Кто подписывает выписку из протокола: Выписка из протокола — общего собрания, образец, аттестационной комиссии на соответствие, педагогического совета — ICQ Information Center. Продажа ICQ. Продажа уинов. Продажа асек. ICQ sale. Sale ICQ.

Кто подписывает выписку из протокола: Выписка из протокола — общего собрания, образец, аттестационной комиссии на соответствие, педагогического совета

Содержание

Кто подписывает выписку из протокола совета директоров

Протокол как отражение коллегиального способа принятия решений

Протокол заседания применяется для документирования деятельности коллегиальных и совещательных органов (коллегий, советов, комиссий, собраний, совещаний и др.), как постоянных, так и временных. Нередко протоколы заседаний ведутся на деловых встречах, переговорах для фиксации достигнутых сторонами договоренностей или иных выработанных совместно условий.

Протокол заседания – документ, содержащий последовательную запись обсуждения вопросов и принятия решений на собраниях, совещаниях, конференциях, заседаниях коллегиальных или совещательных органов.

Протокол заседания отражает деятельность по совместной выработке и принятию управленческих решений. Коллегиальному решению, как правило, подлежат наиболее важные и принципиальные вопросы в деятельности организации, требующие коллективного, совместного обсуждения и принятия решения.

Коллегиальный способ принятия решения используется в деятельности практически любой организации, независимо от ее организационно-правовой формы и характера деятельности , например в организациях, имеющих форму акционерного общества, на основе коллегиальности действуют общее собрание акционеров, совет директоров (наблюдательный совет), правление, ревизионная комиссия, счетная комиссия. Кроме того, в любой организации при единоличном исполнительном органе, например при генеральном директоре, могут создаваться дирекции, советы, комиссии для совместного обсуждения и решения различных вопросов деятельности организации.

Подготовительный этап

Как правило, заседанию предшествует большая подготовительная работа: подготовка повестки дня заседания, информирование членов коллегиального органа и других заинтересованных лиц, подготовка в соответствии с повесткой дня материалов для рассмотрения на заседании (как правило, это справка по вопросу или тезисы выступления и проект решения), их копирование и рассылка всем участникам заседания для предварительного ознакомления, подготовка помещения для проведения заседания и др.

Заседанию коллегиального органа предшествует регистрация участников, которая может проводиться в разных формах: от записи фамилий присутствующих непосредственно в черновик протокола (если число участников заседания не превышает 15 человек), составления списка присутствующих на заседании членов коллегиального органа и приглашенных с указанием всех необходимых сведений о них (должность, место работы) до регистрации участников с помощью технических средств. При проведении заседаний общих собраний акционеров акционерных обществ список присутствующих на заседании акционеров и доверенных лиц должен заверяться подписью председателя собрания. Доверенные лица могут быть включены в список присутствующих только при предъявлении доверенности на право представлять интересы акционера. Регистрация присутствующих на заседании – чрезвычайно важный момент, поскольку решения коллегиального органа обладает юридической силой лишь при наличии кворума, а также в том случае, если все участники заседания обладают достаточными полномочиями для участия в голосовании по принимаемым решениям.

Протокол составляется на основании стенограммы заседания, звукозаписи заседания или на основании черновых рукописных записей, которые ведутся во время заседания, а также материалов, подготовленных к заседанию (текстов докладов, выступлений, справок, проектов решений, повестки дня, списков участников и др.).

Если заседание стенографировалось или велась звукозапись , после заседания стенограмма расшифровывается, сверяется со звукозаписью и оформляется (такие записи называют стенограммами или стенографическими протоколами). Расшифровка стенограмм или звукозаписей заседания проводится либо по частям во время самого заседания, либо сразу после заседания, но в любом случае время, которое отводится на оформление стенограммы и протокола заседания, не должно превышать 3-5 дней со дня, когда проводилось заседание.

Если ход заседания записывался на магнитофон или диктофон , после расшифровки записи, составления и оформления стенограммы и (или) протокола кассета со звукозаписью в течение установленного срока (как правило, в течение двух недель) хранится в подразделении, обеспечивающем звукозапись заседаний, а затем размагничивается. Это время необходимо для снятия возможных вопросов и уточнения текста протокола. По решению руководителя коллегиального органа звукозапись заседания может быть оформлена для долговременного архивного хранения.

Оформление реквизитов протокола

С точки зрения полноты отражения хода заседания различаются полные и краткие протоколы.

Полный протокол содержит запись всех выступлений на заседании, краткий – только фамилии выступивших и тему выступления. Какой именно следует вести протокол в каждом конкретном случае, устанавливается в регламенте работы коллегиального органа или решается председателем коллегиального органа.

Протокол заседания оформляются на стандартных листах бумаги формата А4. Обязательными реквизитами протокола являются: наименование организации, наименование вида документа (ПРОТОКОЛ), дата документа, регистрационный номер, место составления документа, заголовок к тексту, подписи.

Оформление реквизитов протокола должно соответствовать ГОСТ Р 6. 30-2003 «Унифицированные системы документации. Система организационно-распорядительной документации. Требования к оформлению документов».

Датой протокола является дата события (заседания, совещания). Дата оформляется цифровым или словесно-цифровым способом: 05.02.2005 или 05 февраля 2005 г.

Регистрационным номером протокола является порядковый номер заседания в течение календарного года или в течение срока действия выборного органа. При регистрации протоколов специальные регистрационно-учетные формы (журнал, картотека) не ведутся, каждому новому протоколу присваивается порядковый номер, следующий за номером протокола, подшитого в дело последним.

Место составления протокола указывается в соответствии с принятым административно-территориальным делением. Наименование места составления документа можно не указывать, если наименование территории входит в название организации: Московская городская Дума, Законодательное Собрание Тверской области.

Заголовок к тексту является обязательным реквизитом протокола. Он должен быть грамматически согласован с наименованием вида документа:

ПРОТОКОЛ (чего?) заседания комиссии по переоценке основных фондов

ПРОТОКОЛ (чего?) заседания дирекции

Текст протокола состоит из двух частей – вводной и основной. Вводная часть оформляется идентично в полной и краткой формах протокола. В ней указываются: фамилии председателя и секретаря заседания, фамилии или общее количество участников заседания и приглашенных лиц, повестка дня. Фамилии членов коллегиального органа или лиц, участвующих в заседании с правом голоса, перечисляются по алфавиту без указания должностей. Если указывается общее количество присутствующих, дается их обобщенное название и делается отметка о наличии списка регистрации:

Присутствовали: члены Научно-технического совета в количестве 25 чел. (список прилагается).

Лица, не являющиеся членами коллегиального органа и приглашаемые на заседание в качестве экспертов в обсуждаемых вопросах или заинтересованных лиц, перечисляются после слова «Приглашенные:», также по алфавиту, но с указанием их должностей и места работы, если они являются представителями других организаций.

В повестке дня заседания указывается вопрос или вопросы, являющиеся предметом рассмотрения на заседании, должность и фамилия докладчика. Если вопросов несколько, они нумеруются арабскими цифрами и располагаются по степени их сложности, важности и в порядке обсуждения. Вопросы повестки дня строятся по формуле «о чем?»:

1. О формировании сметы расходов фирмы на 2005 г.

Доклад финансового директора Мовчана С.А.

2. О подготовке рекламной кампании сезона «Весна-Лето-2005»

Доклад зав. отделом рекламы Сомовой Н.Н.

Вопросы повестки дня должны формулироваться точно и ясно, отражать суть обсуждаемых вопросов. Не рекомендуется включать в повестку дня пункт «Разное».

Текст основной части протокола состоит из отдельных разделов по количеству вопросов повестки дня, каждый из которых строится по схеме:

РЕШИЛИ: ( или: ПОСТАНОВИЛИ:)

Эти ключевые для протокола слова печатаются прописными буквами и с красной строки. Разделы нумеруются арабскими цифрами в соответствии с повесткой дня. После слова «СЛУШАЛИ:» в именительном падеже указывается фамилия докладчика и в форме 3-го лица единственного числа или с предлогом «о» излагается содержание доклада. Если имеется текст доклада, после фамилии докладчика делается отметка: (Текст доклада прилагается).

В разделе «ВЫСТУПИЛИ:» последовательно указывают фамилии лиц, принявших участие в обсуждении доклада, и формулируются высказанные ими мнения. Фамилии выступивших и содержание их выступлений записываются так же, как выступление основного докладчика в предыдущей части протокола.

При необходимости в этом же разделе протокола фиксируются вопросы, заданные докладчику, и его ответы по следующей форме:

Вопрос: Если будет принято решение об эмиссии акций общества, предусматривается ли выпуск привилегированных акций?

Ответ: Нет, будут выпущены только обыкновенные акции.

Фамилия лица, задавшего вопрос, может не указываться.

В разделе «РЕШИЛИ:» («ПОСТАНОВИЛИ:») записывается принятое решение, кратко, точно, лаконично – так, чтобы не возникало двоякого толкования. Принятые решения формулируются в предписывающей форме: «Утвердить. », «Предусмотреть. », «Внести изменения. ». По одному вопросу может быть принято несколько решений, в этом случае они нумеруются арабскими цифрами. При необходимости наряду с решением указываются результаты голосования: количество голосов «за», «против», «воздержавшихся», а также, если голосование было тайным, – количество выданных бюллетеней, полученных в результате голосования и признанных недействительными.

Участник совещания или заседания может представить особое мнение по принятому решению, которое излагается на отдельном листе и присоединяется к протоколу. Содержание особого мнения записывается в протокол после записи соответствующего решения.

Если протоколом утверждается какой-либо документ, он должен прилагаться к протоколу и иметь гриф утверждения, например:

Советом директоров ОАО «Росток»

(протокол от 11.02.2005 № 2)

Подписи председателя и секретаря заседания завершают оформление протокола. Подписывается один экземпляр протокола. Слева проставляется подпись председателя, справа — секретаря.

В соответствии с действующим законодательством в отдельных случаях протоколы заседаний подписываются только председателем (председательствующим) на заседании. Законодательством также предусмотрены случаи подписания протоколов всеми членами органа, принимающего решения. Например, Федеральным законом «Об акционерных обществах» (далее — Закон) предусмотрено (ст. 68), что протокол заседания совета директоров (наблюдательного совета) общества подписывается председательствующим на заседании, который несет ответственность за правильность составления протокола.

Что же касается оформления протокола заседания общего собрания акционеров, то закон вообще не оговаривает порядка его подписания, в ст. 63 Закона установлено лишь, какие сведения указываются в протоколе:

— место и время проведения общего собрания акционеров;

— общее количество голосов, которыми обладают акционеры – владельцы голосующих акций общества;

— количество голосов, которыми обладают акционеры, принимающие участие в собрании;

— председатель (президиум) и секретарь собрания, повестка дня собрания.

В Законе также указывается, что в протоколе общего собрания акционеров общества должны содержаться основные положения выступлений, вопросы, поставленные на голосование, и итоги голосования по ним, решения, принятые собранием.

Сокращенный вариант оформления протокола

Допускается сокращенный вариант оформления протокола, при котором слова СЛУШАЛИ, ВЫСТУПИЛИ, РЕШИЛИ (ПОСТАНОВИЛИ) не печатаются. После цифры, обозначающей номер вопроса в повестке дня, излагается содержание вопроса (пункт повестки дня). Последняя строка содержания вопроса подчеркивается, и под чертой печатаются фамилии докладчика и выступивших в обсуждении (первой указывается фамилия основного докладчика, а затем фамилии выступивших – в порядке их выступления). После указания фамилий при необходимости кратко излагается суть рассматриваемого вопроса, а ниже – решение (постановление).

Выписка из протокола

Для информирования заинтересованных организаций и лиц о принятых решениях, а также в целях подтверждения принятых решений могут оформляться выписки из протокола.

Выписка из протокола – документ, представляющий собой копию части протокола. В выписке воспроизводится вводная часть протокола (реквизиты бланка, сведения о председателе, секретаре, присутствовавших), вопрос повестки дня, по которому готовится выписка, и часть текста, отражающая рассмотрение вопроса и принятые по нему решения. Подписями председателя и секретаря выписка не удостоверяется. Для придания юридической силы выписке из протокола используется реквизит «Отметка о заверении копии», оформляемый секретарем. Если выписка из документа выдается для представления в другую организацию, она заверяется печатью организации.

Юридические лица, созданные на основании членства в них граждан и иных организаций, решают основные вопросы деятельности на общем собрании участников, которое является высшим органом управления. Уставами или положениями устанавливается его компетенция и определяется, решения по каким вопросам правомочны принимать все участники.

К таким организациям, образованным по принципу членства, относятся хозяйственные общества, наиболее распространенными из них являются акционерные и общества с ограниченной ответственностью, а также некоммерческие объединения граждан и юридических лиц: всевозможные ТСЖ, СНТ, ЖСК, некоммерческие партнерства, ассоциации и союзы.

Порядок проведения

Как правило, на общем собрании большинством голосов принимаются решения:

о создании, реорганизации, ликвидации ООО;
утверждение устава и внесение в него изменений;
участие в других юридических лицах;
образование исполнительных органов и выборы органов управления;
утверждение годового отчета;
назначение ревизионной или аудиторской проверки.

Инициатива созыва собрания принадлежит исполнительному органу или группе участников, числом не менее определенного процента от их числа согласно учредительным документам. Процедура должна отвечать требованиям закона, регулирующего деятельность организации, и устава. Всем членам заблаговременно должно быть выслано уведомление, содержащее дату, время, место проведения и повестку дня.

В целях проверки правомочности собрания и наличия кворума рекомендуется проводить регистрацию прибывших с указанием документа, удостоверяющего личность, и проставлением подписи участника напротив своей фамилии.

В протоколе должен быть отражен весь его ход, выступления участников, прения, обсуждения вопросов повестки, голосование и его результаты, принятые решения:

Во вводной части указывается дата начала и окончания сбора, количество лиц, принимающих в нем участие, процентное соотношение прибывших к общему количеству членов организации, наличие или отсутствие кворума, а также вопросы, включенные в повестку.
В основной части описывается последовательность рассмотрения вопросов, при этом можно составить краткий протокол с фиксацией пункта повестки и принятого решения или полный с записью речей докладчиков, реплик, мнений.

По окончании собрания составляется официальный протокол на основании записей, которые вел избранный секретарь. Срок его изготовления обычно — от 3 до 5 дней. Изготовленный документ подписывается председательствующим и секретарем и хранится вместе со всей документацией сбора: уведомлением, листом регистрации, черновыми записями о ходе обсуждений.

