Оформление выписки из протокола образец: Выписка из протокола — общего собрания, образец, аттестационной комиссии на соответствие, педагогического совета

Оформление выписки из протокола образец: Выписка из протокола — общего собрания, образец, аттестационной комиссии на соответствие, педагогического совета

Содержание

образец и порядок составления, кто ее подписывает

Юридические лица, созданные на основании членства в них граждан и иных организаций, решают основные вопросы деятельности на общем собрании участников, которое является высшим органом управления. Уставами или положениями устанавливается его компетенция и определяется, решения по каким вопросам правомочны принимать все участники.

К таким организациям, образованным по принципу членства, относятся хозяйственные общества, наиболее распространенными из них являются акционерные и общества с ограниченной ответственностью, а также некоммерческие объединения граждан и юридических лиц: всевозможные ТСЖ, СНТ, ЖСК, некоммерческие партнерства, ассоциации и союзы.

Содержание статьи

Порядок проведения

Как правило, на общем собрании большинством голосов принимаются решения:

  • о создании, реорганизации, ликвидации ООО;
  • утверждение устава и внесение в него изменений;
  • участие в других юридических лицах;
  • образование исполнительных органов и выборы органов управления;
  • утверждение годового отчета;
  • назначение ревизионной или аудиторской проверки.

Инициатива созыва собрания принадлежит исполнительному органу или группе участников, числом не менее определенного процента от их числа согласно учредительным документам. Процедура должна отвечать требованиям закона, регулирующего деятельность организации, и устава. Всем членам заблаговременно должно быть выслано уведомление, содержащее дату, время, место проведения и повестку дня.

В целях проверки правомочности собрания и наличия кворума рекомендуется проводить регистрацию прибывших с указанием документа, удостоверяющего личность, и проставлением подписи участника напротив своей фамилии.

Собрание в самом начале должно выбрать председательствующего, на которого возлагается его проведение, и секретаря для ведения протокола.

В протоколе должен быть отражен весь его ход, выступления участников, прения, обсуждения вопросов повестки, голосование и его результаты, принятые решения:

  • Во вводной части указывается дата начала и окончания сбора, количество лиц, принимающих в нем участие, процентное соотношение прибывших к общему количеству членов организации, наличие или отсутствие кворума, а также вопросы, включенные в повестку.
  • В основной части описывается последовательность рассмотрения вопросов, при этом можно составить краткий протокол с фиксацией пункта повестки и принятого решения или полный с записью речей докладчиков, реплик, мнений.

По окончании собрания составляется официальный протокол на основании записей, которые вел избранный секретарь. Срок его изготовления обычно – от 3 до 5 дней. Изготовленный документ подписывается председательствующим и секретарем и хранится вместе со всей документацией сбора: уведомлением, листом регистрации, черновыми записями о ходе обсуждений.

Ненадлежащее составленный протокол может быть основанием для признания принятого решения недействительным.

Собрания участников могут проводиться путем заочного голосования, без созыва всех членов организации. В таких случаях инициаторы уведомляют в обычном порядке о созыве и порядке принятия решений по вопросам повестки. Голосование проводится путем заполнения высланных организатором бюллетеней в течение определенного срока. По итогам подсчета голосов, отраженных в бюллетенях, составляется протокол. Такая форма голосования может быть применена и в обычных очных сборах в целях исключения факта отказа участником от выраженного мнения.

Для АО и ООО законодательством предусмотрено нотариальное удостоверение принятых решений. Но если в уставе установлено, что протокол должен быть подписан всеми участниками лично или с использованием электронной подписи, позволяющей достоверно установить волю голосовавшего, то можно не привлекать нотариуса.

Что собой представляет выписка?

Выписка из протокола – это точная его копия по конкретному вопросу или части. Правом требовать ее обладает любой член организации либо его уполномоченный представитель. Органы управления при получении запроса обязаны предоставить документ в разумный срок, как правило, не превышающий 7 дней.

Выписку не нужно путать с ксерокопией, поскольку это отдельный документ, и составляется он в том же порядке, что и сам протокол с указанием присутствовавших, повестки, обсуждения по конкретному вопросу и принятому решению.

Заверяет ее руководитель организации в лице директора, председателя правления или председателя совета партнерства и скрепляет печатью.

На документе ставится отметка «верно», подпись и должность заверяющего лица и дата составления. Он предоставляется в тех случаях, когда на повестке собрания было большое количество вопросов и протокол содержит большое количество информации, не относящейся к правам лица, требующего его выдачи.

Общее собрание акционеров

Деятельность акционерных обществ регулируется федеральным законом, который содержит требование по раскрытию информации, в том числе и о проведении общего собрания, путем опубликования в течение 2 дней с даты составления протокола в сети интернет.

В случае нарушения указанной нормы общество может быть привлечено к административной ответственности. Сам же документ должен быть составлен не позднее 3-х дней с даты закрытия собрания.

Публикация не лишает акционеров права требовать выписку, которую ему обязан предоставить единоличный орган управления в лице директора.

Собрание участников ООО

Законом об обществах с ограниченной ответственностью не установлен срок изготовления протокола, но он может быть предусмотрен в уставе. В документе, помимо информации, указанной выше, обязательно должны быть отражены результаты голосования с указанием количества голосовавших за принятие решения, против и воздержавшихся.

В течение 10 дней с даты оформления итогов собрания они должны быть направлены всем участникам, в противном случае органы управления могут быть привлечены к административной ответственности. Выписку также может требовать любой участник.

Подробнее о том, как провести данное собрание, смотрите на следующем видео:

Собрание некоммерческих организаций

Законодательство не содержит строгих требований к составлению протокола общего собрания различных товариществ и некоммерческих партнерств, в форме которых создаются СРО – профессиональные объединения.

Обязанность ведения документа предусмотрена законом и внутренними документами, уставом и положениями.

После проведения собрания протокол, в котором отражены все рассмотренные вопросы и принятые решения, подписывается председателем и секретарем и хранится у руководства. Выписка может быть предоставлена любому члену организации.

В случае сомнений в ее подлинности у третьих лиц, для представления которым участник ее затребовал, может быть истребована копия протокола, заверенная единоличным исполнительным органом.

Как составить выписку из протокола собрания образец

Протоколы очень важная часть в любом делопроизводстве. С их помощью оформляются все важные собрания или заседания на предприятии. Но, в некоторых случаях нужна выписка из документа, по одному какому то пункту.

Основные моменты, которые понадобятся при составлении

Если возникает потребность цитировать определенную часть протокола, а весь остальной его смысл просто не нужен, делается выписка. При этом совсем не нужно предоставлять полную версию протокола, достаточно чтоб документ был правильно оформлен. Так же выписка поможет донести до масс только некоторые сведения, а основную информацию оставить за кадром.

