и перемешивают переворачиванием в течение 20 с. Центрифуга при 21000 x g в течение 10 мин.
        Примечание. Сведите к минимуму перенос любого мусора при дозировании надосадочной жидкости.
      5. Вымойте осадок: слейте супернатант и удалите оставшийся супернатант, постучав пробирками вверх дном о бумажное полотенце. Добавьте 200 мкл 70% этанола и центрифугируйте при 21000 x g в течение 5 мин.
        Примечание. При правильном обращении с отходами изопропанола соблюдайте местные правила.
      6. Высушите гранулу: Добавьте пипеткой этанол. Оставьте крышки открытыми и высушите гранулы в термоблоке при 65 ° C в течение 5 минут.
        Примечание. Для более быстрого высыхания удалите как можно больше этанола.
      7. Ресуспензия: растворяют осадок в 20-50 мкл буфера ТЕ или воды, свободной от нуклеаз. При необходимости перемешайте на вортексе для растворения и ненадолго центрифугируйте, чтобы собрать капли на дно пробирки.Храните образцы ДНК при -20 ° C или -80 ° C до использования.
        Примечание. Если осадок ДНК не является бесцветным или белым после промывки 70% этанолом, добавьте 20-50 мкл буфера ТЕ или воды, свободной от нуклеаз, для ресуспендирования ДНК, не нарушая осадок. Осторожно внесите жидкость в пробирку несколько раз и соберите супернатант в виде ДНК для последующих процессов. Держите осадок до количественного определения ДНК. Используйте ДНК для обнаружения на основе ПЦР или храните в морозильной камере до использования.

    Анализ данных

    Анализ производительности протокола:

    1. Материал растений и грибов, используемый для экстракции ДНК
      Чтобы проверить пригодность протокола, мы экстрагировали ДНК из искусственно инокулированных деревьев, естественно инфицированных деревьев и мицелия (таблица 1).Искусственно инокулированные образцы включали 8-недельные растения Populus trichocarpa , инокулированные распылением Sphaerulina musiva (LeBoldus et al. , 2010; Abraham et al. , 2018), и 3-летние Picea abies растения, инокулированные Heterobasidion sp. (Terhonen и др. , 2019). Естественно инфицированные образцы растений включали стеблевые язвы на зрелых деревьях P. trichocarpa , вызванные инфекцией S. musiva , и зрелые корни Pseudotsuga menziesii , инфицированные Leptographium wageneri .Некротические или обесцвеченные образцы флоэмы или ксилемы с 10–380 мг ткани (в среднем 86 мг) использовали для экстракции ДНК. Для каждого образца использовали 1 мл буфера для экстракции независимо от веса образца. ДНК грибов выделяли из мицелия, полученного из чистых культур (таблица 1). В качестве твердой среды использовали либо агар с солодовым экстрактом (2% солодовый экстракт, 2% агар), либо агар KV8 (18% сок V8, 0,2% CaCO 3 , 2% агар). Культуры на твердой среде выращивали при комнатной температуре. Для жидкой среды, либо среда солодового экстракта (2% солодового экстракта), либо среда KV8 (18% сока V8, 0.2% CaCO 3 ) (таблица 1). Культуры в жидкой среде выращивали при комнатной температуре на роторном шейкере (100-150 об / мин). Мицелий собирали из жидкой среды фильтрованием через Miracloth (Calbiochem) и промывали деионизированной водой.
    2. Оценка качества образца ДНК.
      концентрации ДНК были измерены с помощью Nanodrop, Nanophotometer или Qubit. Для оценки качества образцов использовались ПЦР, количественная ПЦР в реальном времени (qPCR), электрофорез в агарозном геле (рис. 2) и ITS-секвенирование грибов.Для ПЦР и количественной ПЦР отрицательные контроли без матрицы и положительные контроли-матрицы включали в каждый прогон для оценки надежности обнаружения.
      Для образцов P. trichocarpa , которые были инокулированы или естественным образом инфицированы S. musiva , мы использовали анализ, специфичный для патогена хозяина (Abraham et al. , 2018). Для обнаружения видов Heterobasidion из инокулированных образцов древесины использовали видоспецифичные праймеры для H. annosum и H. parviporum (Hantula and Vainio, 2003) (Terhonen et al., 2019). Для обнаружения L. wageneri из корней P. pseudotsuga и культур грибов мы использовали праймеры, специфичные для Leptographium (Schweigkofler et al. , 2005). Праймеры для P. menziesii (Winton et al. , 2002) использовали для отличия ингибирования ПЦР от отрицательных образцов и для амплификации ДНК, экстрагированной из хвои пихты Дугласа.
      образцов ДНК из культур Diplodia sapinea были амплифицированы с помощью праймеров, нацеленных на большую субъединицу ядра, фактор элонгации и области кальмодулина (Vilgalys and Hester, 1990; Carbone and Kohn, 1999; Grünig et al., 2007; Nelsen et al. , 2011). Кроме того, ДНК из D. sapinea и грибковых эндофитов была амплифицирована с праймерами ITS1-F и ITS4 для внутренней транскрибируемой спейсерной области рибосомы гриба (White et al. , 1990; Gardes and Bruns, 1993). Условия ПЦР указаны в Таблице 2, а последовательности праймеров - в Таблице 3. Все ампликоны ПЦР визуализировали в УФ-свете на 1,5% агарозных гелях с красителями нуклеиновой кислоты StainIN TM RED или GelRed TM .Для видов грибов, используемых для секвенирования, продукты ПЦР очищали и секвенировали с использованием соответствующих праймеров (таблица 1) в Microsynth SEQLAB (Гёттинген, Германия).
      Влияние потенциальных ингибиторов ПЦР в образцах ДНК на обнаружение мишеней оценивали с помощью мультиплексного протокола кПЦР Taqman (Abraham et al. , 2018). ДНК, выделенная с помощью коммерческого набора (DNeasy Plant Mini, Qiagen) из сопоставимых образцов тканей, использовалась в качестве эталона для образцов с низким содержанием ингибиторов. Были приготовлены серии семиточечных разведений для P.trichocarpa (серия 10-кратных разведений, 60-6 × 10 -4 нг / мкл) и образцов ДНК S. musiva (серия 5-кратных разведений, 50-3,2 × 10 -3 нг / мкл) (Abraham et al. , 2018), извлеченные разработанным методом и коммерческим набором. Значения цикла количественной оценки (Cq) для образцов из двух методов экстракции сравнивали, чтобы оценить влияние потенциальных ингибиторов ПЦР на обнаружение мишени.