Собрания участников могут проводиться путем заочного голосования, без созыва всех членов организации. В таких случаях инициаторы уведомляют в обычном порядке о созыве и порядке принятия решений по вопросам повестки. Голосование проводится путем заполнения высланных организатором бюллетеней в течение определенного срока. По итогам подсчета голосов, отраженных в бюллетенях, составляется протокол. Такая форма голосования может быть применена и в обычных очных сборах в целях исключения факта отказа участником от выраженного мнения.

Для АО и ООО законодательством предусмотрено нотариальное удостоверение принятых решений. Но если в уставе установлено, что протокол должен быть подписан всеми участниками лично или с использованием электронной подписи, позволяющей достоверно установить волю голосовавшего, то можно не привлекать нотариуса.

Что собой представляет выписка?

Выписка из протокола – это точная его копия по конкретному вопросу или части. Правом требовать ее обладает любой член организации либо его уполномоченный представитель. Органы управления при получении запроса обязаны предоставить документ в разумный срок, как правило, не превышающий 7 дней.

Выписку не нужно путать с ксерокопией, поскольку это отдельный документ, и составляется он в том же порядке, что и сам протокол с указанием присутствовавших, повестки, обсуждения по конкретному вопросу и принятому решению.

На документе ставится отметка «верно», подпись и должность заверяющего лица и дата составления. Он предоставляется в тех случаях, когда на повестке собрания было большое количество вопросов и протокол содержит большое количество информации, не относящейся к правам лица, требующего его выдачи.

Общее собрание акционеров

Деятельность акционерных обществ регулируется федеральным законом, который содержит требование по раскрытию информации, в том числе и о проведении общего собрания, путем опубликования в течение 2 дней с даты составления протокола в сети интернет.

В случае нарушения указанной нормы общество может быть привлечено к административной ответственности. Сам же документ должен быть составлен не позднее 3-х дней с даты закрытия собрания.

Публикация не лишает акционеров права требовать выписку, которую ему обязан предоставить единоличный орган управления в лице директора.

Собрание участников ООО

Законом об обществах с ограниченной ответственностью не установлен срок изготовления протокола, но он может быть предусмотрен в уставе. В документе, помимо информации, указанной выше, обязательно должны быть отражены результаты голосования с указанием количества голосовавших за принятие решения, против и воздержавшихся.

В течение 10 дней с даты оформления итогов собрания они должны быть направлены всем участникам, в противном случае органы управления могут быть привлечены к административной ответственности. Выписку также может требовать любой участник.

Подробнее о том, как провести данное собрание, смотрите на следующем видео:

Собрание некоммерческих организаций

Законодательство не содержит строгих требований к составлению протокола общего собрания различных товариществ и некоммерческих партнерств, в форме которых создаются СРО – профессиональные объединения.

После проведения собрания протокол, в котором отражены все рассмотренные вопросы и принятые решения, подписывается председателем и секретарем и хранится у руководства. Выписка может быть предоставлена любому члену организации.

В случае сомнений в ее подлинности у третьих лиц, для представления которым участник ее затребовал, может быть истребована копия протокола, заверенная единоличным исполнительным органом.

Зачем нужна и как составляется выписка из протокола общего собрания

Выписка из протокола общего собрания — образец

В законодательстве нет такого закона, который бы заставил заверять бумагу только руководителям. Иногда их нужно оформить очень много, и вместо того чтоб решать текущие важные вопросы, директор должен заниматься бумажной работой. В некоторых случаях выписка может заверяться руководством, но в большинстве случаев это делают секретари предприятия. В конце бумаги секретарь ставит свою подпись, чем подтверждает, что документ составлен правильно, и написанное абсолютно верно. Это правило касается внутренних документов предприятия.

Если возникает потребность цитировать определенную часть протокола, а весь остальной его смысл просто не нужен, делается выписка. При этом совсем не нужно предоставлять полную версию протокола, достаточно чтоб документ был правильно оформлен. Так же выписка поможет донести до масс только некоторые сведения, а основную информацию оставить за кадром.

Кто подписывает выписку из протокола общего собрания

В части «СЛУШАЛИ» излагается текст выступления. В начале текста с новой строки в именительном падеже указывают фамилию выступающего. Запись выступления отделяют от фамилии тире. Выступление излагается от третьего лица единственного числа. Допускается вместо записи выступления после фамилии указать («Запись выступления прилагается», «Текст доклада прилагается»).

Полный протокол — содержит сведения не только об обсуждавшихся вопросах, принятых решениях и фамилиях выступавших, но и достаточно подробные записи, передающие содержание докладов и выступлений участников заседания, все высказанные мнения, прозвучавшие вопросы и реплики, замечания, позиции. Полный протокол позволяет документировать подробную картину заседания (см. рис. 3.4).

Составляем решение о назначении генерального директора (образец 2018)

Трудовой договор с директором можно составить в произвольной форме, включив в него все необходимые сведения, условия и гарантии, предусмотренные действующим законодательством (гл. 10,11 ТК РФ). Обязательна письменная форма договора (ст. 67 ТК РФ). Нужно напечатать два экземпляра:

Принято решение о создании общества. Теперь нужно назначить руководителя новой организации. Так как в компании несколько учредителей, нужен протокол общего собрания участников о назначении директора ООО. Специально для читателей портала наши специалисты подготовили заполненный образец 2018.

Что такое выписка из протокола и как правильно ее составить

вводной (наименование, дату и место проведения собрания, список присутствующих с распределением по ролям, отметку о кворуме). Воспроизводится в соответствии с протоколом;
основной — нужные абзацы из повестки дня, разделы «СЛУШАЛИ», «ВЫСТУПИЛИ»;
результирующей части (решение) из раздела «ПОСТАНОВИЛИ»;
блок «Подписи»: перечень участников, подписавших протокол, их ФИО.

Выписку готовят как в отношении одного вопроса, так и нескольких. Она бесплатна; срок изготовления зависит от того, кто заверяет документ. В некоторых организациях принципы ведения делопроизводства определены в локальных инструкциях. Иногда лица, имеющие право заверения, прописаны в уставе. Ими могут быть генеральный директор, руководитель подразделения, председатель правления.

Кто подписывает выписку из протокола общего собрания

Копии протоколов при необходимости рассылаются заинтересованным организациям и должностным лицам в соответствии с указателем рассылки; указатель составляет и подписывает ответственный исполнитель подразделения, готовившего рассмотрение вопроса. Копии протоколов заверяются печатью Службы делопроизводства. 25

Выписка из протокола воспроизводит все реквизиты бланка, вводную часть текста, вопрос повестки дня, по которому готовится выписка, и текст, отражающий обсуждение вопроса и принятое решение. Выписку из протокола подписывает только секретарь, он же ее заверяет. 28

Кто подписывает выписку из протокола общего собрания

Садоводческое товарищество представляет объединение не менее трех лиц, которые владеют участками на одной территории и совместно осуществляют хозяйственную деятельность. Как юридическое образование СНТ оформляет устав, выбирает председателя и секретаря и официально регистрируется. Все решения, принимаемые членами СНТ на общих собраниях, оформляются в виде протокола.

наименования товарищества и типа документа;
срок проведения общего собрания, его место и присвоенный ему порядковый номер;
сведения о председателе, секретаре и всех присутствующих участников объединения;
если на встрече присутствуют иные лица, то данные о них также заносятся в бумаги;
документ содержит повестку, то есть содержание встречи. Она формулируется в виде нескольких пунктов, которые отражают те вопросы, которые будут подняты в течение беседы;
в документ заносится все обсуждение повестки, а также решения, принятые в окончании встречи по итогам обсуждений;
если к протоколу прикладываются документы, то их список должен быть отражен в основном теле бумаги;
документ содержит подписи секретаря, ведшего записи, председателя;
в обязательном порядке заверяется печатью.

Как составить выписку из протокола общего собрания предприятия и некоммерческой организации

Общее собрание участников проводится юридическими организациями, которые основаны на участии в них других людей. Именно эти собрания и становятся своеобразным высшим органом управления. Компетенция этого органа определяется уставами и положениями. Среди важных документов и выписки из протоколов.

Назначение проверки, аудиторского или ревизионного характера.
Утверждение отчёта за целый год.
Выборы в органы управления, образование исполнительных органов.
Принятие участия в образовании других юридических лиц.
Утверждение Устава, либо изменение.
Ликвидация ООО, создание или реорганизация.

Кто подписывает выписку из протокола общего собрания

Установленное законом требование «заверять» протоколы общих собраний печатью товарищества мне непонятно. Печать товарищества — идентификационный признак юридического лица, используемый при обмене документами со сторонними организациями. Сторонним организациям направляются обычно выписки из протоколов, которым и надлежит быть заверенными. В отличие от выписки из протокола, сам протокол — это внутренний документ, адресованный распорядительным органом (общим собранием) исполнительному органу (правлению и его председателю). Вот и получается, что председатель правления, хранящий печать, «заверяет» этой печатью отдаваемые ему распоряжения. Как-то не очень правильно.

«Протоколы общих собраний членов садоводческого, огороднического или дачного некоммерческого объединения (собраний уполномоченных) подписывают председатель и секретарь такого собрания; данные протоколы заверяются печатью такого объединения и хранятся в его делах постоянно» (ст.27 п.1 №66-ФЗ от 15.04.1998). Процитированной статьей исчерпываются требования закона к оформлению протокола собрания садоводческого товарищества. Тем не менее, все реквизиты, позволяющие правильно воспринимать вид, источник и содержание документа, в протоколе собрания должны присутствовать обязательно.

Выписку из протокола № 1 подписывает председатель и секретарь собрания

Список домовладельцев (или их представителей), присутствовавших на общем собрании, с подписями этих домовладельцев (или их представителей) является основополагающим документом, главным фактическим доказательством легитимности данного общего собрания и является неотъемлемой частью протокола.

Подтвержденное право собственности на определенное число квадратных метров в данном кондоминиуме определяет число голосов, которым этот собственник обладает, и дает ему право принимать участие в общем собрании собственников данного кондоминиума по выбору способа управления кондоминиумом.

Для чего нужна выписка из протокола?

Порядок проведения

Как правило, на общем собрании большинством голосов принимаются решения:

о создании, реорганизации, ликвидации ООО;
утверждение устава и внесение в него изменений;
участие в других юридических лицах;
образование исполнительных органов и выборы органов управления;
утверждение годового отчета;
назначение ревизионной или аудиторской проверки.

Собрание в самом начале должно выбрать председательствующего, на которого возлагается его проведение, и секретаря для ведения протокола.

Во вводной части указывается дата начала и окончания сбора, количество лиц, принимающих в нем участие, процентное соотношение прибывших к общему количеству членов организации, наличие или отсутствие кворума, а также вопросы, включенные в повестку.
В основной части описывается последовательность рассмотрения вопросов, при этом можно составить краткий протокол с фиксацией пункта повестки и принятого решения или полный с записью речей докладчиков, реплик, мнений.

По окончании собрания составляется официальный протокол на основании записей, которые вел избранный секретарь. Срок его изготовления обычно – от 3 до 5 дней. Изготовленный документ подписывается председательствующим и секретарем и хранится вместе со всей документацией сбора: уведомлением, листом регистрации, черновыми записями о ходе обсуждений.

Ненадлежащее составленный протокол может быть основанием для признания принятого решения недействительным.

Для АО и ООО законодательством предусмотрено нотариальное удостоверение принятых решений. Но если в уставе установлено, что протокол должен быть подписан всеми участниками лично или с использованием электронной подписи, позволяющей достоверно установить волю голосовавшего, то можно не привлекать нотариуса.

Что собой представляет выписка?

Выписка из протокола – это точная его копия по конкретному вопросу или части. Правом требовать ее обладает любой член организации либо его уполномоченный представитель. Органы управления при получении запроса обязаны предоставить документ в разумный срок, как правило, не превышающий 7 дней.

Заверяет ее руководитель организации в лице директора, председателя правления или председателя совета партнерства и скрепляет печатью.

Общее собрание акционеров

Деятельность акционерных обществ регулируется федеральным законом, который содержит требование по раскрытию информации, в том числе и о проведении общего собрания, путем опубликования в течение 2 дней с даты составления протокола в сети интернет.

В случае нарушения указанной нормы общество может быть привлечено к административной ответственности. Сам же документ должен быть составлен не позднее 3-х дней с даты закрытия собрания.

Собрание участников ООО

Здесь вы можете бесплатно скачатьобразец выписки для ОООиСНТ

В течение 10 дней с даты оформления итогов собрания они должны быть направлены всем участникам, в противном случае органы управления могут быть привлечены к административной ответственности. Выписку также может требовать любой участник.

Подробнее о том, как провести данное собрание, смотрите на следующем видео:

Собрание некоммерческих организаций

Обязанность ведения документа предусмотрена законом и внутренними документами, уставом и положениями.

ВЫПИСКА ИЗ ПРОТОКОЛА N ___

заседания Совета директоров ___________________

г. __________________

«___»___________ ____ г.

Время проведения заседания:_________________________.

Место проведения заседания:__________________________.

Присутствовали:

На заседании Совета директоров присутствуют _______ из _______ членов Совета директоров Общества: ______________________________.

Повестка дня:

1. Одобрение сделки по приобретению ______________, в которой имеется заинтересованность.

По повестке дня:

Результаты голосования:

«За» — ____________.

«Против» — _____________.

«Воздержались» — _____________.

Совет директоров решил:

Одобрить сделку по приобретению ____________________________ у (наименование Общества) _______________________________________ __________________________ (наименование организации — Продавца) (наименование имущества)
по цене _______________________________________, в которой имеется заинтересованность _________________.
Председатель заседания: __________/__________/
Выписка верна ____________________________ ___________/_________/ (должность, Ф.И.О.)
М.П. «___»__________ ____ г.

Выписка из протокола заседания комиссии – документ, который может потребоваться в самых разных случаях.

Что такое протокол заседания комиссии

На предприятиях и в организациях работа всевозможных комиссий не такое уж и редкое явление. Обычно в состав комиссий включается несколько сотрудников компании, которые профессионально решают поставленные перед ними задачи. Комиссии бывают учредительные, аттестационные, приемочные, инвентаризационные, они собираются по поводу конференций, семинаров и т. д. При этом работа любой комиссии обязательно фиксируется в специальном протоколе. В него заносятся сведения о том, кто входит в комиссию, какие цели перед участниками были поставлены, каким образом они были достигнуты и решение комиссии.