Не смотря на то, что не существует унифицированной формы оформления выписки, все же есть несколько пунктов и советов, к которым стоит прислушаться. Протокол составляется для документирования заседаний, собраний, конференций, докладов, и прочего. В зависимости от типа собрания протоколы разделяются на:

  • Полный протокол. В нем обязательно должна быть зафиксирована вся информация о ходе собрания, включая высказывания ее участников, замечания и реплики. Это более точная форма фиксации.
  • Краткие, которые составляются, если нужно зафиксировать только данные докладчиков, вопросы которые обсуждались, и окончательное решение, которое было принято. Чаще всего такой тип документа используется для фиксирования оперативок или других коротких рабочих собраний.

Чаще всего протоколы, как и выписки из них, составляются на фирменных бланках предприятия, или на альбомных листах со штампом компании. Обязательно в бумаге должна быть указана такая информация:

  1. Полное название компании или организации.
  2. Название документа, который составляется. В нашем случае это протокол или выписка из него.
  3. Порядковый номер протокола.
  4. Место, где проводилось заседание.
  5. Если необходимо ставится гриф утверждения, но это не является обязательным условием.
  6. Дата, когда проводилось собрание или оперативка.
  7. Текст документа, который разделяется на вводный и основной. В вводной части обязательно указываются данные обо всех участниках собрания, их данные и должности, которые они занимают.
  8. Подписи все участников мероприятия, которыми они подтверждают правильность и достоверность всего изложенного в документе.

В полном варианте протокол получается значительных размеров, основная часть может занимать даже несколько листов.

В выписке вы можете подать сведения, которые касаются только одного конкретного явления или действия, и не давать знать о всех вопросах, которые обсуждались во время заседания.

Правовые нормы

В терминологическом стандарте «Делопроизводство и архивное дело» нет определения термину «выписка из протокола». Этот вид документа относится к разделу архивных выписок из документов.

Но, понятие выписка из документа есть в современном словаре архивной терминологии. При этом нужно понимать, что правила и порядок оформления выписок соответствует оформительской последовательности копий документов. Но, такие данные можно назвать правильными только частично.

На самом деле выписка составляется в тех ситуациях, когда копировать весь протокол не имеет смысла, или если в документе есть конфиденциальная информация, которую нежелательно знать посторонним людям.

Документ не считается действующим, пока он не заверен документально. Обязательно должно быть:

  1. От руки написано «Верно»
  2. Полное название должности, которую занимает ответственное лицо, которое заверяет документ
  3. Личная подпись
  4. После подписи в скобках нужно ее расшифровать.
  5. Дата, когда бумага была заверена.

Если следовать всем правилам, документ будет заверен правильно, и приобретет юридическую силу.

Что представляет собой выписка, и зачем она нужна?

Выпиской из протокола называется копия части документа, которая несет основные сведения по отдельному пункту или вопросу. При составлении документа важно обозначить:

  • Вводную часть, в которой будут указаны вопросы, которые рассматривались на повестке дня.
  • Копия нужных абзацев документа, где указаны заслушанные вопросы и принятые по ним решения.
  • Реквизиты, которые являются копией тех, которые стоят на оригинале.
  • Заверительная подпись. Она обязательно должна содержать слово «верно», а далее подпись составителя с расшифровкой, его подпись, дата, когда документ был написан.

Чаще всего выписки используются для донесения нужной информации, которая была принята во время заседания, до заинтересованных субъектов.

Выписка из протокола

На деле именно с помощью таких выписок происходит контроль за процессами производства или выполнением административных решений, формируется документация организации.

По правилам, секретарь организации в течении двух дней после оформления и подписания договора, должен оформить все необходимые копии, и отправить их по почте или вручить лично ответственным лицам.

Как оформляется выписка из протокола?

Не смотря на то, что нет четко регулированного порядка составления выписки, лучше всего придерживаться такого проверенного алгоритма:

  1. Для начала нужно дать название документу. В данном случае это будет « Выписка из протокола собрания…». Обязательно правильно укажите название собрания, его дату и присутствующих на ней работников.
  2. Из основного документа следует скопировать вводную часть. При этом обязательно прописываются все реквизиты оригинала, в которые входит дата и место собрания, количество присутствующих работников.
  3. Процитируйте из протокола нужный отрывок, делать это нужно предельно внимательно, которая касается именно нужного вопроса. Так же обязательно указывается порядковый номер пункта, по которому делается выписка.
  4. Основной текст документа формируется с помощью копирования основного текста нужного пункта. Нужно скопировать только ту часть, которая касается именно того вопроса, который нужен для раскрытия темы.

Обязательно укажите такие части, как «Слушали», суть обсуждения вопроса, и пункт «Постановили».

Пример протокола общего собрания

  1. Укажите должностных лиц, которые подписались в конце протокола, тем самым заверили правильность его составления.
  2. Руководитель или секретарь должен заверить получившуюся бумагу. Для этого в конце он пишет слово «Верно», и ставит собственную подпись и дату.

Кто должен подписывать документ

В законодательстве нет такого закона, который бы заставил заверять бумагу только руководителям. Иногда их нужно оформить очень много, и вместо того чтоб решать текущие важные вопросы, директор должен заниматься бумажной работой. В некоторых случаях выписка может заверяться руководством, но в большинстве случаев это делают секретари предприятия. В конце бумаги секретарь ставит свою подпись, чем подтверждает, что документ составлен правильно, и написанное абсолютно верно. Это правило касается внутренних документов предприятия.

Что же касается документов, которые отправляются в другие организации, то они заверяются исключительно руководством. Секретарь может поставить и свою роспись, но подпись начальника должна быть обязательно. Иначе бумага не будет иметь никакой юридической силы.

В нашем материале вы подробно ознакомитесь с тем, как составить протокол общего собрания трудового коллектива.

Здесь мы подробно рассмотрим, как верно составить коллективный трудовой договор.

Что нужно делать для получения выписки из ЕГРИП? Об этом вы узнаете из нашего материала.

Кроме этого обязательно должна присутствовать печать компании. Она должна быть расположена таким образом, чтоб край захватывал подпись директора или ответственного лица, и название его должности.

В итоге можно сказать, что выписка из протокола общего собрания это документ, в котором содержится копия вводной части бумаги с необходимым вводным вопросом, которая не включает в себя повестку дня, и копия отдельного абзаца об итоговом постановлении.

В выписке могут быть ответы как на несколько вопросов сразу, так и на один из них отдельно, в зависимости от потребности.

Остались вопросы? Узнайте, как решить именно Вашу проблему — позвоните прямо сейчас:

+7 (499) 577-03-71
(Москва)

+7 (812) 425-60-36
(Санкт-Петербург)

8 (800) 350-23-69 доб 680
Для всех регионов!

Это быстро и бесплатно!

Главная суть документа в информировании ответственных лиц организации о решениях, которые были приняты на собраниях. Так же выписки из документов могут отсылаться в заинтересованные организации для того чтоб наладить сотрудничество.