      Рисунок 2. Примеры образцов ДНК, извлеченных по разработанному протоколу. A. Три образца ДНК Diplodia sapinea , экстрагированные из мицелия, выращенного на агаре с солодовым экстрактом (MEA). Дорожки 1, 3 и 5: 50-500 нг ДНК. Дорожки 2, 4 и 6: 10-кратные разведения образцов в дорожках 1, 3 и 5. Гель: 2,0% агароза в 1 × TAE, 100 В, 35 мин. Лэддер: ДНК-лестница 100 п.н. B. ДНК, выделенная из мицелия Leptographium, wagnerii из жидкого солодового экстракта (дорожка 1), мицелия Sphaerulina musiva , выращенного на агаре KV8 (дорожка 2), S. musiva , выращенного в жидкой среде KV8 (3), свежая флоэма тополя (дорожка 4), свежие листья тополя (дорожка 5), зрелая ксилема пихты Дугласа (дорожка 6) и свежие иглы дугласовой пихты (дорожка 7).Дорожки 1-4 и 6-7: 20-100 нг ДНК. Дорожка 5: 500 нг ДНК. Гель: 1% агароза в 1 × TAE, 120 В, 70 мин. Лестница: ДНК-лестница размером 1 т.п.н.

      Таблица 1. Типы образцов, извлеченные с помощью протокола, показатели успешности ПЦР (%) и количество секвенированных образцов
      a Gardes and Bruns 1993, White et al. , 1990
      b Grünig et al. , 2007
      c Carbone and Kohn, 1999
      d Vilgalys and Hester, 1990, Nelsen et al. , 2011

      Таблица 2.Условия ПЦР и праймеры, использованные для проверки качества образцов

      a Carbone and Kohn 1999, Grünig et al. , 2007
      b Carbone and Kohn, 1999
      c Vilgalys and Hester, 1990, Nelsen et al. , 2011
      d Gardes and Brunns, 1993; Уайт и др. , 1990
      e Hantula and Vainio, 2003
      f Schweigkofler et al. , 2005
      g Abraham et al., 2018
      h Winton et al. , 2002