Бланк и образец
Бесплатная загрузка
Онлайн просмотр
Проверено экспертом

ФАЙЛЫ
Скачать пустой бланк выписки из протокола заседания комиссии .docСкачать образец выписки из протокола заседания комиссии .doc

Виды протоколов

Протоколы условно можно поделить на два типа. К первому относятся краткие протоколы – они обычно применяются для регистрации работы комиссий, созванных в оперативном порядке, в том числе и незапланированных заранее. В них вносится только та информация, которая касается обсуждаемых вопросов, мнения участников и общего решения. А вот в полных протоколах сведения более объемны. В них вписываются не только основные данные, но и вся процедура заседания, включая подробное обсуждение, реплики, мнения, ход голосования, итоги. На таких заседаниях с полным протоколом всегда есть председатель, который им руководит и секретарь, который во всех деталях фиксирует происходящее. Иногда полный протокол может достигать нескольких страниц.

Зачем делать выписку

Зачастую информация, содержащаяся в протоколах, отражает секретные моменты текущей деятельности фирмы и не предназначена для широкой аудитории. Выписка помогает решить эту проблему.

С ее помощью заинтересованные лица получают нужные им данные, а конфиденциальность протокола сохраняется. Также выписка целесообразна при чрезмерно большом объеме протокола. Как правило, речь в выписке идет только о каком-то конкретном принятом решении.

Если говорить о практике, которая имеет широчайшее распространение, то выписки из протоколов заседаний помогают руководству компаний осуществлять деятельность по организации работы своих предприятий, контролировать работу производств, регулировать выполнение распоряжений, приказов (иногда выписки даже являются своего рода их заменителем) и т. д.

При помощи выписок государственные надзорные ведомства, контрагенты, банковские кредитные учреждения своевременно информируются о деятельности фирмы.

Чем отличаются выписка и копия

Некоторые работники организаций ошибочно полагают, что копия и выписка – это одно и то же. Это не совсем так. Между ними есть принципиальное отличие: копия – это абсолютно идентичный оригиналу документ, который делается обычно при помощи копировальной техники. Выписка же – это только некоторая часть оригинала и достаточно часто формируется она от руки (когда из документа берутся только те куски текста, которые требуются в каком-то конкретном случае).

Кто делает выписку

Выписку обычно делает сотрудник предприятия, в чьем ведении находится работа с протоколами, в том числе по их сохранению (это может быть секретарь, юрист или сам руководитель организации).

При этом выписка обязательно должна быть заверена уполномоченным на этом работником компании. Также на выписке должна стоять печать (если компания применяет штампы для визирования бумаг).

Как получить выписку

Чтобы получить требуемую выписку от заинтересованного лица, должен поступить соответствующий запрос или заявление в письменном виде с обозначением причин, по которым ему нужен данный документ и указанием учреждения, для предоставления в которое он понадобился.

Образец выписки из протокола заседания комиссии

При необходимости сделать выписку, посмотрите ее пример – с его помощью вы без труда сделаете то, что вам нужно.

В начале документа обязательно напишите наименование организации, также укажите состав комиссии, отметьте повестку дня.
Далее выпишите те данные из хода заседания, которые касаются заинтересованного лица и обязательно – решение комиссии.
После этого, в конце документа поставьте надпись «Верно» или «Выписка верна», подпишите и датируйте бланк.

Интересные темы:

Выписка из годового общего собрания акционеров для участия в открытом конкурсе

Главная → Статьи → Выписка из годового общего собрания акционеров для участия в открытом конкурсе

Участник конкурса публичного акционерного общества в составе заявки представил решение об избрании генерального директора в виде выписки из годового общего собрания акционеров. Представленная выписка подписана председателем совета директоров. Должна ли для данного общества выписка из годового общего собрания акционеров быть подтверждена в порядке, предусмотренном п. 1 ч. 3 ст. 67.1 ГК РФ?

Согласно пп. “в” п. 1 ч. 2 ст. 51 Федерального закона от 05.04.2013 № 44-ФЗ “О контрактной системе в сфере закупок товаров, работ, услуг для обеспечения государственных и муниципальных нужд” (далее – Закон № 44-ФЗ) заявка на участие в открытом конкурсе должна содержать документ, подтверждающий полномочия лица на осуществление действий от имени участника открытого конкурса – юридического лица (копию решения о назначении или об избрании либо копию приказа о назначении физического лица на должность, в соответствии с которыми такое физическое лицо обладает правом действовать от имени участника открытого конкурса без доверенности (далее – руководитель)).

В соответствии с пп. 8 п. 1 ст. 48 Федерального закона от 26.12.1995 № 208-ФЗ “Об акционерных обществах” (далее – Закон об АО) к компетенции общего собрания акционеров относится образование исполнительного органа общества, досрочное прекращение его полномочий, если уставом общества решение этих вопросов не отнесено к компетенции совета директоров (наблюдательного совета) общества.

Согласно пп. 1 п. 3 ст. 67.1 ГК РФ принятие общим собранием акционеров публичного акционерного общества решения и состав акционеров, присутствовавших при его принятии, подтверждаются лицом, осуществляющим ведение реестра акционеров такого общества и выполняющим функции счетной комиссии (п. 4 ст. 97 ГК РФ). Указанное правило действует с 01.09.2014.

Решения очных собраний участников хозяйственных обществ, не удостоверенные нотариусом или лицом, осуществляющим ведение реестра акционеров и выполняющим функции счетной комиссии, в порядке, установленном пп. 1-3 п. 3 ст. 67.1 ГК РФ, являются ничтожными применительно к п. 3 ст. 163 ГК РФ (п. 107 постановления Пленума ВС РФ от 23.06.2015 № 25 “О применении судами некоторых положений раздела I части первой Гражданского кодекса Российской Федерации”).

Как видим, законодательством предусмотрена необходимость удостоверения регистратором решений общего собрания акционеров в процессе их принятия, а не выписок из протокола общего собрания, либо копий документов. Поэтому, на наш взгляд, требовать от участника выписку, удостоверенную регистратором, неправомерно. Отметим, что по этому вопросу имеется противоположная правоприменительная практика (смотрите, например, решение Управления Федеральной антимонопольной службы по Хабаровскому краю от 28 января 2016 г. № 33).

По смыслу положений пп. “в” п. 1 ч. 2 ст. 51 Закона 44-ФЗ участник обязан предоставлять в составе заявки копию решения об избрании генерального директора, либо копию приказа о его назначении на данную должность. На практике во исполнение данного требования участники закупки нередко предоставляют выписки из протоколов общего собрания акционеров.

Законом об АО не регламентирован порядок удостоверения выписок из протоколов общего собрания, поэтому сам по себе факт удостоверения выписки из протокола общего собрания акционеров председателем совета директоров не свидетельствует о ее недействительности. В ООО выписки из книги протоколов общих собраний удостоверяются исполнительным органом общества (п. 6 ст. 37 Федерального закона от 08.02.1998 № 14-ФЗ “Об обществах с ограниченной ответственностью”).

Вместе с тем если предоставленная участником выписка не содержит сведений о соблюдении установленного пп. 1 п. 3 ст. 67.1 ГК РФ порядка подтверждения решения акционеров, существует вероятность, что указанное в выписке решение ничтожно, если участником не предоставлен иной документ, содержащий сведения о соблюдении указанного порядка. Смотрите, например, требования, предъявляемые в Инструкция Банка России от 27 декабря 2013 г. № 148-И “О порядке осуществления процедуры эмиссии ценных бумаг кредитных организаций на территории Российской Федерации”.

Поэтому, на наш взгляд, если представленная в составе заявки выписка из протокола общего собрания не содержит информацию об удостоверении соответствующего решения общего собрания регистратором, такая выписка не соответствует требованиям пп. “в” п. 1 ч. 2 ст. 51 Закона 44-ФЗ. К сожалению, официальных разъяснений, а также судебной практики по данному вопросу нам найти не удалось.

Ответ подготовил: Верхова Надежда, эксперт службы Правового консалтинга ГАРАНТ
Контроль качества ответа: Александров Алексей, рецензент службы Правового консалтинга ГАРАНТ

Свежие новости цифровой экономики на нашем канале в Телеграм

Нужна информация о возможных закупках вашей продукции?
С нашей помощью вы сможете не только следить за торгами «в одном окне», но и организовать работу сотрудников службы сбыта с тендерами.
Оставить заявку >>

Протокол общего собрания СНТ — образец 2021

Протокол общего собрания членов СНТ — это документ, оформляющий решения этого органа управления. В статье указаны основные правила его составления.

В соответствии со ст. 16 ФЗ 217 от 29.07.2017 о ведении садоводства в РФ, высшим органом управления садоводческой некоммерческой организации является общее собрание ее членов. Результат деятельности этого органа, его решения в обязательном порядке оформляются письменным документом — протоколом.

Порядок созыва общего собрания и формы его проведения

Ранее действовавший ФЗ 66 о садоводческих и огороднических объединениях граждан детально регламентировал порядок созыва общего собрания членов СНТ. Вступивший в силу 01.01.2019 (в основной своей части) ФЗ 217 внес некоторые изменения в эту процедуру.

По-прежнему оно проводится не реже 1 раза в год и правомочно, если в нем участвуют не менее 50 % участников товарищества. Этот орган решает наиболее значимые вопросы по деятельности некоммерческой организации:

прием и исключение новых участников;
одобрение проектов перепланировки;
рассмотрение жалоб и т. д.

С 01.01.2019 изменены правила принятия решения путем голосования. Часть вопросов решается простым большинством, но определен перечень решений, которые принимаются, если за них проголосовало не менее 2/3 участников:

внесение изменений в устав;
избрание органов управления;
принятие решения о приобретении земельных участков и имущества общего пользования (его создании) и т. д.

Ранее в законе была определена такая форма проведения собрания, как совет уполномоченных. В результате внесенных в закон изменений статья 17, определяющая компетенции этого органа, утратила упоминание совета уполномоченных.

Позже по этому поводу были даны Разъяснения Минэкономразвития РФ от 01.04.2019. Специалисты министерства подчеркнули, что возможность участия через представителя не отменена: в этом случае нет необходимости личного присутствия. Любой член СНТ может составить доверенность и передать свои права представителю. Совет уполномоченных по-прежнему может созываться на законном основании при должном оформлении полномочий доверенных лиц.

Образец доверенности

Еще одной формой является внеочередной созыв, который проводится по требованию:

правления товарищества;
ревизионной комиссии;
20 % процентов членов СНТ;
муниципальных властей.

Обязательным документом, оформляющим все решения главного органа управления товарищества, является протокол общего собрания членов СНТ. При отсутствии этой формы доказать действительность и сам факт принятия решения будет невозможно.

Образец протокола общего собрания СНТ 2020 г.

Составление протокола

Новый закон не устанавливает конкретную, унифицированную форму протокола, он лишь вводит некоторые требования к его составлению. Специалистами на основе требований к другим организационно-распорядительным документам разработан образец протокола общего собрания членов СНТ, его можно использовать в своей деятельности.

Основные требования к бланку, перечисленные в ФЗ 217:

обязательное указание на результаты голосования по вопросам повестки дня;
приложение списка с подписями всех членов (или их представителей), принявших участие, с личной подписью каждого участника.

Подписывает форму председательствующий (не обязательно председатель товарищества, большинством голосов участников этот статус может получить и другое лицо). Если голосовали заочно, подписывает бланк председатель.

В соответствии с новым ФЗ 217, лица, не являющиеся членами товарищества, обязаны участвовать в содержании общего имущества, в соответствии с чем должны вносить ежегодно в этих целях суммы, равные суммарно установленным членским и целевым взносам. Они также вправе участвовать в управлении некоммерческой организацией и принимать участие в голосовании по основным вопросам. Их голоса должны оформляться точно так же, как и голоса членов СНТ, то есть наличие их подписи обязательно, в какой бы форме ни проходило собрание.

Когда нужна выписка

Выписка выдается на основании заявления участников или лиц, осуществляющих ведение садоводства и огородничество без вступления в некоммерческую организацию. Также они могут быть запрошены госорганами или иными лицами, в соответствии с их полномочиями. Образец выписки из протокола общего собрания СНТ содержит в сжатой форме решения, изложенные в протоколе. Копию бланка обязательно нужно заверять подписью председателя и печатью. Порядок ведения делопроизводства устанавливается в уставе.

Образец протокола общего собрания СНТ

Образец доверенности

Образец выписки

Правовые документы

срок действия, образец, как выглядит в 2019

С помощью протокола документируют происходящее на собрании или заседании. В организации, созданной на основе членства участников — физических и юридических лиц — коллегиальные решения обязательны для исполнения. Собрание как высший орган управления существует в коммерческих (ООО, АО, ПАО) и некоммерческих (педсовет, профсоюз, садовое товарищество, родительский комитет, ТСЖ и др.) учреждений. Протокол может содержать несколько листов текста. Если необходимо донести какое-либо из принятых решение до заинтересованной стороны, используют выписки из него.

И сегодня мы узнаем, какова форма выписки из протокола, как проходит ее оформление, и что для этого потребуется.

После прочтения статьи у вас остались вопросы? Задайте вопрос прямо сейчас через форму (внизу), и в течение часа профильный специалист перезвонит вам, чтобы оказать бесплатную консультацию.

Общая информация

Понятие и особенности выписки из протокола

Выписка из протокола — копия его отдельных частей, сформированная и заверенная установленный образом. В законодательстве нет особых норм, регулирующих порядок составления выписки. Часто правила по подготовке, оформлению и заверению документа содержатся в локальных нормах — принятых в организации инструкциях по делопроизводству. Если таких нет, руководствуются:

ГОСТ Р 7.08-2013. В нем есть определение понятия «выписка из документа», которое применяется в отношении выписки из протокола;
ГОСТ Р 6.30-2003. Включает правила оформления документов, в том числе порядок заверения, внесения реквизитов;
действующим до сих пор Указом Президиума ВС РФ СССР № 9779-X от 04.08.1983. Он определяет, что выписка из документов (в т. ч. протоколов) должна выдаваться по требованию любого гражданина или организации, чьи права затронуты обозначенными там решениями;
нормами, регулирующими деятельность разных юридических лиц. В отношении ООО к таким относится, например, ФЗ № 14 от 08.02.1998 г.

Заполнение документа

ГОСТом рекомендовано делать выписку на фирменном бланке организации. Она состоит из нескольких частей:

вводной (наименование, дату и место проведения собрания, список присутствующих с распределением по ролям, отметку о кворуме). Воспроизводится в соответствии с протоколом;
основной — нужные абзацы из повестки дня, разделы «СЛУШАЛИ», «ВЫСТУПИЛИ»;
результирующей части (решение) из раздела «ПОСТАНОВИЛИ»;
блок «Подписи»: перечень участников, подписавших протокол, их ФИО.