Что такое протокол мероприятия

Протокол — это официальный документ, который ведется в письменном виде в ходе общего собрания людей, объединенных одним делом или проблемой. Общий сбор может быть у жильцов одного дома, акционеров или работников предприятия, а записывать результаты события сейчас требуют даже на родительских собраниях в школах. В резолюции отражают ход событий, перечень затрагиваемых вопросов и обсуждений, очередность выступлений и их основные тезисы, а также принятые решения.

Поскольку выписка из протокола общего собрания, образец которой представлен в статье, — это частичная копия стенограммы мероприятия, в которой содержатся краткие сведения и итог рассмотрения конкретного вопроса, в ней нужно указать полное наименование организации (юридического лица), дату проведения сбора, и сформулировать вопрос, который является основной темой фрагмента. При необходимости могут полностью копироваться абзацы текста, в которых приводятся принятые по вопросу решения. В юридических лицах такая форма документации используется для донесения новой информации. По сути она является основанием для изменений в производственных процессах организации и уточнения частностей. В этом случае делопроизводитель компании оформляет необходимое число копий и передает ответственным за исполнение лицам. Эти же копии впоследствии будут основным документом для контроля за исполнением принятых решений.

В отношении физических лиц фрагменты из документов, касающихся прав и законных интересов граждан, выдаются по их требованию, в порядке, установленном актуальным на сегодняшний день Указом Президиума ВС СССР от 04.08.1983 № 9779-X (ред. от 08.12.2003) «О порядке выдачи и свидетельствования предприятиями, учреждениями и организациями копий документов, касающихся прав граждан».

В каких случаях нужна

Чаще всего фрагменты резолюций требуются:

  • для предоставления в финансовые организации;
  • для ФНС или иных контролирующих органов;
  • для предоставления информации участникам общества в части, их касающейся;
  • при обращении заинтересованных лиц по вопросам, которые были рассмотрены.

Как написать выписку из протокола собрания

Составлением подобной документации занимается секретарь организации или сотрудник, ответственный за делопроизводство. Единого регламентированного порядка составления этого документа не разработано. Существуют лишь общепринятые правила оформления:

  • начинаться она должна со слов «Выписка из протокола общего собрания. »;
  • в вводной части текста указывают количество участников события и основные реквизиты протокола;
  • указывается не только суть вопроса, но и его номер (пункт), под которым он фигурирует в основном документе;
  • составитель — тот, кто подписывает выписку из протокола общего собрания, после текста пишет фразу «Выписка верна», расшифровывает свою подпись, должность и также указывает дату составления;
  • подпись составителя и верификация дополняются печатью организации.

В документах для внутреннего пользования заверить документ может секретарь, а вот копия для внешних организаций заверяется обязательно руководством.

Копии выписок имеют разный срок хранения. В зависимости от важности затронутых во время заседания вопросов, они могут храниться от 5 до 75 лет (пункты 415 и 656 перечня, утвержденного Приказом Минкультуры России от 25.08.2010 № 558).

Выписка из протокола заседания комиссии – документ, который может потребоваться в самых разных случаях.

Что такое протокол заседания комиссии

На предприятиях и в организациях работа всевозможных комиссий не такое уж и редкое явление. Обычно в состав комиссий включается несколько сотрудников компании, которые профессионально решают поставленные перед ними задачи. Комиссии бывают учредительные, аттестационные, приемочные, инвентаризационные, они собираются по поводу конференций, семинаров и т.д. При этом работа любой комиссии обязательно фиксируется в специальном протоколе. В него заносятся сведения о том, кто входит в комиссию, какие цели перед участниками были поставлены, каким образом они были достигнуты и решение комиссии.

Виды протоколов

Протоколы условно можно поделить на два типа. К первому относятся краткие протоколы – они обычно применяются для регистрации работы комиссий, созванных в оперативном порядке, в том числе и незапланированных заранее. В них вносится только та информация, которая касается обсуждаемых вопросов, мнения участников и общего решения. А вот в полных протоколах сведения более объемны. В них вписываются не только основные данные, но и вся процедура заседания, включая подробное обсуждение, реплики, мнения, ход голосования, итоги. На таких заседаниях с полным протоколом всегда есть председатель, который им руководит и секретарь, который во всех деталях фиксирует происходящее. Иногда полный протокол может достигать нескольких страниц.

Зачем делать выписку

Зачастую информация, содержащаяся в протоколах, отражает секретные моменты текущей деятельности фирмы и не предназначена для широкой аудитории. Выписка помогает решить эту проблему.

С ее помощью заинтересованные лица получают нужные им данные, а конфиденциальность протокола сохраняется. Также выписка целесообразна при чрезмерно большом объеме протокола. Как правило, речь в выписке идет только о каком-то конкретном принятом решении.

Если говорить о практике, которая имеет широчайшее распространение, то выписки из протоколов заседаний помогают руководству компаний осуществлять деятельность по организации работы своих предприятий, контролировать работу производств, регулировать выполнение распоряжений, приказов (иногда выписки даже являются своего рода их заменителем) и т.д.

При помощи выписок государственные надзорные ведомства, контрагенты, банковские кредитные учреждения своевременно информируются о деятельности фирмы.

Чем отличаются выписка и копия

Некоторые работники организаций ошибочно полагают, что копия и выписка – это одно и то же. Это не совсем так. Между ними есть принципиальное отличие: копия – это абсолютно идентичный оригиналу документ, который делается обычно при помощи копировальной техники. Выписка же – это только некоторая часть оригинала и достаточно часто формируется она от руки (когда из документа берутся только те куски текста, которые требуются в каком-то конкретном случае).

Кто делает выписку

Выписку обычно делает сотрудник предприятия, в чьем ведении находится работа с протоколами, в том числе по их сохранению (это может быть секретарь, юрист или сам руководитель организации).

При этом выписка обязательно должна быть заверена уполномоченным на этом работником компании. Также на выписке должна стоять печать (если компания применяет штампы для визирования бумаг).

Как получить выписку

Чтобы получить требуемую выписку от заинтересованного лица, должен поступить соответствующий запрос или заявление в письменном виде с обозначением причин, по которым ему нужен данный документ и указанием учреждения, для предоставления в которое он понадобился.

Образец выписки из протокола заседания комиссии

При необходимости сделать выписку, посмотрите ее пример – с его помощью вы без труда сделаете то, что вам нужно.

  1. В начале документа обязательно напишите наименование организации, также укажите состав комиссии, отметьте повестку дня.
  2. Далее выпишите те данные из хода заседания, которые касаются заинтересованного лица и обязательно – решение комиссии.
  3. После этого, в конце документа поставьте надпись «Верно» или «Выписка верна», подпишите и датируйте бланк.

образец по трудовому коллективу и ООО, реквизиты

Общее собрание участников проводится юридическими организациями, которые основаны на участии в них других людей. Именно эти собрания и становятся своеобразным высшим органом управления. Компетенция этого органа определяется уставами и положениями. Среди важных документов и выписки из протоколов.