      Таблица 3. Последовательности праймеров, используемые в реакциях ПЦР.

      a Carbone and Kohn, 1999, Grünig et al. , 2007
      b Carbone and Kohn, 1999
      c Vilgalys and Hester, 1990, Nelsen et al. , 2011
      d Gardes and Brunns, 1993, White et al. , 1990
      e Hantula and Vainio, 2003
      f Schweigkofler et al. , 2005
      g Abraham et al. , 2018
      h Winton et al. , 2002 г.
    3. Анализ данных
      Анализ данных проводился в R версии 3.6.1. Влияние ингибиторов ПЦР на значения цикла количественной оценки (C q ) оценивали с использованием ANOVA с последующим тестом HSD Тьюки (рис. 3A). Мы визуализировали влияние веса образца, концентрации ДНК и чистоты образца (A 260/280 и A 260/230 ) на успех ПЦР, построив график результатов анализа главных компонентов (PCA) для образцов растений и грибов ( Рисунки 3Б-3D).Результаты PCA были визуализированы с помощью пакета R package factoextra (Kassambara and Mundt, 2017). Для образцов P. abies в модель также была включена длина некроза. Отдельные PCA были рассчитаны для образцов P. trichocarpa (n = 85), образцов P. abies (n = 48) и образцов грибов (n = 129). Различия в свойствах матрицы между неудачными и успешными реакциями ПЦР в пределах одного и того же типа образца сравнивали с помощью t-теста для двух выборок. При необходимости данные были нормализованы с помощью лог-преобразований.
    4. Выполнение протокола
      Все образцы ДНК, извлеченные из 8-недельной флоэмы P. trichocarpa
      , инокулированной S. musiva , были ПЦР-положительными в отношении патогена (Таблица 1). ПЦР-амплификация работала для всех образцов ДНК грибов, а продукты ПЦР подходили для ITS-секвенирования грибов. Для сравнения, процент успеха ПЦР был ниже для образцов ДНК, экстрагированных из естественно инфицированных зрелых образцов P. trichocarpa (72%), инокулированных 3-летних P.abies образец (48%) и естественно инфицированные зрелые корней P. menziesii (60%) (Таблица 1). Протокол экстракции дает общую ДНК с большинством фрагментов размером более 10 т.п.н. (рис. 2). Образцы стабильны не менее 2 лет при -20 ° C. Частичная фрагментация ДНК (рис. 2В) не повлияла на производительность ПЦР.
      На основании сравнения значений C q для образцов ДНК, экстрагированных с помощью коммерческого набора, экстрагированные образцы ДНК могут содержать ингибиторы, которые могут влиять на точность количественного определения цели с помощью qPCR (рис. 3A).Значения Cq были ниже для трех самых высоких разведений ( P <0,040). После 1000-кратного разбавления метод экстракции не повлиял на количественное определение. Стандартные кривые, полученные из образцов ДНК, экстрагированных с помощью протокола, имели более низкую эффективность амплификации по сравнению с коммерческим набором (рис. 1А). Возможно, что протокол qPCR в Abraham et al. (2018) не оптимален для образцов, извлеченных с помощью разработанного протокола экстракции ДНК. Однако способ извлечения не повлиял на обнаружение цели.


      Рис. 3. Сравнительный анализ qPCR для оценки присутствия ингибиторов образца (A) и анализ главных компонентов для визуализации свойств образца в образцах Populus trichocarpa образцов (B), молодые Picea abies образцов (C) и грибов (D)