В конце синей шариковой или гелиевой ручкой проставляется заверение.

Выписка из протокола общего собрания трудового коллектива о награждении (ее образец) доступен для просмотра ниже, скачать его можно здесь.

Выписка из протокола общего собрания трудового коллектива о награждении

Выписка из протокола трудового коллектива о награждении — 1 Выписка из протокола трудового коллектива о награждении — 2

Скачать выписку из протокола педагогического совета (ее образец) можно здесь.

Выписка из протокола педсовета (образец)

Выписка из протокола профсоюзного собрания также доступна для скачивания.

Выписка из протокола профсоюзного собрания (образец)

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии также доступна для скачивания.

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии — 1 Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии — 2

Функции

Выписка необходима для предоставления заинтересованным сторонам, контрагентам, государственным структурам. Чаще всего ее оформляют в двух случаях:

в протоколе содержится информация, представляющая коммерческую или личную тайну;
полный текст протокола слишком большой.

Выписки, посвященные какому-либо решению, могут рассылаться заинтересованным сторонам (работникам, филиалам организации). Часто таким образом руководство доносит предписания и приказы до исполнителей.

О том, как оформить выписку из протокола, читайте ниже.

Не обязятельно искать ответ на свой вопрос в этой длинной статье! Напишите свой вопрос через форму (внизу), и наш юрист перезвонит вам в течение 5 минут, бесплатно проконсультирует.

Порядок получения документа в 2019

Составление

Протокол подшивается в тетрадь и хранится в архиве организации. Выписки из него готовит секретарь по запросу заинтересованного лица, он же чаще всего ее заверяет (если в уставе не определено иное).

Как правильно составить выписку:

Вводная часть воспроизводится, как в протоколе. Проставляется дата, место, наименование документа («Выписка из протокола общего собрания ООО «Цветочек» № XX»). Указываются председатель, секретарь, присутствующие на заседании участники. Особо отмечается, есть ли кворум.
Основная часть включает цитату из повестки дня с указанием порядкового номера в очереди вопросов. Далее иду разделы «СЛУШАЛИ» (ФИО докладчика), «ВЫСТУПАЛИ» (имена тех, кто высказывался по вопросу).
Резолютивная часть — принятое решение («ПОСТАНОВИЛИ»).
Перечень участников, подписавших протокол, без проставления реальных автографов (необходимо заменить на слова «Личная подпись»), напротив — их ФИО.

Заверение

Заверение необходимо для того, чтобы выписка получила юридическую значимость. Оно оформляется согласно ГОСТ Р 6.30-2003. Секретарь или иное должностное лицо, уполномоченное подписывать документы, вносит:

слово «Верно»;
должность составителя;
подпись и расшифровку;
дату составления и заверения;
пометку, где находится оригинал протокола.

Если выписка предназначена для предоставления в стороннюю организацию, проставляют печать. Ее нужно ставить так, чтобы частично покрывать должность и роспись составителя.

Узнайте, как решить именно вашу проблему. Напишите свой вопрос через форму (внизу), и один из наших юристов перезвонит вам, чтобы оказать бесплатную консультацию.

Важная информация в 2019

Есть ли разница между выписками из протокола собраний коммерческой или некоммерческой организации (педсовета, СНТ)? Выписки из протокола составляются унифицированным образом. Разница может заключаться в специфике самого протокола. Например, если уставом определено правило ведения подробного документирования, помимо основных разделов могут быть приведено обсуждение вопроса: реплики, особые мнения, ход голосования. На оперативных или внеплановых собраниях ведут краткий протокол, поэтому выписка может не содержать раздел «ВЫСТУПИЛИ», а только «СЛУШАЛИ» и принятое решение.
Нужно ли заверять выписку у нотариуса? Практика показывает, что финансовые и государственные структуры (налоговая и ПФР) часто требуют нотариального заверения выписок по примеру протоколов. Согласно ФЗ № 14, документирование хода собрания ООО должно быть удостоверено присутствующим на нем нотариусом, если в уставе не прописан иной порядок. Обязательно заверение протокола, если решения касаются финансовых вопросов деятельности ЮЛ или смена руководства. Не каждый нотариус готов заверить выписку, если он не следил за ходом заседания. Те, кто соглашаются, требуют оригинал протокола, в котором удостоверены подписи участников. Даже если в уставе прописан договорной порядок принятия решений, при обсуждении важных вопросов рекомендуется приглашать нотариуса. В спорных ситуациях можно сослаться на устав, в котором прописано проведение собраний без юриста, и определено должностное лицо, имеющее право заверять документы.

Выписка из приказа – образец оформления

В практической деятельности выписка из приказа (как и из любого документа) готовится, если документ имеет большой объем, а требуемая информация занимает только небольшую его часть, либо из соображений конфиденциальности. Во всех других случаях проще просто сделать копию необходимого документа.

Выписку из приказа по основной деятельности обычно оформляют по следующему образцу:

полностью воспроизводят реквизиты бланка приказа, при этом вид документа «ПРИКАЗ» заменяют на «ВЫПИСКА ИЗ ПРИКАЗА», регистрационный номер и дату приказа не изменяют в выписке,
начальную часть (преамбулу) приказа повторяют полностью, если она отсутствует, то ограничиваются словом «приказываю:»,
в выписку из распорядительной части переносят только необходимый пункт (ы) приказа,
указывают наименование должности подписавшего приказ, инициалы, фамилию, сама личная подпись отсутствует в выписке из приказа,
необходимо заверить выписку из документа (надпись «Верно», оформление должности, подписи заверяющего с расшифровкой, поставить дату, для сторонней организации нужна печать) – аналогично заверению копии документов, подробнее на эту тему в отдельной статье.

Оформление выписки из приказа по личному составу проводится по похожему образцу. Отличие заключается в отсутствии преамбулы, части текста объясняющей причины издания приказа. Поэтому из распорядительной части воспроизводится интересующий пункт («Принять…», «Перевести…» и т.д.), остальное совпадает с оформлением выписки из приказа по основной деятельности.

Все вышеперечисленное будет лучше посмотреть на конкретном примере оформления.

Образец выписки из приказа

ОТКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО «ДАЛЕКО»
(ОАО «Далеко»)

ВЫПИСКА ИЗ ПРИКАЗА

« 19 » марта 2014 г. № 138
г. Владимир

О создании экспертной комиссии

В целях организации работы по проведению экспертизы ценности документов п р и к а з ы в а ю:

2. Начальнику канцелярии Кузовкиной О.Л. разработать положение об экспертной комиссии до 22.04.2014.

Директор Д.А. Молочкова

Верно
Секретарь Подпись О.Е. Шкваркина
20.03.2014

Я думаю, теперь оформление выписки из приказа не вызовет у вас абсолютно никаких затруднений.

Евгения Полоса

Спасибо Вам за добавление этой статьи в:

Еще интересное по теме:

К записи 38 комментариев

Протокол экстракции клеток

| Thermo Fisher Scientific

Первичные ткани являются ценным инструментом для изучения внутриклеточных и внеклеточных маркеров, которые характеризуют болезненные состояния. Мы разработали протокол для быстрого выделения цитокинов и сигнальных молекул из интактной ткани. Этот метод предназначен для экстракции общего белка и использует неабразивный реагент для экстракции тканей. С помощью этого протокола можно извлечь образцы тканей размером всего 10 мг. Этот метод чувствителен и позволяет обнаруживать связанные с заболеванием колебания биомаркеров.Это эффективная система для извлечения белков из различных типов тканей. Сердце, легкие, почки, селезенка, мозг, печень, тимус и гладкомышечные ткани были успешно извлечены с помощью этого протокола. Приготовленные экстракты совместимы с различными иммуноанализами, такими как ELISA и Invitrogen ™ Luminex ™, а также со всеми традиционными анализами белка. Наш метод экстракции недорогой, универсальный и может быть выполнен менее чем за 15 минут. Мы предлагаем буфер для экстракции клеток для экстракции общего белка из различных типов тканей.

Приготовьте 1x буфер для экстракции клеток, используя следующий состав:

Состав буфера для экстракции клеток

* 10 мМ Трис, pH 7,4
* 2 мМ Na ₃ VO ₄
* 100 мМ NaCl
* 1% Thermo Scientific ™ Triton ™ X-100
* 1 мМ EDTA
* 10% глицерин
* 1 мМ EGTA
* 0,1% SDS
* 1 мМ NaF
* 0,5% дезоксихолат
* 20 мМ Na ₄ P ₂ O ₇

Доступен буфер для экстракции клеток — кат.нет. FNN0011.

Этот буфер для экстракции клеток можно разделить на аликвоты 1x в микроцентрифужных пробирках и хранить при –20 ° C до использования. Перед извлечением клеток разморозьте на льду.

Необходимые дополнительные реагенты:

1 мМ PMSF
коктейль ингибиторов протеазы, Sigma (каталожный номер P-2714)

Этот буфер для экстракции клеток должен быть дополнен 1 мМ PMSF (не входит в комплект) и коктейлем ингибиторов протеазы ( не входит в комплект) непосредственно перед использованием для приготовления буфера для полной экстракции клеток.Добавление коктейля ингибиторов протеазы и PMSF необходимо для ингибирования протеолиза в клеточных экстрактах. Для добавления PMSF мы рекомендуем приготовить 0,3 М исходный раствор в ДМСО и добавить достаточный объем для конечной концентрации 1 мМ (т.е. 17 мкл на 5 мл буфера для экстракции клеток). PMSF очень нестабилен и должен быть добавлен непосредственно перед использованием, даже если был добавлен ранее. Для добавления коктейля с ингибиторами протеазы мы рекомендуем Sigma (№ по каталогу P-2714), восстановленную в соответствии с инструкциями производителя, и добавив 250 мкл на 5 мл буфера для экстракции клеток.Стабильность буфера для экстракции клеток с добавлением ингибитора протеазы составляет 24 часа при 4 ° C.

Обработка клеток

Этот метод можно использовать для получения относительно больших количеств клеточных экстрактов с каждым из изученных режимов стимуляции. Этапы промывки, включенные в эту процедуру, помогают минимизировать компоненты среды в экстрактах клеток.

Оцените плотность клеток: Клетки суспензии: Подсчитайте клетки суспензии путем подсчета на гемацитометре. Адгезивные клетки: Оцените плотность клеток путем визуального осмотра под микроскопом. Уровни конфлюэнтности 70–80% считаются оптимальными для многих исследований передачи сигналов.

Стимулируйте клетки по желанию.

Перенесите клетки в чистые конические пробирки на 15 мл: Клетки-суспензии: Разберите аликвоты желаемого количества клеток в среде в чистые конические пробирки на 15 мл. Адгезивные клетки: Удалите клетки из сосуда соскабливанием. Перенести среду, содержащую отделившиеся клетки, в чистые конические пробирки на 15 мл.

Соберите клетки центрифугированием при 300 x g в течение 7 минут.

Аспирируйте среду.

Ресуспендируйте гранулу в ледяном PBS.

Собрать клетки центрифугированием при 300 x g в течение 7 минут при 4 ° C.

Выполните аспирацию PBS.

Лизируйте клетки, нанося пипеткой буфер для полной экстракции клеток в каждую пробирку. Мы рекомендуем использовать 1 мл буфера для полной экстракции клеток на 10 ⁸ клеток. Важно отметить, что это значение может потребовать оптимизации для каждого конкретного приложения.

Перенесите лизаты в чистые микроцентрифужные пробирки.

Перемешайте смесь на вортексе, затем инкубируйте смесь на льду в течение 30 минут, периодически встряхивая.

Очистите лизаты центрифугированием при 14 000 об / мин (13 000 x g) при 4 ° C в течение 10 минут.

Перенесите осветленные клеточные экстракты в чистые микроцентрифужные пробирки.

Осветленные клеточные экстракты следует хранить при –80 ° C до готовности к анализу. Избегайте повторяющихся циклов замораживания-оттаивания.При подготовке к проведению анализа дайте образцам оттаять на льду. Хорошо перемешайте перед анализом.

Определите концентрацию белка с помощью подходящего метода, такого как набор для количественного определения белка Invitrogen ™ Quant-iT ™ (№ по каталогу Q33210). Экстракты клеток, приготовленные этим методом, обычно имеют концентрацию белка от 1 до 10 мг / мл.

Для некоторых аналитов требуется этап обработки пробы. Пожалуйста, обратитесь к протоколу для конкретного аналита для получения подробной информации о рекомендациях по обработке образцов.

Все клеточные экстракты требуют разбавления по крайней мере 1:10 в стандартном буфере для разбавления перед анализом с помощью наборов Invitrogen ™.

Единый протокол для одновременного извлечения ДНК и белков из археологического зубного камня

Основные моменты

•: ДНК и белки могут быть извлечены из одного образца археологического зубного камня.
•: Хотя восстановление ДНК ниже (в среднем 43%) в соответствии с унифицированным протоколом, никаких изменений в метагеномном составе не обнаружено.
•: На восстановление белка влияет унифицированный протокол, но в основном оно ограничено количеством входящего материала.
•: В протеомном анализе наблюдаются лишь незначительные эффекты, такие как небольшое смещение в отношении гидрофильных белков.
•: Единый протокол, вероятно, можно будет комбинировать с исследованиями микрофоссилий.

Abstract

Археологические материалы — это ограниченный ресурс, и следует прилагать усилия для минимизации разрушающего анализа.Этого можно достичь, используя протоколы, сочетающие экстракцию нескольких типов биомолекул или микрочастиц, что уменьшает количество материала, необходимого для анализа, при максимальном увеличении объема информации. Археологический зубной камень является источником нескольких различных типов биомолекул, а также микрофоссилий и может рассказать нам о человеческом хозяине, микробиоме, диете и даже профессиональной деятельности. Здесь мы представляем единый протокол, позволяющий одновременно извлекать ДНК и белки из одного образца археологического зубного камня.Мы оцениваем протокол зубного камня от шести человек из различных периодов времени и предполагаемых состояний сохранности и сравниваем его с ранее опубликованными протоколами только для ДНК и только для белков. Мы обнаружили, что большинство аспектов последующих анализов не изменяются унифицированным протоколом, хотя могут быть обнаружены незначительные сдвиги в восстановленном протеоме, такие как небольшая потеря гидрофильных белков. Общее извлечение белка зависит как от количества исходного материала, так и от выбора протокола экстракции, тогда как общее извлечение ДНК значительно снижается при использовании унифицированного протокола (в среднем 43%).Тем не менее, общее извлечение ДНК из зубного камня обычно очень высокое, и мы не обнаружили различий в характеристиках фрагментов ДНК или таксономическом профиле между протоколами. В заключение, унифицированный протокол позволяет одновременно извлекать две дополнительные линии биомолекулярных доказательств из археологических стоматологических конкрементов без ущерба для последующих результатов, тем самым сводя к минимуму необходимость деструктивного анализа этого ограниченного ресурса.