О порядке проведения собраний

Общие собрания проводятся для того, чтобы принять решение по важным вопросам, которые касаются всех:

  • Назначение проверки, аудиторского или ревизионного характера.
  • Утверждение отчёта за целый год.
  • Выборы в органы управления, образование исполнительных органов.
  • Принятие участия в образовании других юридических лиц.
  • Утверждение Устава, либо изменение.
  • Ликвидация ООО, создание или реорганизация.

Обычно собрания организуются собственниками ООО. Или группой участников, которых не менее определённого процента от других участников, согласно учредительным документам. Устав и законодательство, регулирующее деятельность общества – главные документы, на которые надо опираться при проведении собраний.

Уведомление с информацией о дате и времени проведения заблаговременно отправляется каждому из участников.

Кто такие индоутки и как превратить их разведение в свой бизнес, вы узнаете по ссылке.

Правила создания протокола

Отдельно во время проведения собраний выбирают секретаря, который ведёт протокол.

В протоколе отражается ход ведения собрания. А так же – выступления участников вместе с прениями, обсуждениями вопросов на повестке, голосованием и результатами. Принятые решения так же описываются как можно точнее.

  1. О дате, когда собрание началось и закончилось, пишут в вводной части. Здесь пишут о количестве лиц, принявших участие. И процентное отношение тех, кто был на собрании к общему количеству участников. Обязательно указывается наличие или отсутствие кворума. И информация о вопросах, поставленных на повестку.
  2. Основная часть посвящена последовательности решения каждого вопроса. Запись по ним может быть краткой, либо иметь полную форму.

Официальный протокол в полной форме составляется только после того, как собрание было проведено. Его основа – записи, составленные секретарём. На изготовление документа уходит не больше 3-5 дней. Председательствующий и секретарь обязательно ставят свои подписи на документе.

Что такое форма Р26001 и зачем она вам может понадобиться? Всю информацию вы найдете тут.

Он хранится вместе с другими бумагами, которые касаются собрания. Принятое решение могут признать недействительным, если протокол составлен не по правилам действующего законодательства.

Можно организовать заочное голосование, не приглашая всех членов общества. Тогда уведомления направляются не только о проведении собрания, но и о решениях, которые были приняты.

Для проведения голосования участники организации должны заполнить опросные листки на протяжении некоторого срока.

Что включает в себя выписка из протокола?

Протокол составляется после подсчёта голосов в этих документах. Нотариальное удостоверение принятых решений предусмотрено только для форм собственности вроде ООО и АО.

Что такое выписки, зачем они нужны?

Выписка из протоколов представляет собой точную копию самого протокола. Только не полностью, а конкретной его части, отдельного вопроса. По первому требованию выписку выдают участникам за срок, обычно не превышающий семи дней.

Живете в деревне и хотите заняться разведением животных, чтобы это еще и приносило стабильный доход? Статья Разведение цесарок, как бизнес: что нужно знать? расскажет, как это сделать.

Выписка не равна ксерокопии, она является отдельным документом. Составляется она в том же порядке, что и сам протокол.

Составляем выписку из собрания трудового коллектива

В данном случае существует всего несколько правил заполнения выписки из собрания трудового коллектива.

  • Сначала дают название самому документу.
  • Потом вставляют вводную часть из самого протокола.
  • Далее идёт отдельный пункт, процитированный из общей повестки.
  • Основной текст выписки формируется копированием необходимого отрывка в основном документе.
  • Важны ссылки на лиц, подписавших договор. И их должности.
  • Последний этап – заверение документа.
Пример выписки.

При проведении общего собрания ООО

Здесь так же используются фрагменты, которые присутствовали в самом протоколе.

Основные принципы составления будут такими.

  1. Начинают с оформления заголовка.
  2. Копируются все реквизиты, перечисленные в протоколе.
  3. Далее пишут о количестве тех, кто принял участие в собрании.
  4. Переходят к копированию пункта протокола, интересующего посылавшего запрос.
  5. Далее идёт основная часть обсуждения по тому или иному вопросу.
  6. Следующий – пункт, касающийся принятого решения.
  7. Ссылка на лиц, заполнивших протокол.
  8. Заверение документа лицом с соответствующими полномочиями.

Становитесь ИП, значит вам надо зарегистрироваться, а как это сделать? Ответы вы найдете в этой статье.

При проведении собрания акционеров

Здесь правила остаются теми же. Выписка играет просто роль копии какой-либо части основного документа. Но не всего целиком, а отдельной его части. И сама выписка оформляется отдельно.

Образец выписки из протокола можно скачать тут.

Обязательно наличие вводной части, включая описание повестки дня. Только после этого идёт дословное содержание абзацев, интересующих заявителя в той или иной ситуации. Обязательным становится наличие информации о том, где и когда проводилось собрание.

Как быть некоммерческим организациям?

И здесь правила остаются почти одинаковыми. Начинается всё с вводной части, после которой идёт основная. В этой основной части перечисляют вопросы из повестки дня.

Обязательно надо указать о том, каким образом проводится голосование.

Где и как, с использованием каких материалов. Можно полностью скопировать то, что было написано в самом протоколе. Некоммерческая организация так же должна указать своё название, в полной форме.

Кто несёт ответственность за подписание документа?

Для выписок не требуется заверения со стороны лиц, подписавших основной документ. Достаточно наличия подписи секретаря, ответственного за ведение записей.

Как заполнить и получить больничный лист, вы узнаете здесь.

Реквизит «Отметка о заверении копии» позволит наделить бумагу юридической силой. Подпись ставится вручную. Надо написать о том, что вся информация указана в документе верно, без ошибок. Подпись руководителя вместе с печатью организации нужна лишь в том случае, если выписку предоставляют специалистам в сторонних компаниях.

Заключение и дополнительные советы

По своей сути, любые выписки являются внутренними документами. Они дадут возможность для сохранения конфиденциальности по остальным вопросам, которые рассматриваются в ходе собрания, но не интересуют конкретного заявителя.

Для документа не существует унифицированной формы, на каждом предприятии разрабатывают свою собственную. Главное – соблюдать общие требования, указанные в законодательстве.

Разъяснения и дополнения в выписках отсутствуют. Они должны быть посвящены только одному конкретному вопросу. Только в этом случае документ можно заверить и сделать так, чтобы он обладал юридической силой.

Наняли экономиста, а теперь столкнулись с необходимостью составления должностной инструкции? Как это правильно сделать и что должен в себя включать такой документ, вы узнаете по ссылке.

Для получения выписок на предприятиях рекомендуется обратиться к секретарю. Именно они отвечают за оформление, заверение документов. Иногда за оформление отвечают другие службы, если должность секретаря не оформлена соответствующим образом.

Главное, чтобы у них были полномочия по составлению и хранению отчётной документации. Например, это может быть отдел кадров.

Что такое выписка и зачем она нужна?

Сами протоколы хранятся в зависимости от того, как ведётся делопроизводство на том или ином предприятии. Один из самых удобных способов – централизованный, когда за хранение отвечает секретарь, либо отдел кадров.