      Мы исследовали связь свойств образца ДНК с успехом ПЦР, визуализировав результаты анализа главных компонентов (PCA). Два первых главных компонента (PC) объясняют 68-87% общей вариации. Значения A 260/280 и A 260/230 объясняют большую часть вариаций вдоль PC1 для P. trichocarpa , P. abies и образцов ДНК грибов (вклад в PC1 составляет 55%, 85% и 75%). вариации соответственно) (Рисунки 1B-1D). Для P. trichocarpa образцы разделились на две группы по обе стороны от вертикальной оси PC2 (рис. 3B). Для образцов с левой стороны от оси PC2 показатель успешности ПЦР составил 100%, а чистота образца была относительно высокой (рис. 3В).
      Вес образца объяснил 55% и 40% вариации по PC2 у P. trichocarpa и P. abies соответственно. Больший исходный вес образцов был связан с более низкой вероятностью успеха ПЦР для образцов ДНК зрелого тополя и молодой ели европейской (таблица 4). Среди 34 образцов зрелых тополей, которые сгруппировались справа от оси PC2 (рис. 3B), исходные веса образцов и концентрации ДНК были выше для неудачных реакций ПЦР (t = 2,882, P = 0. 007 и t = 2,195, P = 0,035 соответственно). Точно так же исходные массы образцов и концентрации ДНК были выше для образцов P. abies , не прошедших ПЦР-амплификацию (t = 1,9511, P = 0,057 и t = 2,060, P = 0,045, соответственно). Для образцов зрелого тополя неудача ПЦР как для амплификации хозяина, так и для патогена, несмотря на более высокую концентрацию ДНК, вероятно, связана с низким качеством матрицы в сочетании с высоким содержанием полифенолов в образцах зрелой ткани коры.Для ели обыкновенной неудача ПЦР для амплификации патогена, несмотря на высокую концентрацию ДНК и достаточное качество матрицы, вероятно, объясняется низким количеством ДНК патогена в менее колонизированных образцах. С другой стороны, высокое содержание фенолов в сильно колонизированных образцах могло препятствовать обнаружению патогенов, поскольку увеличение продолжительности некроза было связано с более низким успехом ПЦР в образцах ели европейской. Это указывает на то, что образцы ДНК, выделенные из образцов тканей деревьев с высоким содержанием лигнина или других полифенольных соединений, могут иметь более низкие показатели успешности ПЦР.
      Образцы ДНК грибов сильно варьировались на основании значений A 260/230 и A 260/280 (75% вариации на PC1, рисунок 3D). Образцы ДНК, экстрагированные из мицелия, выращенного в жидких культурах, обычно имели более высокую степень чистоты по сравнению с образцами грибов с агаром (таблица 4). Исходя из этого, мы рекомендуем минимизировать количество агара в образцах грибов, используемых для экстракции ДНК. Несмотря на большие различия в чистоте образцов, ПЦР-амплификация была успешной для всех образцов ДНК грибов.

      Таблица 4. Вес образца, концентрации ДНК и значения оптической плотности ДНК для различных типов образцов ДНК, экстрагированных по протоколу. Указаны медиана, минимальное и максимальное значения.

      * ПЦР хозяина и патогена не удалась
      ** Тестировалась только ПЦР на патоген

    Примечания

    1. Количество буфера для экстракции и масса образца
      Мы рекомендуем использовать 1 мл буфера для экстракции на 50 мг или меньше ткани растений или грибов. Небольшой объем буфера относительно экстрагированной ткани может отрицательно сказаться на успехе ПЦР.
    2. Растворение осадка
      Если осадок ДНК не является бесцветным или белым после промывки 70% этанолом, добавьте 20-50 мкл буфера ТЕ или воды, не содержащей нуклеаз, для ресуспендирования ДНК, не нарушая осадок. Осторожно внесите жидкость в пробирку несколько раз и соберите супернатант в виде ДНК для последующих процессов. Держите осадок до количественного определения ДНК. Используйте ДНК для обнаружения на основе ПЦР или храните в морозильной камере до использования.
    3. Повторное использование пробирок для взбивания шариков
      Для снижения затрат и пластиковых отходов пробирки для взбивания шариков можно мыть, обрабатывать отбеливателем для разложения ДНК, автоклавировать и повторно использовать.Разложите шарики, колпачки и пробирки по отдельным контейнерам. Наполните емкости теплой мыльной водой, встряхивайте 5 мин и слейте мыльную воду. Промойте водопроводной водой, пока сток не станет прозрачным. Встряхните пробирки и крышки, чтобы слить оставшуюся водопроводную воду. Дважды промыть деионизированной водой. Чтобы удалить оставшуюся ДНК, замочите компоненты на 1 час в 3% -ном растворе NaOCl (1: 1 раствор с промышленным отбеливателем и деионизированной водой) (Kemp and Smith 2005). Дважды промойте водопроводной водой, а затем дважды промойте деионизированной водой. Дайте компонентам трубки высохнуть в течение ночи или сушите в духовке.Когда компоненты высохнут, соберите пробирки и автоклав при 121 ° C в течение 30 мин.