Ключевые слова

Древняя ДНК

Палеопротеомика

Микробиом полости рта

Зубной налет

Метагеномика

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

Ссылки на статьи

Удаление зуба (удаление зуба): процедура, восстановление, последующий уход

Удаление зуба в зрелом возрасте иногда необходимо.

Причины удаления зубов

Хотя постоянные зубы должны были служить всю жизнь, существует ряд причин, по которым может потребоваться удаление зубов. Очень распространенная причина — зуб, который слишком сильно поврежден из-за травмы или кариеса, чтобы его нельзя было восстановить.Другие причины включают:

Скученный рот. Иногда стоматологи вырывают зубы, чтобы подготовить полость рта к ортодонтии. Цель ортодонтии — правильно выровнять зубы, что может оказаться невозможным, если ваши зубы слишком велики для вашего рта. Точно так же, если зуб не может прорваться через десну (прорезаться), потому что для него нет места во рту, стоматолог может порекомендовать его выдернуть.

Заражение. Если кариес или повреждение распространяется на пульпу — центр зуба, содержащий нервы и кровеносные сосуды, — бактерии во рту могут проникнуть в пульпу, что приведет к инфекции.Часто это можно исправить с помощью терапии корневых каналов (РКИ), но если инфекция настолько серьезна, что антибиотики или РКИ не излечивают ее, может потребоваться удаление, чтобы предотвратить распространение инфекции.

Риск заражения. Если ваша иммунная система ослаблена (например, если вы проходите курс химиотерапии или трансплантацию органа), даже риск инфицирования конкретного зуба может быть достаточной причиной, чтобы вырвать зуб.

Заболевания пародонта (десен) . Если заболевание пародонта — инфекция тканей и костей, окружающих и поддерживающих зубы, — привело к расшатыванию зубов, возможно, потребуется удалить зуб или зубы.

Чего ожидать при удалении зуба

Стоматологи и хирурги-стоматологи (стоматологи со специальной подготовкой для проведения операций) проводят удаление зубов. Перед тем, как удалить зуб, стоматолог сделает вам инъекцию местного анестетика, чтобы обезболить область удаления зуба. В некоторых случаях стоматолог может использовать сильную общую анестезию. Это предотвратит боль во всем теле и заставит вас уснуть во время процедуры.

Если зуб поврежден, стоматолог срежет десну и костную ткань, покрывающую зуб, а затем с помощью щипцов захватит зуб и осторожно покачивает его взад и вперед, чтобы освободить его от кости челюсти и связок, которые его удерживают. место.Иногда труднодоступный зуб приходится удалять по частям.

После удаления зуба в лунке обычно образуется сгусток крови. Дантист вставит марлевую салфетку в лунку и заставит вас прикусить ее, чтобы остановить кровотечение. Иногда стоматолог накладывает несколько швов — обычно саморассасывающихся — чтобы закрыть края десны над местом удаления.

Иногда сгусток крови в лунке отрывается, обнажая кость в лунке. Это болезненное состояние называется сухой лункой.Если это произойдет, ваш стоматолог, скорее всего, наложит на лунку успокаивающую повязку на несколько дней, чтобы защитить ее от образования нового сгустка.

Что следует сказать стоматологу перед удалением зуба

Хотя удаление зуба обычно очень безопасно, процедура может позволить вредным бактериям попасть в кровоток. Ткань десен также подвержена риску инфицирования. Если у вас есть заболевание, которое подвергает вас высокому риску развития тяжелой инфекции, вам может потребоваться прием антибиотиков до и после удаления.Перед удалением зуба сообщите стоматологу всю вашу историю болезни, лекарства и добавки, которые вы принимаете, и, если у вас есть одно из следующего (обратите внимание, что этот список не является полным):

После того, как у вас был Удаление зуба

После удаления стоматолог отправит вас домой для выздоровления. Восстановление обычно занимает несколько дней. Следующее может помочь минимизировать дискомфорт, снизить риск заражения и ускорить выздоровление.

Принимайте обезболивающие в соответствии с предписаниями.
Надежно, но осторожно прикусите марлевую салфетку, наложенную дантистом, чтобы уменьшить кровотечение и дать возможность сформироваться в лунке зуба. Смените марлевые салфетки, пока они не пропитались кровью. В противном случае оставьте подушку на месте на три-четыре часа после извлечения.
Сразу после процедуры приложите пакет со льдом к пораженному участку, чтобы уменьшить отек. Прикладывайте лед на 10 минут за раз.
Расслабьтесь не менее 24 часов после удаления. Ограничьте активность на следующий день или два.
Избегайте полоскания или сильного сплевывания в течение 24 часов после экстракции, чтобы избежать смещения сгустка, образующегося в лунке.
Через 24 часа прополощите рот раствором, состоящим из 1/2 чайной ложки соли и 8 унций теплой воды.
Не пейте через соломинку первые 24 часа.
Не курите, это может помешать заживлению.
На следующий день после экстракции ешьте мягкую пищу, например суп, пудинг, йогурт или яблочное пюре. Постепенно добавляйте твердую пищу в свой рацион по мере заживления места удаления.
В положении лежа подпирайте голову подушками. Лежание на плоской подошве может продлить кровотечение.
Продолжайте чистить зубы зубной нитью и язык, но избегайте места удаления. Это поможет предотвратить заражение.

Когда обращаться к стоматологу

Это нормально — чувствовать небольшую боль после того, как действие анестезии прекратилось. В течение 24 часов после удаления зуба следует ожидать некоторого отека и остаточного кровотечения. Однако, если кровотечение или боль все еще сильны более чем через четыре часа после удаления зуба, вам следует позвонить своему стоматологу.Вам также следует позвонить своему стоматологу, если вы столкнетесь с одним из следующих симптомов:

Начальный период заживления обычно занимает от одной до двух недель. В промежуток вырастет новая ткань кости и десны. Однако со временем отсутствие зуба (или зубов) может привести к смещению оставшихся зубов, что повлияет на ваш прикус и затруднит жевание. По этой причине ваш стоматолог может посоветовать заменить отсутствующий зуб или зубы имплантатом, несъемным мостом или протезом.

Вакуумная экстракция — Клиника Мэйо

Обзор

Вакуум-экстракция, также называемая вакуум-вспомогательными родами, — это процедура, которую иногда проводят во время родов через естественные родовые пути.

Во время вагинальных родов с использованием вакуума медицинский работник применяет вакуум — мягкую или жесткую чашку с ручкой и вакуумным насосом — к голове ребенка, чтобы помочь вывести ребенка из родовых путей. Обычно это делается во время схватки, когда мать толкает ее.

Ваш лечащий врач может порекомендовать вакуум-экстракцию во время второго периода родов — когда вы толкаетесь — если роды не прогрессируют или если здоровье ребенка зависит от немедленных родов.

Хотя ваш лечащий врач может порекомендовать вакуумную экстракцию для ускорения родов, существуют потенциальные риски, в том числе риск травмы как для матери, так и для ребенка. Если вакуум-экстракция не удалась, может потребоваться кесарево сечение (кесарево сечение).

Продукты и услуги

Показать больше товаров от Mayo Clinic

Зачем это делается

Вакуумная экстракция может быть рассмотрена, если ваши роды соответствуют определенным критериям — ваша шейка матки полностью расширена, ваши мембраны разорваны, и ваш ребенок спустился в родовые пути головой вперед, но вы не можете протолкнуть ребенок вне.Вакуумная экстракция уместна только в родильных домах или больницах, где при необходимости можно сделать кесарево сечение.

Ваш лечащий врач может порекомендовать вакуумную экстракцию, если:

Вы толкаете, но работа не продвигается. Роды считаются продолжительными, если вы не достигли прогресса в течение определенного периода времени.
Сердцебиение вашего ребенка указывает на проблему. Если ваш лечащий врач обеспокоен изменениями сердцебиения вашего ребенка и необходимы немедленные роды, он может порекомендовать вагинальные роды с использованием вакуума.
У вас есть проблемы со здоровьем. Если у вас есть определенные заболевания — например, сужение аортального клапана сердца (стеноз аортального клапана) — ваш лечащий врач может ограничить время, в течение которого вы толкаетесь.

Ваш лечащий врач может предостеречь вас от вакуумной экстракции, если:

Ваша беременность меньше 34 недель
У вашего ребенка заболевание, которое влияет на прочность его или ее костей, например несовершенный остеогенез, или нарушение свертываемости крови, такое как гемофилия
Голова вашего ребенка еще не прошла середину родового канала
Положение головы вашего ребенка неизвестно
Плечи, ручки, ягодицы или ступни вашего ребенка идут по родовым путям
Ваш ребенок может не пройти через ваш таз из-за его или ее размера или размера вашего таза

Риски

Вакуумная экстракция представляет опасность для матери и ребенка.

Возможные риски для вас включают:

Боль в промежности — ткани между влагалищем и анусом — после родов
Разрыв нижних половых путей
Кратковременное затруднение мочеиспускания или опорожнения мочевого пузыря
Кратковременное или длительное недержание мочи или кала (непроизвольное мочеиспускание или дефекация)

Обратите внимание, что большинство этих рисков также связано с естественными родами без посторонней помощи.

Ваш лечащий врач может также выполнить эпизиотомию — разрез ткани между влагалищем и анусом — перед установкой вакуума.

Возможные риски для вашего ребенка включают:

Раны кожи головы
Повышенный риск застревания плеча у ребенка после родов (дистоция плеча)
Перелом черепа
Кровотечение в черепе

Серьезные травмы новорожденных после вакуумной экстракции редки.

Как вы готовитесь

Прежде чем ваш лечащий врач подумает о вакуумной экстракции, он или она могут попробовать другие способы стимулировать прогресс родов.Например, он или она может скорректировать вашу анестезию, чтобы подтолкнуть вас к более эффективному нажатию. Чтобы стимулировать более сильные сокращения, другим вариантом может быть внутривенное введение лекарства — обычно синтетической версии гормона окситоцина (питоцина). Ваш лечащий врач также может сделать разрез в ткани между влагалищем и анусом (эпизиотомия), чтобы облегчить роды.

Если вакуумная экстракция кажется лучшим вариантом, ваш лечащий врач объяснит риски и преимущества процедуры и попросит вашего согласия.Вы также можете спросить об альтернативах, обычно о кесаревом сечении.

Что вас может ожидать

Во время процедуры

Во время вакуумной экстракции вы лягте на спину, расставив ноги. Вас могут попросить взяться за ручки по бокам родильного стола, чтобы держать себя в руках при толчке.

Ваш лечащий врач вставит вакуумную чашку во влагалище, приложит чашку к голове ребенка и проверит, не застряли ли влагалищные ткани между чашкой и головой ребенка.Затем ваш лечащий врач будет использовать вакуумный насос для отсасывания.

Во время следующей схватки ваш лечащий врач быстро увеличит давление вакуумного всасывания, возьмется за ручку чашки и попытается провести ребенка по родовым путям, пока вы толкаетесь. Между схватками ваш лечащий врач может поддерживать или уменьшать давление всасывания.

После того, как голова вашего ребенка будет доставлена, ваш лечащий врач ослабит присоску и снимет чашку.

Вакуумная экстракция не всегда бывает успешной. Если ваш лечащий врач не может безопасно родить ребенка с помощью вакуума, рекомендуется кесарево сечение.

После процедуры

После родов ваш лечащий врач осмотрит вас на предмет повреждений, которые могли быть вызваны вакуумом. Любые слезы будут устранены. Если была произведена эпизиотомия, ее тоже отремонтируют.

Ваш ребенок также будет находиться под наблюдением на предмет признаков осложнений, которые могут быть вызваны вакуумной экстракцией.

Когда вы пойдете домой

Если во время родов у вас была эпизиотомия или разрыв влагалища, рана может болеть в течение нескольких недель. Сильные слезы заживают дольше.

Ожидайте, что во время выздоровления дискомфорт будет постепенно уменьшаться. Обратитесь к своему врачу, если боль усиливается, у вас поднимается температура или вы заметили признаки инфекции.

Если вы не можете контролировать дефекацию (недержание кала), проконсультируйтесь со своим врачом.

18 августа 2020 г.

Набор для экстракции из геля ДНК Monarch®

Набор для экстракции из геля ДНК Monarch быстро и надежно очищает до 5 мкг концентрированной высококачественной ДНК из гелей агарозы. В наборе используется рабочий процесс связывания / промывки / элюирования с минимальным временем инкубации и отжима. Колонки обеспечивают нулевое удерживание буфера и отсутствие уноса загрязняющих веществ, что позволяет элюировать образец в объеме всего 6 мкл.Предоставленные буферы оптимизированы и не требуют контроля pH. В отличие от других наборов, нет необходимости добавлять изопропанол в расплавленную агарозу перед загрузкой в колонку, что позволяет сэкономить один шаг. Элюированная ДНК готова для использования в рестрикционных перевариваниях, секвенировании ДНК, лигировании и других ферментативных манипуляциях. В наборах Monarch, разработанных с учетом экологических требований, используется значительно меньше пластика и экологически чистая упаковка, пригодная для вторичной переработки

Посмотрите наши видеоролики о протоколах, советах и утилизации Monarch.