Подробнее о протоколе собрания учредителей вы узнаете в этом видео: 


Дорогие читатели! Мы постоянно пишем актуальные и интересные материалы на наш новостной портал FBM.ru, подписывайтесь на наши новости в Яндекс-Новостях и Telegram

Протоколы заседаний — Студенческий совет — Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики»

2020

Протокол № 81 заседания от 17 января 2019

2019

Протокол № 80 заседания от 17 октября 2019

Протокол №79 заседания от 10 сентября 2019

Протокол №78 заседания от 24 мая 2019

Протокол №77 заседания от 14 мая 2019

Протокол №76 заседания от 9 апреля 2019

2017

 

Протокол № 60 заседания от 23 ноября 2017.docx 

2016

 Протокол №31 заседания от 30 декабря 2016 (PDF, 123 Кб)

 Выписка из протокола №29 заседания от 22 декабря 2016 (PDF, 109 Кб)

 Протокол №28 заседания от 11 декабря 2016 (PDF, 130 Кб)

 Протокол №27 заседания от 9 декабря 2016 (PDF, 130 Кб)

 Протокол №25 заседания от 11 ноября 2016 (PDF, 114 Кб) 

 Протокол №24 заседания от 29 октября 2016 (PDF, 118 Кб)

 Протокол №23 заседания от 17 октября 2016 (PDF, 102 Кб)

 Протокол №22 заседания от 13 сентября 2016 (PDF, 265 Кб)

 Протокол №21 заседания от 9 сентября 2016 (PDF, 191 Кб)

 Протокол №20 заседания от 4 сентября 2016 (PDF, 200 Кб)

 Протокол №19 заседания от 3 августа 2016 (PDF, 190 Кб)

 Протокол №18 заседания от 9 июля 2016 (PDF, 193 Кб)

 Протокол №17 заседания от 4 июля 2016 (PDF, 199 Кб)

 Протокол №16 заседания от 2 июля 2016 (PDF, 189 Кб)

 Протокол №15 заседания от 23 июня 2016 (PDF, 192 Кб)

 Протокол №14 заседания от 22 июня 2016 (PDF, 190 Кб)

 Протокол №13 заседания от 15 июня 2016 (PDF, 378 Кб)

 Приложение 1. Отчёт о работе за январь-июнь 2016 (PDF, 505 Кб)

 Приложение 2. План работы на июль-декабрь 2016 (PDF, 157 Кб)

 Протокол №12 заседания от 5 июня 2016 (PDF, 203 Кб)

 Протокол №11 заседания от 2 июня 2016 (PDF, 192 Кб)

 Протокол №10 заседания от 24 мая 2016 (PDF, 358 Кб)

 Приложение. Концепция информационной политики Студенческого совета ФСН (PDF, 188 Кб)

 Протокол №9 заседания от 13 апреля 2016 (PDF, 343 Кб)

 Протокол №8 заседания от 27 марта 2016 (PDF, 201 Кб)

 Приложение (PDF, 124 Кб)

 Протокол №7 заседания от 16 марта 2016 (PDF, 363 Кб)

 Приложение 1. Регламент работы студсовета ФСН (PDF, 305 Кб)

 Приложение 2. Заключение Правового комитета Студсовета НИУ ВШЭ (PDF, 104 Кб)

 Протокол №6 заседания от 17 февраля 2016 (PDF, 236 Кб)

 Протокол №5 совместного заседания с администрацией от 10 февраля 2016 (PDF, 359 Кб)

 Протокол №4 заседания от 29 января 2016 (PDF, 245 Кб)

2015

 Протокол №3 заседания от 26 декабря 2015 (PDF, 279 Кб)

 Протокол №2 заседания от 15 декабря 2015 (PDF, 141 Кб)

 Протокол №1 заседания от 9 декабря 2015 (PDF, 270 Кб)

 

 