    Рецепты

    1. Буфер для экстракции
      1 М NaCl
      100 мМ Трис HCl
      10 мМ ЭДТА
      2% ПВП
      1. Смешайте все ингредиенты в стакане на горячей плите для перемешивания
      2. Заполнить до желаемого объема стерильной очищенной водой
      3. Нагрейте раствор до растворения ПВП.
    2. Промывочный буфер
      1% SDS
      0.5 M KCl или NaCl
      1. Смешайте все ингредиенты в стакане на горячей плите для перемешивания
      2. Заполнить до желаемого объема стерильной очищенной водой
      3. Раствор нагревают до тех пор, пока не перестанут появляться осадки
      4. Перед использованием нагрейте промывочный буфер, чтобы растворить осадок.

    Благодарности

    Это исследование было поддержано Управлением науки Министерства энергетики, Офисом биологических и экологических исследований (BER), грант No.DE-SC0018196, и при финансовой поддержке факультета лесных наук и экологии лесов Геттингенского университета. Jumoke Aduke Babalola и David Robert Rscuoi, Университет Геттингена, получили высокую оценку за их вклад в экспериментальную установку для экстракции ДНК и ПЦР. Благодарим доктора Патрика Беннета за предоставление штаммов L. wagenerii и естественно инфицированных образцов корней пихты Дугласа, а доктора Келси Сондрели за предоставление зрелых образцов P. trichocarpa , естественно инфицированных S.Мусива .

    Конкурирующие интересы

    Никаких конкурирующих интересов не заявлено.