Дизайн колонки для очистки ДНК Monarch
Колонки Monarch рассчитаны на высокую производительность Колонки Monarch
разработаны без фритты, что исключает удерживание буфера и риск загрязнения, обеспечивая быструю и беспроблемную очистку ДНК.
Преимущества:

Элюирование всего в 6 мкл
Предотвращение удерживания буфера и уноса солей с помощью оптимизированной конструкции колонки
Экономьте время с помощью быстрых и удобных протоколов
Нет необходимости контролировать pH или добавлять изопропанол
Буферы и колонки приобретаются отдельно
Используется значительно меньше пластика по сравнению с другими наборами
Упаковка, полученная из ответственных источников и подлежащая вторичной переработке

Технические характеристики

Аликвоты по 1 микрограмму фрагмента размером 3 т.п.н. разделяли на 1% масс. / Об. Агарозном геле, вырезали и обрабатывали различными наборами с использованием минимальных объемов элюирования, указанных производителем.Приведенные значения представляют собой данные о концентрации и чистоте, определенные по показаниям Nanodrop ™, а также расчеты извлечения, основанные на концентрации элюированной ДНК и извлеченном объеме. Набор Monarch DNA Gel Extraction Kit воспроизводимо восстанавливает ДНК в широком диапазоне молекулярных масс.
Была приготовлена смесь из 7 фрагментов ДНК в диапазоне от 10 до 0,5 т.п.н., и половина смеси была разделена на 1% геле. Каждый фрагмент вручную вырезали из агарозного геля и обрабатывали с использованием набора для экстракции из геля ДНК Monarch.Полное элюирование каждого фрагмента было разделено на новом геле с остатком от исходной смеси для сравнения. ДНК, очищенную из агарозных гелей с использованием набора для экстракции геля ДНК Monarch, можно воспроизводимо изолировать и лигировать.
Два микрограмма фрагмента размером 3 т.п.н. с совместимыми концами разделяли на 1% агарозном геле, вырезали и очищали с использованием набора для экстракции ДНК из геля Monarch DNA Gel Extraction Kit. Образцы элюировали 20 мкл и фракцию (1/4 часть от общего количества) лигировали, используя смесь Blunt / TA Ligase Master Mix (NEB # M0367).Репрезентативные образцы из 5 повторов разделяли на втором 1% агарозном геле. M представляет собой лестницу ДНК размером 1 т.п.н. (NEB # N3232).

Компоненты комплекта

В комплект поставки данного продукта входят следующие реагенты:

Тип образца ДНК:	двухцепочечная ДНК из агарозных гелей
Переплетная способность:	до 5 мкг
Диапазон размеров ДНК:	~ 50 бит до 25 кб
Обычное восстановление:	ДНК (от 50 до 10 т.п.н.): 70–90% ДНК (11–23 т.п.н.): 50–70%
Объем элюирования:	≥ 6 мкл
Чистота:	А _260/280> 1.8
Время протокола:	10 минут отжима и время инкубации
Совместимые нисходящие Приложения:	лигирование, рестрикционное переваривание, мечение и другие ферментативные манипуляции , конструирование библиотеки и секвенирование ДНК.

NEB #	Имя компонента	Компонент №	Хранится при (° C)	Сумма	Концентрация

Категории продукта:: Продукты для экстракции геля ДНК,; Продукты для очистки нуклеиновых кислот

Приложения:: Очистка нуклеиновой кислоты

Высокопроизводительный двухчасовой протокол экстракции белков стержня человеческого волоса

Abstract

Протеомный анализ человеческого волоса остается сложной задачей из-за плохой растворимости белков волос и трудностей их извлечения.В настоящем исследовании мы разработали протокол быстрой экстракции белка стержня волоса с использованием щелочного буфера. Новый протокол ускорил процедуру, сократив время экстракции по крайней мере с одного дня до менее чем двух часов, и показал выход белка 47,3 ± 3,72%. Дальнейшие анализы экстрагированного образца белка с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и квадрупольного времяпролетного масс-спектрометрического анализа выявили в общей сложности 60 белков, в том числе 25, о которых ранее не сообщалось.Ожидается, что идентификация этих белков будет иметь решающее значение для понимания молекулярной основы волос для потенциальных применений в будущем.

Образец цитирования: Wong SY, Lee CC, Ashrafzadeh A, Junit SM, Abrahim N, Hashim OH (2016) Двухчасовой протокол с высоким выходом для экстракции белков стержня волос человека. PLoS ONE 11 (10): e0164993. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0164993

Редактор: Тьерри Рабийо, Национальный центр научных исследований, ФРАНЦИЯ

Поступила: 18 марта 2016 г .; Принята к печати: 4 октября 2016 г .; Опубликовано: 14 октября 2016 г.

Авторские права: © 2016 Wong et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа финансировалась Программой грантов на фундаментальные исследования (FRGS-2015-1 (FP003-2015A)) Министерства высшего образования Малайзии, а также HIR-MOHE H-20001-00-E000009 исследовательский грант Малайского университета.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Сокращения: SDS-PAGE, электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия; QToF, квадрупольное время пролета; КАП, белки, связанные с кератином; НаноЖХ-МС / МС, наноразмерная жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией; SDS, додецилсульфат натрия; DTT, дитиотреитол; MudPIT, технология многомерной идентификации белков; βME, бета-меркаптоэтанол; ЭДТА, этилендиаминтетрауксусной кислоты; ЧАПС, 3- [3-холамидопропил) диметиламмонио] -1-пропансульфонат; Трис-HCl, трис-соляная кислота; ВЭЖХ, высокоэффективная жидкостная хроматография; % SPI, измеренная пиковая интенсивность; FDR, коэффициент ложного обнаружения

Введение

Ствол человеческого волоса состоит из трех различных слоев: мозговое вещество является самым внутренним слоем, кора головного мозга является средней частью, и самый внешний слой представляет собой чешуйчатый слой, известный как кутикула волоса [1].Было показано, что основные белки волос, кератины и связанные с кератином белки (КАП) специфически экспрессируются в соответствующих слоях стержня волоса [2]. Эти белки очень стабильны и устойчивы к ферментативной деградации [3] и, следовательно, имеют большой потенциал для использования в качестве маркеров для различных целей. Изучение КАП человека значительно продвинулось в последние годы. Однако он остается жестким и сложным из-за высокого содержания кератина и обширного перекрестного сшивания изопептидов, опосредованного трансглутаминазой, которое предотвращает солюбилизацию примерно 15% составляющего белка даже в присутствии сильных денатурирующих веществ [4].

Ранее сообщалось о различных методах экстракции белков из образцов волос. Один из наиболее часто используемых протоколов известен как метод Шиндай [5], который был разработан на основе процедуры, используемой Fujii и его коллегами для извлечения белка из волос, ногтей и шерсти. Протокол включает инкубацию образцов при 50 ° C в течение 24 часов в буфере, состоящем из 20 мМ трис-HCl (pH 8,5), 2,6 М тиомочевины, 5 М мочевины и 5% (об. / Об.) 2-меркаптоэтанола (2 -ME), известное как раствор Шиндай.Впоследствии метод Shindai был модифицирован для эффективной очистки KAP из волос человека путем добавления различных низкомолекулярных спиртов к раствору Shindai без использования 2-ME или додецилсульфата натрия (SDS) [6]. Извлечение фракций КАП и кератина из образцов волос с использованием метода Шиндай составило примерно 10 и 50% соответственно.

В другом исследовании Бартелеми и соавторов [7] был использован аналогичный раствор для экстракции с добавлением 0,1% Triton X-100 и инкубацией при 37 ° C в течение 18 часов.Однако в отчете не говорится о восстановлении белков. Вместо этого для анализа экстрагированных белков использовалась наноразмерная жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (NanoLC-MS / MS), что привело к идентификации 56 белков, включая 34 кератина и KAP.

Протоколы, используемые Barthelemy et al. [7] и ранее упомянутый метод Шиндай [5] использовали мочевину в качестве денатуранта белка. В исследовании, проведенном Kollipara и Zahedi [8], было показано, что пятая часть N-концов белков и приблизительно 2% их остатков Lys карбамилированы во время инкубации в течение ночи в присутствии 2.0 M мочевины при 37 ° C. Следовательно, группа предложила полностью избегать использования мочевины на всех этапах обработки проб.

Тем не менее, ранее сообщалось о способе экстракции белков стержня волоса без использования буфера, содержащего мочевину. Ли и соавторы [9] инкубировали образцы волос в растворе, состоящем из 2% SDS, 50 мМ фосфата натрия (pH 7,8) и 20 мМ дитиотреитола (DTT), и инкубировали в течение ночи при 65 ° C. Результаты показали, что первые две обработки SDS-DTT смогли удалить примерно 80% всего экстрагированного белка.Кроме того, в исследовании также сообщается, что в шести экспериментах конечный нерастворимый материал составлял 13,3 ± 3,9% от общего белка. Однако точный процент извлечения всего экстрагированного белка в этом исследовании не упоминается. Хотя в их отчете не упоминается восстановление белков, в ходе исследования было успешно идентифицировано более сотен белков с использованием технологии многомерной идентификации белков (MudPIT).

Настоящее исследование было направлено на разработку быстрого метода экстракции белков с высоким выходом из стержня человеческого волоса и сравнение его с ранее описанными методами с точки зрения их процентного восстановления и эффективности.Разработка улучшенного протокола экстракции белков стержня волоса может открыть новые возможности для изучения их роли в молекулярных путях и их потенциального применения в качестве маркеров.

Материалы и методы

Подготовка образцов волос

Образцы стержня волос были собраны у 10 неродственных добровольцев с равным количеством мужчин и женщин в возрасте от 21 до 40 лет. Субъекты были исключены, если у них были проблемы с волосами или кожей головы, включая воспаление кожи, рак кожи, а также бактериальную или грибковую инфекцию.Исключались также лица, чьи волосы подвергались химической обработке. Письменное информированное согласие было получено от всех участников до сбора образцов. Это исследование и процедура его получения одобрены Этическим комитетом Медицинского центра Университета Малайи (UMMC) (институциональным наблюдательным советом) в соответствии с рекомендациями ICH-GCP и Хельсинкской декларацией (исх. Номер: UM.TNC2 / RC / 2H & E / UMREC-64). Образцы волос стерилизовали 90% этанолом и разрезали на части длиной примерно 1 см с помощью пары стерильных лабораторных ножниц перед инкубированием в буфере для лизиса.

Экстракция белка волос

Условия экстракции.

Пять мг образца волос длиной 1 см обрабатывали 300 мкл лизирующего буфера, который содержал NaOH (0,1 М и 0,2 М) и додецилсульфат натрия (SDS; 1% и 2%), бета-меркаптоэтанол (β -МЕ, 2%) и этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, 0,01 М). Все смеси инкубировали при 90 ° C в течение 10 минут (таблица 1). Смесь переносили в спин-колонки QIAquick (Qiagen) и центрифугировали при 16000 об / мин в течение 5 минут для разделения нерастворенных фракций волос и супернатанта.Образец белка дополнительно очищали и осаждали путем смешивания 1 объема надосадочной жидкости с 4 объемами предварительно охлажденного ацетона. Осажденный белок восстанавливали в буфере для образцов, содержащем 7 М мочевину, 2 М тиомочевину, 4% 3- [3-холамидопропил) диметиламмонио] -1-пропансульфонат (CHAPS), 2% амфолитов и 5% глицерина. Все восстановленные образцы белка позже хранили при 4 ° C. Количество белка, извлеченного из каждого эксперимента, измеряли колориметрическим методом Брэдфорда [10]. Процент восстановления белка рассчитывали на основе общего количества экстрагируемых белков волос каждого индивидуума, которое представляло собой массу всего волокна использованного образца волос.Буфер для лизиса, обеспечивающий максимальное извлечение белка, был выбран для последующих экспериментов.

Образцы 5 мг были погружены в состав щелочного буфера для лизиса и инкубированы в течение 5, 10, 20, 30 и 40 минут при 90 ° C. Пробирку с 5 мг волос, аналогичным образом погруженную в буфер для лизиса, также использовали в качестве контроля эксперимента и оставляли при комнатной температуре на 60 минут. Смеси обрабатывали, и концентрацию белка в каждом образце измеряли, как описано ранее. График был построен на основе среднего восстановления веса (%) белка волос у всех десяти человек для определения оптимального времени инкубации.Примерно 100 мкг образца белка, полученного за каждый период инкубации, разделяли электрофорезом в 12% -ном полиакриламидном геле додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). SDS-PAGE выполняли на мини-гелевой системе Bio-Rad при 150 В в течение 2 часов. Гель окрашивали серебром, как описано ранее [11], и, наконец, сканировали с помощью ImageScanner III и анализировали с помощью программного обеспечения GelAnalyzer 2010.

Дополнительная экстракция белка.

Для максимального извлечения белка из стержня человеческого волоса экстракцию проводили в два этапа.Первую стадию экстракции проводили в соответствии с условиями, испытанными в более ранних экспериментах, когда образец волос от индивидуума был погружен в 300 мкл сформулированного щелочного буфера для лизиса и инкубирован в оптимальное время, полученное при 90 ° C. Во время второго этапа экстракции нерастворенные фракции волос из предыдущей экстракции переносили с помощью пары стерильных пинцетов в свежую пробирку, содержащую 300 мкл лизирующего буфера с различными концентрациями NaOH (0.1, 0,15 и 0,2 М).

После получения оптимальной концентрации NaOH был введен другой подход, который включал механические силы путем магнитного перемешивания, чтобы увеличить извлечение белка из второй стадии экстракции. Фракции волос, оставшиеся после первой стадии экстракции, переносили в 300 мкл щелочного буфера для лизиса, содержащего подходящую концентрацию NaOH. Его позволяли измельчить с помощью магнитной мешалки при комнатной температуре. Растворы фильтровали, осаждали и оценивали концентрацию белка с использованием метода Брэдфорда, а восстановление рассчитывали на основе веса всего волокна волос.Проведено сравнение эффективности метода с магнитной мешалкой и без нее.

После достижения наиболее подходящего метода экстракции белка для обеих стадий экстракции, протокол был выполнен на десяти людях для расчета среднего процента извлечения. Разделение SDS-PAGE было также выполнено для сравнения концентрации белков, полученных на двух стадиях экстракции. Белки, полученные из обоих экстрактов индивидуальных волос, были идентифицированы с помощью масс-спектрометрии и поиска в базе данных.Условия, использованные при выполнении SDS-PAGE, были упомянуты ранее.

Сравнение методов экстракции белков

Помимо использования метода щелочного лизиса, разработанного в настоящем исследовании, экстракцию белков волос также проводили с использованием ранее описанных методов Fujii et al. (т.е. метод Шиндай) [5] и Lee et al. [9]. В методе Shindai образцы волос погружали в 300 мкл лизирующего буфера, который состоит из 20 мМ трис-соляной кислоты (Трис-HCl) (pH 8.5), 2,6 M тиомочевины, 5 M мочевины и 5% (мас. / Об.) 2-меркаптоэтанола при 50 ° C в течение 24 и 48 часов [5], в то время как в методе, разработанном Ли и соавторами [9], образцы волос кратковременно ополаскивали в 300 мкл буфера для лизиса, содержащего 2% SDS, 50 мМ фосфата натрия (pH 7,8), и осушали. Позднее волосы погружали в тот же буфер для лизиса с добавлением дитиотреитола (DTT, 20 мМ) и инкубировали в течение ночи при 65 ° C. Его измельчали с помощью магнитной мешалки в течение часа при комнатной температуре, и растворимые и нерастворимые материалы разделяли центрифугированием.Нерастворимый материал снова погружали в тот же буфер и инкубировали в течение ночи. Это повторяли еще четыре раза, чтобы извлечь как можно больше нерастворимых белков [9], перед фильтрацией и осаждением. Растворы белков, полученные от одного и того же человека с использованием трех различных методов экстракции, были окончательно измерены и сравнены с использованием колориметрического метода Брэдфорда [10].