Выписка из протокола о назначении директора образец

выписка из протокола о назначении директора образец



Приказ о назначении нового директора. ЕГРЮЛ, решение протокол о назначении нового директора и приказ о вступлении в. Решение о назначении генерального директора ООО - образец этого документа вы найдете в нашей статье. УВР, о формировании системы оценки качества. По _ вопросу повестки дня о назначении членом Правления. Директоров А.А. (доля в уставном капитале. Выписка из протокола о назначении директора образец толпившийся. Юридическая компания МСК-Регистратор оказывает все виды юридических услуг. Загрузите образец протокола собрания учредителей, который показывает, как оформляется смена генерального директора. Вы хотите скачать образец выписки из протокола совета директоров сейчас!. Получение "свежей" выписки из ЕГРЮЛ (перед. ОБРАЗЕЦ. ВЫПИСКА ИЗ ПРОТОКОЛА ЗАСЕДАНИЯ СОВЕТА ДИРЕКТОРОВ АКЦИОНЕРНОГО ОБЩЕСТВА О НАЗНАЧЕНИИ ЧЛЕНОВ ПРАВЛЕНИЯ (ТИПОВАЯ ФОРМА) НАЗНАЧЕНИЕ ЧЛЕНОВ. Выписка из протокола заседания совета директоров акционерного общества. Если вы искали “образец выписка из протокола ооо о назначении генерального директора”, кнопка для скачивания на странице ниже. Смена директора протокол, образец протокола о смене директора, протокол собрания о смене директора, протокол. В выписке из реестра в качестве руководителя учреждения и в протоколе (приказе) о назначении руководителем. У кого есть образец выписки из протокола о назначении ген директором?. Регистрация юридических лиц, открытие ООО, смена юридического адреса, смена учредителей.Образец протокол о назначении директора - Бланки, шаблоны. Милях в трех-четырех от горных вершин, как лесной. Решение (протокол) о назначении нового генерального директора ООО (не обязательно). Выписка из протокола заседания совета директоров акционерного общества о назначении. Честно, выписка из протокола о назначении директора образец проехал. Основное назначение выписки из приказа – сохранение конфиденциальной и служебной информации. ВЫПИСКА ИЗ ПРОТОКОЛА ЗАСЕДАНИЯ СОВЕТА ДИРЕКТОРОВ АКЦИОНЕРНОГО ОБЩЕСТВА О НАЗНАЧЕНИИ ЧЛЕНОВ ПРАВЛЕНИЯ (ТИПОВАЯ ФОРМА) НАЗНАЧЕНИЕ ЧЛЕНОВ ПРАВЛЕНИЯ. Поделитесь, плиз, образцом Протокола собрания учредителей о назначении директора. Re: выписка из протокола о назначении ген директором, у кого есть?. Данный протокол о назначении генерального директора не нужно удостоверять. Выписка из протокола, решение, распоряжение Руководитель назначается на должность учредителями,. Принимать участие целесообразно только в том случае, если на стенде будут представлены образцы новой продукции. Я хочу обратить внимание модератора на это сообщение, потому что:. Образец заполнения таможенного приходного ордера. Огромная просьба подскажите: в выписке из приказа должна ли стоять подпись директора, либо правильна такая формулировка, где. После получения свидетельства о регистрации изменений и новой выписки из Единого государственного. Образец выписки из приказа. Подскажите, как грамотно составить выписку из протокола, если из повестки дня нужно осветить только один вопрос и.Скиньте, пожалуйста, образец Протокола общего собрания учредителей о назначении генерального директора. Здесь вы можете скачать протокол назначения генерального директора, образец. Результат поиcка: "образец выписки из протокола собрания о назначении директора". Образец выписки из протокола. Пример протокола общего собрания участников общества об. Протокол о назначении директора и выписка из ЕГРЮЛ. Соответствие протокола представленному выше образцу поможет Вам не допустить досадных ошибок при. Образец выписка из приказа о назначении директора. Слушали Степанову Э.Л. Выписка из приказа о назначении директора образец | 7 (. Образец примерный учредительный договор о. Руководитель назначается на должность. Назначение Генерального директора. Поиск по сайту. Коммерческие и деловые предложения предприятий малого бизнеса - образец выписки из протокола собрания о назначении. Назначение Генерального директора Общества. Образец- Выписка из протокола заседания совета директоров акционерного общества о назначении членов правления (типовая форма):. Протокол, выписка из протокола, постановление (образцы документов). Руководитель назначается на должность учредителями, акционерами,.Выписка из протокола педагогического совета образец. Файл: Протокол о назначении директора ооо образцы. О всероссийском совещании преподавателей стенографии и машинописи и письме Центрального. Образец приказа о назначении директора. Желаем каждому подписчику на этот сайт с помощью нашей информации иметь всегда. Как заказать выписку из ЕГРЮЛ самостоятельно читайте в статье. Пример оформления выписки из протокола. Образец протокола о назначении директора ооо. Выписка из протокола заседания совета директоров акционерного общества о назначении членов правления типовая форма Образец. Выписка из протокола заседания совета директоров акционерного общества по вопросу назначения. Выписка из протокола общего собрания, выписка из протокола образец, выписка из протокола собрания. Выписка из протокола о назначении директора образец. ВЫПИСКА ИЗ ПРОТОКОЛА ЗАСЕДАНИЯ СОВЕТА ДИРЕКТОРОВ АКЦИОНЕРНОГО ОБЩЕСТВА О НАЗНАЧЕНИИ ЧЛЕНОВ ПРАВЛЕНИЯ (. Образец документа о назначении руководителя руководителя может быть протокол, выписка директоров, либо вышестоящей организацией. Протокол о назначении генерального директора. ВЫПИСКА ИЗ ПРОТОКОЛА ЗАСЕДАНИЯ СОВЕТА ДИРЕКТОРОВ АКЦИОНЕРНОГО ОБЩЕСТВА О НАЗНАЧЕНИИ ЧЛЕНОВ ПРАВЛЕНИЯ (ТИПОВАЯ. Образец. ВЫПИСКА ИЗ ПРОТОКОЛА ЗАСЕДАНИЯ СОВЕТА ДИРЕКТОРОВ АКЦИОНЕРНОГО ОБЩЕСТВА О НАЗНАЧЕНИИ ЧЛЕНОВ ПРАВЛЕНИЯ (ТИПОВАЯ ФОРМА) НАЗНАЧЕНИЕ ЧЛЕНОВ.

Выписка из протокола родительского собрания на тему "Адаптация учащихся 1 класса" ( с вопросом о Критериальном оценивании учащихся)

Выписка из протокола №2 родительского собрания в 1 классе

на тему «Проблема адаптации первоклассников»

Присутствовали: 10

Отсутствовали: -

Повестка дня

1. Доклад «Проблема адаптации первоклассников» (Классный руководитель Калиева К.И.)

2. Ознакомление родителей с методикой критериального оценивания в обновленном содержании образования. (Школьный координатор Белая С.В.)

3. Разное.

Школьный координатор Белая С.В. начала встречу с психологического настроя. Прошло разделение родителей на группы.

На втором этапе при определении темы занятий она провела тренинг «Нарисуйте медведя». После подсчета баллов по предложенным критериям, родители пришли к выводу, что эффективность выполнения работы зависит от знания критериев оценивания.

Педагог познакомила родителей с основными понятиями: «оценивание», «критериальное оценивание», «формативное оценивание», «суммативное оценивание», «дескрипторы», «рубрика», «рубрикаторы». Главной целью критериального оценивания является получение объективной информации о результатах обучения обучающихся на основе критериев оценивания и предоставление ее всем заинтересованным участникам для дальнейшего совершенствования учебного процесса.

При подаче материала она демонстрировала на ноутбуке и на бумаге образцы формативного оценивания и суммативного оценивания, чтобы родители наглядно видели, как строится работа учителя по оцениванию учащихся, а также показала документ в помощь: «Критериальное оценивание для родителей»

Особое внимание координатор уделила формативному оцениванию, которое проводится ежедневно в индивидуальной, парной и групповой работе как устно, так и письменно.

Родители должны знакомиться с результатами выполненных учащимися работ, отслеживая уровень знаний и понимания детьми учебных программ.

Выступили родители:

Гельманова О.А. – мама Калиевой Даны. Обновленные программы тяжело даются моему ребенку, она испытывает трудности в запоминании и понимании материала. Нас пугает то, что при суммативном оценивании итоги будет подсчитывать электронный журнал, а не учитель. Необходимо покупать компьютеры, планшеты, чтобы помогать детям в подготовке проектов, исследовательских работ.

Гельманова Н.И. – бабушка Калиевой Снежаны. Мы с внучкой дома занимаемся, что-то дается ей легко, что-то с трудом. Дети пришли не совсем готовыми к такой системе, но по истечению 1 четверти заметен прогресс, хотя надо еще с ними работать, потому что программа сложная.

В конце встречи с родителями были подведены итоги и сделаны выводы.

Школьный координатор довела до сведения родителей, что по вопросам критериального, формативного и суммативного оценивания необходимо будет обращаться к ней.

Постановили:

Родителям принять к сведению методику критериального оценивания в обновленном содержании образования.

Родителям сотрудничать с учителями-предметниками, классным руководителем и школьным координатором в течение всего учебного года.

Председатель родительского комитета: Белая Н.Я.

Секретарь: Гельманова О.А.

Классный руководитель: Калиева К.И.

Школьный координатор: Белая С.В.

Адрес публикации: https://www.prodlenka.org/metodicheskie-razrabotki/235840-vypiska-iz-protokola-roditelskogo-sobranija-n

Протоколы

для реализации системы бесклеточной экспрессии TX-TL на основе Escherichia coli для синтетической биологии

Мы представили пятидневный протокол для приготовления эндогенной системы бесклеточной экспрессии TX-TL на основе Escherichia coli . Пример временной шкалы для создания реагентов - неочищенного клеточного экстракта и буфера - можно найти на Рис. 1 . После создания они могут храниться при -80 ° C до одного года. После создания реагентов установка и выполнение эксперимента могут быть выполнены менее чем за 8 часов.