    Рекомендации

    1. Абрахам, Н. Д., Читрампал, П., Керио, С. и Ле Болдус, Дж. М. (2018). Мультиплексная КПЦР для обнаружения и количественного определения Sphaerulina musiva в стеблях Populus . Завод Патол 67 (9): 1874-1882.
    2. Арнольд А.Э., Мейнард З. и Гилберт Г.С. (2001). Грибковые эндофиты двудольных неотропических деревьев: закономерности обилия и разнообразия. Mycol Res 105 (12): 1502-1507.
    3. Карбоне И. и Кон Л. М. (1999). Метод создания наборов праймеров для исследований видообразования нитчатых аскомицетов. Mycologia 91 (3): 553-556.
    4. Чаби Сика, К., Кефела, Т., Адукону-Сагбаджа, Х., Ахотон, Л., Саиду, А., Баба-Мусса, Л., Джно Батист, Л., Коткони, С.О, и Гачомо, Э.В. (2015 г. ). Простой и эффективный протокол выделения геномной ДНК для крупномасштабного генетического анализа биологических систем растений. Plant Gene 1: 43-45.
    5. Чи, М. Х., Парк, С. Ю. и Ли, Ю. Х. (2009). Быстрый и безопасный метод выделения ДНК грибов. Plant Pathol J 25: 108-111.
    6. Чионг, К. Т., Дамай, М. Б., Падилья, С. С., Авила, К. А., Пант, С. Р., Мандади, К. К., Рамос, Н. Р., Карвалью, Д. В. и Мирков, Т. Е. (2017). Воспроизводимый препарат геномной ДНК из различных видов сельскохозяйственных культур для молекулярно-генетических применений. Растительные методы 13 (1): 106.
    7. Эдвардс, К., Джонстон, К. и Томпсон, К. (1991). Простой и быстрый метод подготовки геномной ДНК растений для ПЦР-анализа. Nucleic Acids Res 19 (6): 1349.
    8. Гардес, М. и Брунс, Т. Д. (1993). Праймеры ITS с повышенной специфичностью для базидиомицетов - применение для идентификации микоризы и ржавчины. Мол Экол 2 (2): 113-118.
    9. Грюниг, К. Р., Бруннер, П. К., Дуо, А. и Зибер, Т. Н. (2007). Пригодность методов распознавания видов в комплексе видов Phialocephala fortinii-Acephala applanata с использованием анализа ДНК. Fungal Genet Biol 44 (8): 773-788.
    10. Хантула Дж. И Вайнио Э. (2003). Специфические праймеры для дифференциации инфицированных культи Heterobasidion annosum (s.str.) И H. parviporum в Северной Европе. Сильва Фенница 37.
    11. Хиггинс, К. Л., Арнольд, А. Э., Мядликовска, Дж., Сарват, С. Д. и Лутцони, Ф. (2007). Филогенетические взаимоотношения, родство с хозяином и географическая структура бореальных и арктических эндофитов трех основных линий растений. Mol Phylogenet Evol 42 (2): 543-555.
    12. Кассамбара, А., Мундт, Ф. (2017). factoextra: Извлечение и визуализация результатов многомерного анализа данных .
    13. Кемп Б. М. и Смит Д. Г. (2005). Использование отбеливателя для удаления загрязняющих ДНК с поверхности костей и зубов. Forensic Sci Int. 154 (1): 53-61.
    14. ЛеБольдус, Дж. М., Бленис, П. В. и Томас, Б. Р. (2010). Способ индуцирования стеблевых язв путем инокуляции здоровых клонов Populus суспензиями спор Septoria musiva . Завод Дис 94 (10): 1238-1242.
    15. Лу, Ю. (2011). Извлеките геномную ДНК из листьев арабидопсиса (также можно использовать для других тканей). Биопротокол 1 (13): e90.
    16. Нельсен, М. П., Люкинг, Р., Мбачоу, Дж. С., Эндрю, К. Дж., Шпильманн, А. А. и Лумбш, Х. Т. (2011). Новые сведения о взаимоотношениях лишайников Dothideomycetes . Разнообразие грибов 51 (1): 155-162.
    17. Поребский, С., Бейли, Л. Г. и Баум, Б. Р. (1997). Модификация протокола экстракции ДНК CTAB для растений, содержащих компоненты с высоким содержанием полисахаридов и полифенолов. Plant Mol Biol Rep 15 (1): 8-15.
    18. Сайни, Х. С., Шеперд, М. и Генри, Р. Дж. (1999). Микроволновая экстракция общей геномной ДНК из зерен ячменя для использования в ПЦР. J Inst Brew 105 (3): 185-190.
    19. Швейгкофлер, В., В. Дж., О., С. Л., С., Д. Р., К., Маеда, К., Пи, К. и Гарбелотто, М. (2005).Обнаружение и количественная оценка Leptographium wageneri , причины заболевания корней черной пятнистости, от короедов ( Coleoptera: Scolytidae ) в Северной Калифорнии с использованием регулярной ПЦР и ПЦР в реальном времени. Канадский журнал исследований леса 35: 1798-1808.
    20. Терхонен, Э., Лангер, Г. Дж., Бускамп, Дж., Рэскунь, Д. Р. и Блюменштейн, К. (2019). Низкая доступность воды увеличивает некроз у Picea abies после искусственной инокуляции возбудителями грибковой корневой гнили Heterobasidion parviporum и Heterobasidion a nnosum . Леса 10 (1): 55.
    21. Терхонен, Э., Марко, Т., Сан, Х., Ялканен, Р., Касанен, Р., Вуоринен, М. и Асигбу, Ф. (2011). Влияние широты, сезона и возраста хвои на микоту сосны обыкновенной ( Pinus sylvestris ) в Финляндии. Сильва Фенн 45
    22. Вилгалис, Р. и Хестер, М. (1990). Быстрая генетическая идентификация и картирование ферментативно амплифицированной рибосомальной ДНК нескольких видов Cryptococcus . J Bacteriol 172 (8): 4238-4246.
    23. Уайт Т., Брунс Т., Ли С., Тейлор Дж., Иннис М., Гельфанд Д. и Снински Дж. (1990). Амплификация и прямое секвенирование генов грибных рибосомных РНК для филогенетики. В: Протоколы ПЦР , Academic Press, Inc., стр. 315-322.
    24. Винтон, Л. М., Стоун, Дж. К., Ватруд, Л. С. и Хансен, Э. М. (2002). Одновременное количественное определение ДНК хозяина и патогена в одной пробирке с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени. Фитопатология 92 (1): 112-116.
    25. И, С., Цзинь, В., Юань, Ю. и Фанг, Ю. (2018). Оптимизированный метод CTAB для выделения геномной ДНК из свежесобранных ушных раковин папоротника, Adiantum capillus-veneris L. Биопротокол 8 (13): e2906.
    Пожалуйста, войдите или зарегистрируйтесь, чтобы просмотреть полный текст

    Просмотр полного текста

    Скачать PDF

    Вопросы и ответы

    Авторские права: © 2020 Авторы; эксклюзивный лицензиат ООО «Биопротокол».