Анализ МС

Полосы из гелей SDS-PAGE, которые вместо этого окрашивали кумасси бриллиантовым синим R250, вырезали с помощью стерильного скальпеля.Гель вырезали как можно ближе к полосе, без излишков вокруг нее. Дорожку целиком разрезали на 8–12 срезов, независимо от профиля окрашивания. Затем полосы разрезали на кусочки размером 1 x 1 мм и помещали в пробирку Lobind Eppendorf на 1,5 мл. После удаления полос геля проводили восстановление и алкилирование белков для предотвращения образования дисульфидных связей с использованием DTT и йодацетамида соответственно. В геле триптическое расщепление проводили с использованием 6 нг / мкл трипсина в 50 мМ бикарбонате аммония (Sigma, Steinheim, Германия) в течение ночи при 37 ° C как часть подготовки образца для масс-спектрометрической идентификации белков.Экстракцию пептидов из срезов геля первоначально проводили с использованием 50 мкл 50% ацетонитрила, а затем 50 мкл 100% ацетонитрила, которые лиофилизировали в вакуумной центрифуге. Наконец, перед идентификацией белка была проведена очистка колонки Ziptip-C18 (Millipore).

Затем

пептидов восстанавливали в 10 мкл 0,1% муравьиной кислоты. Разделение пептидов выполняли с помощью системы ВЭЖХ 1260 Infinity Nanoflow (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США), напрямую подключенной к Accurate-Mass Q-TOF 6550 с источником ионизации электрораспылением наночастиц.Вкратце, пептиды разделяли на колонке с чипом большой емкости для ВЭЖХ (Zorbax 300SB-C18, 160 нл обогащающая колонка и аналитическая колонка 75 мкм × 150 мм и частицы 5 мкм, Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США) с 5–70% линейный градиент растворителя B (0,1% муравьиная кислота в 100% ацетонитриле) в течение 15 мин со скоростью потока 0,4 мкл / мин. Масс-спектры получали с использованием программного обеспечения для сбора данных Mass Hunter (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США). За каждым циклом получения масс-спектров (5,225 секунды со скоростью сбора 20 спектров в секунду от 200 до 3000 m / z) следовала индуцированная столкновением диссоциация двадцати наиболее интенсивных ионов.Данные МС / МС были получены в диапазоне 50–3200 m / z.

Поиск в базе

Программное обеспечение Spectrum Mill

(Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США) было настроено для поиска данных, полученных с помощью МС / МС, в базах данных Swiss-Prot (обновлено 3 ^от декабря 2015 г.) человек ( Homo sapiens ) (168628 входных последовательностей) . Допуск по массе для ионов предшественника и продукта составлял ± 20 и ± 50 частей на миллион соответственно. Так как йодацетамид использовался для целей алкилирования во время подготовки образца, карбамидометилирование было определено как фиксированная модификация, а окисленный метионин — как переменная модификация.Сдвиг массы предшественника был установлен в диапазоне от -18 Да до 177 Да, чтобы принять во внимание различные модификации, такие как присутствие аддуктов натрия и калия. Идентифицированные белки или пептиды были проверены с помощью Spectrum Mill на основе настроек программного обеспечения по умолчанию. Критерии включения включали оценку белка более 20, оценка пептидов> 10 и интенсивность пика по шкале (% SPI)> 70%. Белки, имеющие по крайней мере один пептид, были сгруппированы вместе. Идентифицированные белки затем фильтровали для достижения коэффициента ложного обнаружения (FDR) <1% для совпадений пептидного спектра.

Scaffold (версия Scaffold_4.4.6, Proteome Software Inc., Портленд, Орегон) использовали для проверки идентификации пептидов и белков на основе Spectrum Mill с использованием алгоритма x-тандем (GPM, thegpm.org; версия CYCLONE (2010.12.01.1)). Идентификация пептидов принималась, если FDR менее 0,1% мог быть установлен с помощью алгоритма Peptide Prophet [12]. Идентификация белков принималась, если можно было установить вероятность более 95,0% и если белок содержал не менее 2 идентифицированных пептидов.Вероятности белков определялись алгоритмом Protein Prophet [13]. Белки, обладающие значительными пептидными доказательствами, были сгруппированы в кластеры, и были идентифицированы исключительно уникальные пептиды каждого белка.

Результаты

Состав щелочного буфера для лизиса

В таблице 1 показано влияние SDS и NaOH на эффективность экстракции белков стержня человеческого волоса. В этом эксперименте температура и время инкубации поддерживались постоянными на уровне 90 ° C и 10 минут соответственно, в то время как реагенты и концентрации SDS и NaOH изменялись в присутствии 2% β-ME и 0.01 М ЭДТА. В буфере для лизиса, содержащем только SDS или NaOH, белок не выделялся. Выход экстракции был увеличен с 8% до 19%, когда в эксперименте использовали 0,2 М NaOH вместо 0,1 М NaOH. Между тем, увеличение концентрации SDS с 1% до 2% в 0,01 М NaOH привело к минимальному увеличению процента извлечения на 1%. Наивысший процент восстановления был достигнут при использовании буфера, содержащего 0,2 М NaOH, 1% SDS, 2% β-ME и 0,01 M EDTA.

Определение оптимального времени инкубации

Панель (а) на рис. 1 демонстрирует временной прогресс инкубации для экстракции белков из стержня человеческого волоса у 10 человек с использованием буфера, содержащего 0.2 M NaOH, 1% SDS, 2% β-ME и 0,01 M EDTA. Волосы (5 мг) инкубировали в разные периоды инкубации (5, 10, 20, 30 и 40 минут), чтобы определить оптимальное время для получения наибольшего выхода белка. Выход для контроля составил 2,7 ± 1,02%, когда инкубационную смесь оставляли при комнатной температуре на час. Статистический анализ проводился с использованием теста Краскела-Уоллиса, и значимые различия (p <0,05) наблюдались между контролем до 20 минут, контролем до 40 минут, контролем до 30 минут, от 5 до 20 минут и от 5 до 30 минут.Степень экстракции достигла плато через 30 минут с выходом белка 33,8 ± 0,61% через 30 минут и 32,6 ± 0,65% через 40 минут. Не было обнаружено существенной разницы в восстановлении белка через 20-30 минут и от 30 до 40 минут инкубации. Затем экстрагированные белки стержня волоса подвергали SDS-PAGE (фиг. 1, панель (b)), и полученные полосы анализировали с использованием программного обеспечения GelAnalyzer 2010. Четыре различных буфера для образцов, включая (а) буфер Лэммли, (б) Трис-HCl pH 7.8, (c) Трис-физиологический раствор pH 8,0 (150 мМ хлорида натрия, 1% Nonidet P-40 / Triton X-100, 50 мМ Tris) и (d) буфер для щелочного лизиса (7 M мочевина, 2 M тиомочевина, 4% 3 - [(3-Холамидопропил) диметиламмонио] -1-пропансульфонат (CHAPS), 2% амфолитов и 5% глицерина) были первоначально испытаны в попытке полностью растворить осажденные ацетоном гранулы перед SDS-PAGE. Наши результаты показали, что гранулы не только полностью растворяются только в щелочном буфере для лизиса, но также не образуют осадка при хранении при 4 ° C.На рис. 1, панель (c) показано увеличение необработанных объемов полос с более длительными периодами инкубации, причем 30 минут являются максимальными, а затем уменьшаются через 40 минут инкубации.

Рис. 1. Временной ход инкубации для извлечения белков из стержня человеческого волоса.

(a) График показывает процент восстановления белка, полученный при инкубации волос в течение 5, 10, 20, 30 и 40 минут при 90 ° C. Минута 0 действует как контроль эксперимента, в котором инкубационная смесь оставляется при комнатной температуре на 60 минут.Каждое значение представляет собой средний процент восстановления десяти человек. (b) Типичный гель SDS-PAGE, показывающий белки, экстрагированные с использованием настоящего метода, когда волосы индивидуума инкубировали в течение 5-40 минут в щелочном буфере для лизиса при 90 ° C вместе с контролем. Дорожка 1 представляет собой контроль. Дорожки 2-6 показывают полосы, полученные за 5, 10, 20, 30 и 40 минут соответственно. (c) Исходный объем кератиновых полос (дорожки 1–6), полученный из типичного рисунка геля из SDS-PAGE.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0164993.g001

Экстракция дополнительных белков

В следующем эксперименте были предприняты попытки увеличить извлечение путем выполнения дополнительной экстракции с использованием оставшихся фракций волос. На первом этапе экстракции белки аналогичным образом экстрагировали с использованием 0,2 М NaOH и инкубировали при 90 ° C в течение 30 минут, в результате чего средний выход белка составлял 45,22 ± 2,3% (таблица 2). Во второй экстракции извлечение белка снижалось, когда концентрация NaOH была увеличена с 0.От 1 M до 0,2 M при постоянной температуре инкубации 90 ° C. Когда оставшиеся фракции волос были измельчены в щелочном буфере для лизиса, содержащем 0,1 М NaOH, с использованием магнитной мешалки и при комнатной температуре, было получено максимальное извлечение белка на уровне 19 ± 0,17% (таблица 2). Следовательно, магнитная мешалка использовалась во всех последующих экспериментах, поскольку она, по-видимому, увеличивала эффективность экстракции белков на втором этапе экстракции. Взятые вместе, средний общий процент извлечения белков из обоих экстрактов 5 мг стержня волоса 10 человек составил 47.3 ± 3,72%. Это включает (i) экстракцию белков на первой стадии, которая позволила восстановить до 33,8 ± 2,37% веса волос, и (ii) последующую экстракцию оставшихся фракций стержня человеческого волоса, что привело к дополнительному 13,4 ± 1,92%.

Сравнение с методом Shindai и методом Lee et al.

Настоящее исследование также сравнивает эффективность экстракции белка настоящим методом с ранее разработанными протоколами Fujii et al.(т.е. метод Шиндай) [5] и метод Ли и соавторов [9]. Протоколы, используемые в каждом из методов экстракции белка, показаны на рис. 2. В таблице 3 показаны результаты экспериментов. Заметное улучшение наблюдалось при сравнении наших данных с протоколами экстракции белка с использованием метода Shindai [5] и Lee et al. [9] для тех же 5 мг стержня волоса. Скорости экстракции белка также рассчитывались и сравнивались между тремя различными экстракциями. Для метода щелочного лизиса скорость экстракции белка составила 43.17% / час, в то время как метод Ли [9] дает скорость извлечения 0,38% / час. С другой стороны, скорость экстракции методов 1 и 2 Shindai [5] составляла 0,974% / час и 0,336% / час, соответственно.

Идентификация белков стержня волоса масс-спектрометрией

Когда белки, экстрагированные с использованием метода, разработанного в настоящем исследовании, подверглись анализу LC MS / MS Q-ToF и запросу в базу данных, всего было идентифицировано 60 белков. Из 60 белков 14 были обнаружены только на первой стадии экстракции, а 20 были обнаружены исключительно на второй стадии экстракции (таблица 4 и рис. 3).На обеих стадиях экстракции белка также было обнаружено 26 общих белков (рис. 3). Все идентифицированные белки также были разделены на некератиновые белки, кератиновые белки и связанные с кератином белки (рис. 4).

Обсуждение

Поскольку волосы портятся очень медленно, с прошлого века он широко используется в судебно-медицинских исследованиях. Кроме того, редко описывались другие возможности этого легко получаемого и химически стабильного биологического образца. Доступные в настоящее время методы экстракции белков из образцов волос трудоемки и сложны из-за плохой растворимости белков волос и сложности их экстракции, вызванной наличием высокосшитых дисульфидных связей [3].В настоящем исследовании щелочной буфер для лизиса, подобный тому, который используется для очистки плазмид от хромосомной ДНК, был составлен для экстракции белков из стержня человеческого волоса [14].

Эффект додецилсульфата натрия (SDS) на потерю белка во время экстракции был исследован ранее [15]. Исследование показало, что потеря белка была примерно в два раза выше в присутствии SDS, чем в воде, и большая потеря наблюдалась при повышении температуры. В настоящем исследовании NaOH использовался для разрыва дисульфидных связей белков волос, но он работал только в присутствии SDS.Наше исследование также показало, что белки не экстрагировались только в присутствии SDS или NaOH. Следовательно, в этом случае SDS, возможно, способствовал действию NaOH, создавая дыры в мембранах волосковых клеток [16]. Затем экстрагированные белки растворяли в буфере для образцов для поддержания стабильности и выдерживали при 4 ° C, чтобы избежать повторного образования дисульфидных связей [17]. Однако использование сильной щелочи в настоящем исследовании может также привести к дезамидированию остатков Asn и Gln белков. Как Asn, так и Gln деамидат путем прямого гидролиза и протекает через глутаримидное промежуточное соединение в щелочных или нейтральных условиях [18].Эту деятельность необходимо проанализировать отдельно в будущей работе.

Настоящее исследование также продемонстрировало, что нагревание необходимо для увеличения восстановления белков. Во время первой экстракции нагревание фрагментов стержня волоса в течение более длительного периода времени позволило увеличить выход белков из волос, возможно, включая те, которые были более устойчивы к нагреванию [19]. Однако к 30 минутам было достигнуто плато, и дальнейшее нагревание в течение 40 минут не привело к увеличению выхода.Несмотря на то, что результаты статистического анализа не показали значительной разницы (p <0,05) в восстановлении белка через 20–30 минут и 30–40 минут инкубации, оптимальное время инкубации в этом исследовании было выбрано на 30 минут из-за полученного максимального восстановления белка. .

Наше исследование также показало, что вторая экстракция, которая включала выделение белков из оставшихся фракций волос, была необходима для максимального извлечения белков из стержня человеческого волоса. Однако это было возможно только тогда, когда концентрация NaOH из того же щелочного буфера для лизиса, который использовалась при первой экстракции, была снижена с 0.От 2 до 0,1 М. Кроме того, во время второй экстракции также избегали нагревания, чтобы предотвратить возникновение гидролиза. Было обнаружено, что для дальнейшего увеличения эффективности экстракции белков на второй стадии экстракции необходимо механическое усилие путем перемешивания магнитной мешалкой при комнатной температуре.