Кроме того, мы оптимизировали условия экспрессии системы бесклеточной экспрессии TX-TL. Другие добавки, поставляемые пользователем, такие как буферы или растворы ДНК, должны быть предварительно откалиброваны на токсичность. Например, разные методы обработки плазмид приводят к разной экспрессии из-за содержания соли. Мы также проверили влияние буфера для элюции Tris-Cl на эффективность реакции (, рис. 5, ).

Пример калибровки неочищенного экстракта клеток, относящийся к шагу 4.1–4,9, показано на Рис. 4a . В целом, наши эксперименты показывают, что неочищенный клеточный экстракт наиболее чувствителен к уровням Mg-глутамата, за которым следуют уровни K-глутамата. Чтобы продемонстрировать бесклеточную систему экспрессии, мы сконструировали и протестировали петлю отрицательной обратной связи на основе репрессии tet . 26 ( рисунок 6 ). В системе бесклеточной экспрессии та же схема, работающая с aTc и без нее, показывает 7-кратное изменение конечной точки экспрессии репортера deGFP после восьми часов экспрессии.Хотя для этого эксперимента не требуются глобальные индукторы или репрессоры, при необходимости они могут быть добавлены в разделе «Приготовление основной смеси».


Рис. 1. График времени для неочищенного клеточного экстракта, раствора аминокислоты и приготовления энергетического раствора. Пятидневный график для типичного выполнения протокола приведен выше, оптимизированный для ночных инкубаций и дневных рабочих этапов.


Рис. 2. Анализ стоимости и экспрессии конкурирующих неочищенных клеточных экстрактов.a) Структура затрат на рабочую силу и материалы для бесклеточной экспрессионной системы TX-TL. На основе стоимости реагентов по состоянию на декабрь 2012 г. и затрат на рабочую силу в размере 14 долларов США в час. b) Сравнение стоимости бесклеточной экспрессионной системы TX-TL и других коммерческих систем. Стоимость указана в расчете на мкл, хотя объемы реакции могут варьироваться в зависимости от набора. c) Сравнение выхода бесклеточной экспрессионной системы TX-TL с другими коммерческими системами. Выход экспрессии белка определяется стандартами производителя.Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.


Рис. 3. Нагрузка и обработка бисерной трубки. а) Демонстрация правильной вязкости раствора ячеек-бус. Раствор клеточных гранул будет иметь вязкость, зависящую от многих факторов, включая количество добавленного буфера S30A, количество добавленных гранул и время, проведенное на льду. b) Загрузка пробирки для взбивания шариков перед быстрым настольным центрифугированием. Центрифугирование удаляет пузырьки, скопившиеся во время загрузки. c) Всплытие пузырьков после настольного центрифугирования.Размер пузырей может быть разным; их можно вытащить или удалить с помощью наконечника пипетки. d) Полностью заполненная трубка для взбивания шариков перед укупоркой. В трубке для взбивания шариков образуется мениск, и колпачок имеет достаточно, чтобы покрыть и вызвать переполнение небольших количеств. д) Правильно загруженный фильтрующий аппарат. Их можно использовать повторно. f) Сравнение правильно обработанной и неправильно обработанной трубки для взбивания шариков. Пробирка слева - это пробирка с хорошим биением - она ​​имеет небольшой и хорошо очерченный верхний слой и очень прозрачный супернатант.Пробирка справа неоптимальна, исходя из более крупного мутного второго слоя и мутного супернатанта. Неоптимальные трубки не должны подвергаться дополнительной обработке.


Рисунок 4. Свойства препаратов сырого экстракта. а) Типичные калибровочные графики для неочищенного клеточного экстракта. Неочищенный экстракт калибруется для дополнительных уровней Mg-глутамата, K-глутамата и DTT в указанном порядке. Показана конечная флуоресценция через 8 часов, а также максимальная скорость продукции белка на основе 12-минутного скользящего среднего.На основании этих графиков приемлемый диапазон дополнительного количества Mg-глутамата составляет 4 мМ, K-глутамата составляет 60-80 мМ, а DTT составляет 0-3 мМ. Обратите внимание, что каждый неочищенный экстракт необходимо калибровать независимо по этим трем переменным. б) Варианты приготовления экстрактов. Показана конечная флуоресценция двух сырых экстрактов, приготовленных в разные даты; планки погрешностей - это 1 стандартное отклонение от трех независимых прогонов в разные дни. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.


Рисунок 5.Влияние раствора ДНК на эффективность экспрессии. а) Сравнение двух различных методов очистки плазмид. 1 нМ pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 получают с использованием только набора QiaPrep Spin Miniprep (метод очистки 1) или после обработки с помощью набора для очистки QiaQuick PCR (метод очистки 2). Показана конечная флуоресценция через 8 часов, а также максимальная скорость продукции белка на основе 12-минутного скользящего среднего. Планки погрешностей - это 1 стандартное отклонение от четырех независимых прогонов в разные дни. b) Эффект элюирующего буфера (Трис-Cl). Различные концентрации Трис-Cl сравнивают в реакции внеклеточной экспрессии на основе экспрессии 1 нМ pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Приведенные концентрации представляют собой конечные концентрации Трис-Cl в реакции; Используемый буфер для элюции представляет собой 10 мМ Tris-Cl. Планки погрешностей - это 1 стандартное отклонение от трех независимых прогонов в разные дни. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.


Рис. 6. Пример выполнения TX-TL контура отрицательной обратной связи.а) Пример настройки бесклеточной реакции исполнения. Проверяет состояние «включено» и «выключено» цепи отрицательной обратной связи с положительным и отрицательным контролями. б) Плазмидная карта петли отрицательной обратной связи. c) Репрезентативные результаты. Данные отражают эксперимент в а) и б) с отрицательным контролем, вычтенным из сигнала. Генетическая схема показана на вставке. Планки погрешностей - это 1 стандартное отклонение от трех независимых прогонов в разные дни. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.

Имя Концентрация Сумма Стерилизация Банкноты
Хлорамфеникол (см) 34 мг / мл в этаноле 1 мл Фильтр стерилизации (0.22 мкМ) Можно производить в больших объемах, хранить при -20 ° C для дальнейшего использования.
2xYT + P + Cm пластина с агаром 31 г / л 2xYT, 40 мМ двухосновного фосфата калия, 22 мМ одноосновного фосфата калия, 34 мкг / мл хлорамфеникола 1 тарелка Автоклав
2xYT + P носитель 31 г / л 2xYT, 40 мМ двухосновного фосфата калия, 22 мМ одноосновного фосфата калия 4 л Автоклав

Таблица 1.Реагенты для 1 дня протокола сырого экстракта клеток.