    Как цитировать: Керио, С., Терхонен, Э. и ЛеБолдус, Дж. М. (2020). Безопасный протокол экстракции ДНК, подходящий для изучения взаимодействий древесных грибов. Биопротокол 10 (11): e3634. DOI: 10.21769 / BioProtoc.3634.

    Как извлечь ДНК из фекалий

    Количество исследований микробиома человека резко возросло за последнее десятилетие, при этом большинство из них посвящено анализу образцов фекалий.Хотя это не самый приятный образец для работы, нам есть что узнать о здоровье и биологии человека, которые можно найти в стуле. Содержащиеся в этих матрицах переваренных отходов и микробов являются ключом к разгадке многих способов, которыми микробиом влияет на наше здоровье. Например, дисбактериоз микробных сообществ, которые мы несем в кишечнике, может варьироваться от явного заражения чужеродными патогенами до незначительных изменений в комменсалах, которые приводят к появлению симптомов.

    Микробная геномная ДНК, обнаруженная в образцах фекалий, имеет решающее значение для исследований микробиома.И хотя ученые постоянно совершенствуют технологии выделения ДНК, многие проблемы при очистке образцов все еще существуют. Эти проблемы включают предвзятый микробный лизис, загрязнение ингибиторами ПЦР и вариации фекального матрикса (твердый, мягкий, диарея и т. Д.). При экстракции фекальной ДНК необходимо решить эти основные проблемы, чтобы получить чистую ДНК без ингибиторов при сохранении высоких урожаев.

    Образцы кала бывают разных форм, размеров и консистенции, и на них может влиять множество факторов.Виды доноров, состояние здоровья и диета - все это способствует различию в составе фекального материала. Это приводит к большим различиям в массе, консистенции и составе микробного сообщества.

    Таким образом, важно иметь очень надежный рабочий процесс очистки, чтобы гарантировать, что микробная ДНК может быть выделена из всех типов образцов. Идеальная система экстракции эффективно лизирует как грамположительные, так и грамотрицательные штаммы бактерий, а также архей и грибов без каких-либо искажений. Напротив, использование предвзятого метода выделения бактериальной ДНК может иметь серьезные последствия для анализа данных и привести к неправильной интерпретации данных. Часто эти предубеждения проявляются в неточном представлении легко лизируемых организмов и в последующем недопредставлении трудных для лизиса организмов.

    Даже при большом количестве проблем, возникающих при многих рабочих процессах очистки, следующие советы могут обеспечить успешное извлечение ДНК из фекалий:

    • Немного - долгий путь
      • Каждый образец имеет разную биомассу и бактериальное богатство, поэтому очень важно использовать соответствующее количество образца для вашего метода экстракции.Фекалии, как правило, очень богаты бактериальной ДНК, поэтому вам не нужно много!
      • Попробуйте начать с 1 мг здорового стула и постепенно увеличивайте его количество. Обычно из 100 мг получается 2,5 мкг ДНК
      • .
    • Для очень густых или вязких образцов ресуспендирование и разбавление в реагентах для консервации, таких как DNA / RNA Shield, поможет на этапах экстракции при сохранении микробного профиля.
      • В качестве альтернативы, разбавление образца водой, свободной от ДНКазы / РНКазы, или солевым раствором, таким как PBS, также способствует экстракции.Однако использование воды или PBS может привести к лизису микробных клеток и высвобождению ДНКаз и РНКаз, а также к деградации микробной ДНК, если экстракцию не проводить немедленно. Кроме того, вода и PBS не защитят образцы от ошибок при замораживании / оттаивании, если образцы хранятся в замороженном виде. Эти образцы также можно тщательно гомогенизировать, пропустив их через блендер перед лизисом.
    • Остерегайтесь роста микробов! Между сбором и транспортировкой в ​​лабораторию для фильтрации популяции микробов могут изменяться по мере роста в вашей пробирке для сбора.Есть несколько вещей, которые вы можете сделать, чтобы не допустить роста и повлиять на результаты:
      • Используйте реагент для хранения образцов (например, DNA / RNA Shield)
      • Lyse на момент сбора
      • Заморозьте образец сразу после взятия (хотя см. Предостережение относительно хранения и смещения при замораживании / оттаивании) (Рисунок 1).
    • Для очень вязких образцов или образцов с более высоким содержанием ингибирующих веществ рассмотрите возможность использования меньшего количества образца, чем обычно, чтобы избежать необходимости иметь дело с ингибиторами в вашей ПЦР.
      • Образцы травоядных животных (например, лошадей и мышей, получавших зерно), как правило, очень богаты углеводами и непереваренными растительными веществами. Обращайтесь с этими образцами, как с растениями, и выполняйте предварительную экстракцию CTAB для удаления этих углеводов перед очисткой.
    • Образцы водянистого стула необходимо перенести в пробирку для лизиса с помощью пипетки. Лучше всего это делать с помощью наконечников, у которых обрезаны концы, чтобы сделать отверстие шире для сбора как жидкости, так и твердых частиц.
    Чистота ДНК