Наш недавно разработанный протокол по сравнению с ранее описанным методом Shindai [5] и методом, разработанным Lee et al. [9], привело не только к увеличению извлечения белков из стержня волоса, но и к сокращению продолжительности экстракции.По сравнению с методом Шиндай [5] настоящий метод был примерно в три раза более эффективным, исходя из общего процента извлечения белков. Требуемое время экстракции было сокращено с 24 до 1,5 часов. Более того, дополнительные 24 часа инкубации с использованием метода Шиндай [5] также не привели к более высокому проценту восстановления.

Для полного растворения осадка белка для анализа с помощью SDS-PAGE было протестировано несколько буферов для образцов. Наше исследование показало, что буфер, содержащий мочевину, был единственным буфером для образца, который был способен полностью растворить осадок.Скорее всего, это связано с высокой стабильностью кератинов, которая препятствует их растворимости, а также усвояемости протеолитическими ферментами и белковыми растворителями. Исследование Speakman [20] продемонстрировало важность боковых связей между параллельными полипептидными цепями, связи дисульфидной группы цистеина и полярной связи диамино- и дикарбоновых кислот, которые способствуют стабильности молекулы кератина.

Наш анализ QToF LC / MS позволил идентифицировать в общей сложности 60 белков, экстрагированных из 5 мг стержня волоса человека с использованием протокола щелочного лизиса.На втором этапе было обнаружено больше белков по сравнению с первым этапом экстракции белка стержня человеческого волоса. Некоторые белки (таблица 4b) были обнаружены исключительно на второй стадии экстракции. Эти белки можно было извлечь только при приложении механической силы к волосам, которые были погружены в свежий щелочной буфер для лизиса. С другой стороны, кератин, такой как кератин 83 (номер доступа A0JNT2) и кератин 37 (номер доступа Q6A165), были идентифицированы только на первом этапе экстракции белка.Открытие того, что некоторые белки присутствовали только в первой или второй экстракции волос, предполагает, что они имеют обширные взаимодействия с другими клеточными компонентами, такими как те, что находятся в межклеточных соединениях и на периферии ядра [21]. Белки, которые присутствуют в коре волос, могут быть легко извлечены без солюбилизации границ клеток [22]. Следовательно, кератины, обнаруженные на втором этапе экстракции, скорее всего, происходят из кутикулы и мозгового вещества волоса.

По сравнению с исследованием Ли с соавторами [9], в котором было идентифицировано более сотни белков, в нашем исследовании было идентифицировано только 60 белков. Однако большинство белков, идентифицированных Lee et al. использование MudPIT происходило в основном из несолюбилизированной (перекрестно-сшитой) фракции, в то время как наше исследование, проведенное с помощью анализа QToF, было сосредоточено на солюбилизированных белках. Доказано, что использование метода MudPIT в исследовании Ли с соавторами является мощным высокопроизводительным инструментом для разделения сложных смесей пептидов [23].Также было обнаружено, что MudPIT дает лучшие результаты даже для относительно простой выборки по сравнению с методом одномерного ЖХ [24]. Несмотря на различия в методах, используемых для идентификации белков, наше настоящее исследование, в котором белки разделялись по размеру с помощью SDS-PAGE, смогло идентифицировать 25 белков, о которых ранее не сообщалось в данных Ли и его коллег. Обнаружение этих белков может быть связано с другим методом экстракции и / или улучшениями базы данных. Среди 60 белков, идентифицированных с помощью нашего анализа QToF LC / MS, 31 идентифицированный белок был кератином, 28 — некератином, в то время как был обнаружен только один связанный с кератином белок.В нашем исследовании мы обнаружили присутствие галектина и галектина-7 в стержне человеческого волоса. Хотя это кажется улучшением по сравнению с методом Ли [9], который обнаруживал только галектин-7, это также может быть связано с изменчивостью образцов волос. Помимо стержня человеческого волоса, галектин-7, как известно, экспрессируется в межфолликулярном эпидермисе пищевода, оральном эпителии, роговице и тельцах Хассалла тимуса, и, следовательно, его можно рассматривать как маркер всех подтипов кератиноцитов [25].Предыдущее исследование Wollina с соавторами [26] обнаружило экспрессию галектинов-1 во внешней и внутренней оболочках корня волос мышей. Было обнаружено, что эти эндогенные лектины в значительной степени зависят от цикла волос. Однако об исследовании связанной с циклом экспрессии галектина-1 и его сайтов связывания во время цикла человеческого волоса не сообщалось.

Выводы

В настоящем исследовании был недавно разработан метод щелочного лизиса для извлечения белков стержня волоса. Существенно более высокий процент восстановления белка был достигнут с использованием этого метода по сравнению с ранее описанным методом Shindai [5] и протоколом Lee et al.[9]. Помимо простоты и воспроизводимости, время экстракции с использованием метода щелочного лизиса было сокращено с пяти дней или 48 часов до всего лишь 90 минут. Настоящее исследование также идентифицировало 60 белков с помощью анализа QToF, из которых 25 белков не были описаны в предыдущих данных Lee и соавторами [9]. Это может открыть дверь для более глубоких исследований основного анализа белков стержня человеческого волоса, маркеров заболеваний и изучения молекулярных путей, которые могут привести к новым терапевтическим целям.

Благодарности

Эта работа финансировалась Программой грантов на фундаментальные исследования (FRGS-2015-1 (FP003-2015A)) Министерства высшего образования Малайзии, а также исследовательским грантом HIR-MOHE H-20001-00-E000009 Университета. Малайи.

Вклад авторов

Концептуализация: CCL OHH.
Обработка данных: SYW CCL.
Формальный анализ: SYW CCL AA.
Получение финансирования: CCL SMJ OHH.
Расследование: SYW CCL AA NA.
Методология: CCL.
Администрация проекта: CCL OHH.
Ресурсы: CCL SMJ OHH.
Надзор: CCL OHH.
Подтверждение: SYW CCL AA.
Визуализация: SYW CCL.
Написание — первоначальный черновик: SYW CCL.
Написание — просмотр и редактирование: OHH.

Список литературы

1. Хьюз К. Проблемы тестирования ДНК и судебно-медицинской экспертизы образцов волос. Судебно-медицинская экспертиза на месте происшествия в журнале Lab. 2013.
2. Langbein L, Schweizer J. Кератины волосяного фолликула человека. Int Rev Cytol. 2005; 243: 1–78. pmid: 15797458
3. Хан МО, Чун Дж.А., Ли У.Х., Ли Дж.В., Чунг Ч. Простой улучшенный метод экстракции белка из волос на голове человека. J Cosmet Sci. 2007. 58 (5): 527–34.pmid: 17938828
4. Лаач К.Н., Дурбин-Джонсон Б.П., Рок Д.М., Муквана С., Ньюленд А.Б., Флаглер М.Дж. и др. Протеомный профиль стержня человеческого волоса: индивидуальные различия, локальная специфичность и анализ кутикулы. PeerJ. 2014; 2: e506. pmid: 25165623
5. Фуджи Т.Л., Д. Получение и свойства белковых пленок и частиц из куриного пера. J Biol Macromol. 2008. 8 (2): 48–55.
6. Fujii TT, S. Ito Y. Новая процедура очистки кератин-ассоциированных белков и кератина из человеческих волос.J Biol Macromol. 2013. 13 (3): 92–106.
7. Barthelemy NR, Bednarczyk A, Schaeffer-Reiss C, Jullien D, Van Dorsselaer A, Cavusoglu N. Протеомные инструменты для исследования структурных белков человеческого волоса и доказательства слабых мест на сегментах кератиновой спирали волос. Анальная биохимия. 2012; 421 (1): 43–55. pmid: 22056946
8. Коллипара Л., Захеди Р.П. Карбамилирование белков: модификация in vivo или артефакт in vitro? Протеомика. 2013; 13 (6): 941–4. pmid: 23335428
9.Ли Ю.Дж., Райс Р.Х., Ли Ю.М. Протеомный анализ стержня человеческого волоса: от идентификации белков до посттрансляционной модификации. Протеомика клеток Mol. 2006. 5 (5): 789–800. pmid: 16446289
10. Редмайл-Гордон М.А., Армениз Э., Уайт Р.П., Хирш П.Р., Гулдинг К.В. Сравнение двух колориметрических анализов, основанных на методах Лоури и Брэдфорда, для оценки общего белка в почвенных экстрактах. Почва Биол Биохим. 2013. 67 (100): 166–73. pmid: 24302786
11. МакЛеннан А.Т., П.Бейтс А. Молекулярная биология. 5-е изд. Соединенные Штаты Америки: Garland Science, Taylor and Francis Group, LLC; 2013 12 января 2016.
12. Келлер А., Несвижский А.И., Колкер Э., Эберсолд Р. Эмпирическая статистическая модель для оценки точности идентификации пептидов с помощью MS / MS и поиска в базе данных. Anal Chem. 2002. 74 (20): 5383–92. pmid: 12403597
13. Несвижский А.И., Келлер А., Колкер Э., Эберсольд Р. Статистическая модель для идентификации белков с помощью тандемной масс-спектрометрии.Anal Chem. 2003. 75 (17): 4646–58. pmid: 14632076
14. фон дер Хаар Т. Оптимизированная экстракция белка для количественной протеомики дрожжей. PLoS One. 2007; 2 (10): e1078. pmid: 17957260
15. de Cassia Comis Wagner R, Joekes I. Удаление белка с волос додецилсульфатом натрия. Коллоиды Surf B Биоинтерфейсы. 2005. 41 (1): 7–14. pmid: 15698750
16. Миледи. Стандартная профессиональная парикмахерская Миледи. Соединенные Штаты Америки: Эрин О’Коннор; 2011 г.812 с.
17. Vajpayee RBS, Pandey N., Titiyal, J S.K .. Факоэмульсификационная хирургия. Нью-Дели, Индия: Japyee Brothers Medical Publishers (P) Ltd; 2005. 325 с.
18. Райт ХТ. Неферментативное дезамидирование аспарагинильных и глутаминильных остатков в белках. Crit Rev Biochem Mol Biol. 1991; 26 (1): 1–52. pmid: 1678690
19. Кавасима Ю., Кодера И., Сингх А., Мацумото М., Мацумото Х. Для эффективной экстракции белков из фиксированных формалином тканей, залитых парафином, требуется более высокая концентрация трис (гидроксиметил) аминометана.Clin Proteomics. 2014; 11 (1): 4. pmid: 24484752
20. Speakman JB. Реакционная способность серной связи в шерсти. Природа. 1933; 132: 930.
21. Джабали К. Цитоскелетные белки, соединяющие промежуточные филаменты с цитоплазматической и ядерной периферией. Histol Histopathol. 1999. 14 (2): 501–9. pmid: 10212812
22. Райс Р.Х., Вонг В.Дж., Пинкертон К.Э. Ультраструктурная визуализация сшитых белков в придатках эпидермиса. J Cell Sci.1994; 107 (Pt 7): 1985–92. pmid: 7983163
23. Poestsch AaW, D. Подготовка образцов для MudPIT с образцами бактериального белка. 2008. В: Приготовление образцов протеомики [Интернет]. Германия: Wiley-Vch Verlag GmbH and Co .; [358].
24. Вашберн М.П. Использование наборов данных протеомики, созданных с помощью технологии многомерной идентификации белков (MudPIT). Краткая функция геномной протеомики. 2004. 3 (3): 280–6. pmid: 15642190
25. Гупта Г.С. Лектины животных: форма, функция и клиническое применение.Springer. 2012; 1.
26. Воллина Ю., Ланге Д., Паус Р., Бурхерт М., Габиус Х.Дж. Экспрессия галектина-1 и -3 и доступных сайтов связывания во время цикла мышей. Histol Histopathol. 2000. 15 (1): 85–94. pmid: 10668199

Ресурсы — Анализы Arbor | Анализы Arbor

ChemExper	http://www.chemexper.com/ Химический справочник, полезный для определения физических и химических свойств, похожих / родственных химикатов, поставщиков и т. Д.
Проект Human Atlas	http://www.proteinatlas.org Доступный для поиска веб-сайт, на котором представлена карта протеома человека на основе тканей. Обобщены текущие знания о протеоме человека, полученные с помощью методов на основе антител в сочетании с транскриптомическим анализом всех основных тканей и органов человеческого тела.
Международное общество эндокринологии дикой природы (ISWE)	https: // www.iswe-endo.org Заявление о цели: Международное общество эндокринологии дикой природы — это некоммерческая организация, которая обеспечивает форум для сотрудничества и обмена информацией в целях развития науки об эндокринологии дикой природы. Наши члены разрабатывают и применяют инновационные подходы к изучению здоровья, воспроизводства, благополучия и сохранения дикой природы.
Каталог иммунологических и биологических реагентов Linscott	Каталог иммунологических и биологических реагентов Линскотта
Медицинские лаборатории Майо	http: // www.mayomedicallaboratories.com Сайт справочных лабораторий клиники Майо, полезный для поиска человеческих референсных диапазонов для различных аналитов в различных биологических образцах. Доступен для поиска по тестам или по болезненному состоянию.
Шаблоны сокращения данных MyAssays для наборов для анализа DetectX®	Шаблоны сокращения данных для наборов для анализа DetectX ^® доступны по адресу: http: // www.MyAssays.com/arbor-assays
Базы данных NCBI — PubMed	Полезное резюме ссылок на литературу для поиска установленных диапазонов концентраций интересующих молекул в различных видах, типах образцов и т. Д. В базах данных NCBI.
NIST — Химия	http: // webbook.nist.gov/chemistry/name-ser.html Используется для определения химических свойств обычных биологических молекул.
Органические растворители: таблица свойств	https://www.organicdivision.org/ama/orig/organic_solvents.html Таблица свойств обычных органических растворителей, обнаруженных в лаборатории
Организация	https: // www.organomation.com/ Компания, поставляющая приборы для пробоподготовки, например, используемые для выпаривания и экстракции.
Ветеринарная медицина Австрия	Специальный выпуск журнала «Ветеринарная медицина Австрии» по итогам 3-й ежегодной (2012 г.) конференции ISWE в Вене, Австрия. Есть как новые информационные статьи, так и всесторонние обзоры, в том числе статьи многих основных докладчиков, посвященные широким вопросам эндокринологии.Все статьи представлены на немецком и английском языках. Щелкните слово «anzeigen», чтобы просмотреть каждую статью, а в конце статьи есть кнопка «скачать», чтобы получить PDF-файл.
Анализы дикой природы	https://www.arborassays. Об авторе alexxlab administrator Оставить ответ Отменить ответ Рубрики Вложен Вложения Заработ Заработок Начать Новичк Новичкам Разное С чего начать Совет Советы Фриланс © 2019 ICQ Information Center