    имеет решающее значение для успешного последующего анализа. Если во время изоляции не позаботиться о том, чтобы образец не содержал загрязняющих веществ, потребуются дополнительные этапы обработки.

    Рисунок 1: Погрешности замораживания / оттаивания в микробном профиле при сравнении несохраненного стула (слева) и стула, сохраненного в DNA / RNA Shield. Образцы стула собирали в PBS или DNA / RNA Shield и подвергали повторным циклам замораживания / оттаивания. Затем была извлечена ДНК, подготовлены библиотеки и подвергнуты целевому секвенированию 16S.

    Секрет чистых образцов заключается в этапах связывания и промывки любого протокола очистки. Связывающий агент, содержащийся в большинстве наборов для очистки, включая набор Quick-DNA Fecal Soil Microbe Kit, представляет собой сильно насыщенный раствор хаотропной соли. Хотя это критически важно для связывания ДНК с очищающей матрицей, этот агент также будет искажать измерения нанокапель, приводя к высокой абсорбции при 230 нм, если он элюируется совместно с ДНК. Кроме того, образцы фекалий могут содержать высокие уровни полифенольных соединений, которые совместно извлекают ДНК.Следует позаботиться о том, чтобы они были удалены перед этапами с использованием ПЦР, так как они могут препятствовать применению метода.

    Чтобы избежать этих проблем, мы рекомендуем следующее:

    • Не переполняйте колонку на этапе связывания протокола. Любой дополнительный связывающий буфер может оставить соли в ловушке на ободке или крышке колонки. Также существует большая вероятность загрязнения наконечника колонки из-за избыточной загрузки образца.
    • На этапах промывки промывочный буфер следует загружать по краю колонки, а не просто разбрызгивать его в колонку.Проведение наконечника пипетки по внутреннему краю колонки помогает смыть соли со стенок колонки.
    • Поместите буфер для элюции непосредственно на матрицу. Пипетирование буфера для элюции в любом другом месте колонки может привести к повторному суспендированию любых остаточных солей.
    • Образцы фекалий содержат соли желчных кислот и сложные полисахариды, которые очищаются с ДНК 1, 2. Эти соединения ингибируют ПЦР, и поэтому их необходимо удалить для последующих процессов (рис. 2). При необходимости элюированную ДНК следует пропустить через колонку для удаления ингибитора, такую ​​как OneStep PCR Inhibitor Removal Kit.
    Рис. 2. Важность удаления ингибитора ПЦР ПЦР-амплификация продукта длиной 200 п.н. из ДНК, содержащей гуминовый авид, который был обработан с помощью набора для удаления ингибитора OneStep PCR. В качестве альтернативы для необработанного образца ПЦР была полностью запрещена.

    Ссылки:
    1) Lantz, P.G. и другие. (1997) Удаление ингибиторов ПЦР из образцов фекалий человека путем использования водной двухфазной системы для подготовки образцов перед ПЦР. J. Microbiol. Meth. 28, 159–67
    2) Montiero, L.и другие. (1997) Комплексные полисахариды как ингибиторы ПЦР в кале: модель Helicobacter pylori. J. Clin Microbiol. 35, 995-8

    .

    Об авторе

    alexxlab administrator

    Оставить ответ