Имя Концентрация Сумма Стерилизация Банкноты
Трис база 2 Месяца 250 мл Стерилизовать на фильтре (0,22 мкМ) или в автоклаве Можно хранить при комнатной температуре.
DTT 1 Месяц 6 мл Фильтр стерилизации (0.22 мкМ) Можно производить в больших объемах и хранить при -20 ° C для дальнейшего использования.
Буфер S30A 14 мМ Mg-глутамат, 60 мМ K-глутамат, 50 мМ Трис, pH 7,7 2 л Автоклав Для достижения pH 7,7 титровать уксусной кислотой. Добавьте DTT до конечной концентрации 2 мМ непосредственно перед использованием. Хранить при 4 ° C.
Буфер S30B 14 мМ Mg-глутамат, 60 мМ K-глутамат, ~ 5 мМ Трис, pH 8.2 2 л Автоклав Для достижения pH 8,2 титровать 2М трис. Добавьте DTT до конечной концентрации 1 мМ непосредственно перед использованием. Хранить при 4 ° C.

Таблица 2. Реагенты для 2-го дня протокола сырого экстракта клеток.

Сокол
1 2 3 4
Пустой 50 мл Falcon (г)
50 мл Falcon с гранулами (г)
Масса гранул (50 мл Falcon с гранулами - пустые 50 мл Falcon) (г)
Объем буфера S30A для добавления (масса гранулы * 0.9) (мл)
Общая масса добавляемых шариков (масса гранул * 5,0) (г)

Таблица 3. Буфер S30A и калькулятор массы шариков для дня 3 протокола экстракции сырых клеток.

Имя Концентрация Сумма Стерилизация Банкноты
HEPES 2 M, pH 8 4 мл Нет Для достижения pH 8 титровать КОН.
Смесь нуклеотидов 156 мМ АТФ и GTP, 94 мМ CTP и UTP, pH 7,5 1,5 мл Нет Для достижения pH 7,5 титровать КОН.
тРНК 50 мг / мл 600 мкл Нет
CoA 65 мм 600 мкл Нет
NAD 175 мМ, pH 7.5-8 300 мкл Нет Для достижения pH 7,5-8 титровать Трис при 2 М.
лагерь 650 мМ, pH 8 200 мкл Нет Чтобы достичь pH 8, титровать Трис при 2 М.
фолиновая кислота 33,9 мм 300 мкл Нет Хотя требуется всего 300 мкл, рецепт в добавке рассчитан на 1 человека.15 мл.
Спермидин 1 Месяц 150 мкл Нет Хранить при 4 ° C, нагревать до 37 ° C до расплавления.
3-ПГА 1,4 M, pH 7,5 3,2 мл Нет Для достижения pH 7,5 титровать Трис при 2 М.

Таблица 4. Реагенты для подготовки к протоколу Energy Solution.

Дополнительные материалы 1.Рецепты предметов.

Хлорамфеникол, 34 мг / мл: Приготовьте 0,51 г хлорамфеникола и добавьте этанол до 15 мл. Стерилизовать фильтрованием (0,22 мкМ), аликвотировать в пробирки по 1 мл, хранить при -20 ° C для дальнейшего использования.

Планшет с агаром 2xYT + P + Cm: Приготовьте 1,24 г 2xYT, 1,6 мл раствора двухосновного фосфата калия @ 1 M, 0,88 мл раствора одноосновного фосфата калия @ 1 M, 0,6 г агара и воды до 40 мл. Автоклав. Дать остыть до 50 ° C и добавить 40 мкл Cm. Разлить по 25 мл в чашку Петри размером 100 x 15 мм и дать остыть в течение часа.

Среда 2xYT + P: Приготовьте 124 г 2xYT, 160 мл раствора двухосновного фосфата калия @ 1 M, 88 мл одноосновного раствора фосфата калия @ 1 M и воду до 4 л. Разложите аликвоты в 2 x 1,88 л и 0,24 л. Автоклав.

Трис-основа, 2 M: Приготовьте 60,57 г Трис-основы и воды до 250 мл. Стерилизовать, хранить при комнатной температуре для дальнейшего использования.

DTT, 1 M: Приготовьте 2,31 г DTT и воды до 15 мл. Стерилизовать фильтрованием (0,22 мкМ), аликвотировать в пробирки по 1 мл, хранить при -20 ° C для дальнейшего использования.

Буфер S30A: Приготовьте 10,88 г Mg-глутамата и 24,39 г K-глутамата, 50 мл 2M триса, уксусную кислоту (до pH 7,7) и воду до 2 л. Автоклав, храните при 4 ° C, добавьте 4 мл. 1 M DTT перед использованием.

Буфер S30B: Приготовьте 10,88 г Mg-глутамата и 24,39 г K-глутамата, трис при 2 M (до pH 8,2) и воду до 2 л. Автоклав, храните при 4 ° C, добавьте 2 мл 1 M DTT перед использовать.

HEPES: Приготовьте 1,91 г HEPES (MW 238,21), КОН (до pH 8) и воду до 4 мл.

тРНК: Подготовьте 30 мг тРНК и воду до 600 мкл.

КоА: Приготовьте 30 мг КоА (молекулярная масса 767,53) и воду до 600 мкл.

NAD: Добавьте 34,83 ​​мг NAD (молекулярная масса 663,43), 2 M трис (до pH 7,5-8) и воду до 300 мкл. (Добавьте 27 мкл триса в концентрации 2 M, чтобы довести pH раствора до 7,5-8).

цАМФ: Добавить 42,80 мг цАМФ (MW 329,22), трис 2 М (до рН 8) и воду до 200 мкл. (Добавьте 73 мкл триса в концентрации 2 M, чтобы довести раствор до pH 8).

Фолиновая кислота (33,9 мМ): К 20 мг твердой кальциевой соли фолиновой кислоты (MW 511,5) добавьте 1,15 мл воды.

Спермидин: Приготовьте 23,55 мкл спермидина (молекулярная масса 145,25) и воду до 150 мкл. Приготовьте при комнатной температуре после кратковременного плавления при 37 ° C.
3-PGA: Добавьте 1,03 г 3-PGA (MW 230,02), 2 M трис (до pH 7,5) и воду до 3,2 мл. (Добавьте 1,73 мл 2 M триса, чтобы довести pH раствора до 7,5).

Смесь нуклеотидов: Добавить 145 мг дигидрата дикалиевой соли АТФ (MW 619.4), 133 мг динатриевой соли GTP (MW 567,14), 79,4 мг дигидрата динатриевой соли CTP (MW 563,16), 82,6 мг дигидрата тринатриевой соли UTP (MW 586,12), КОН при 15% разбавлении (до pH 7,5) и вода до 1,5 мл. (Добавьте 353 мкл КОН при 15% разбавлении, чтобы довести раствор до pH 7,5).

Дополнительные материалы 2. Анализ Брэдфорда.

  1. Удалите средство Брэдфорда с 4 ° C и поставьте при комнатной температуре.
  2. Приготовьте 50 мкл стандарта BSA с концентрацией 1 мг / мл и 0,1 мг / мл.
  3. Приготовьте 40 мкл 20-кратного разведения экстракта из шага 1.47.
  4. Добавьте 800 мкл воды в 7 кювет.
  5. Приготовьте стандартные кюветы для 0 мг / мл, 1 мг / мл (10 мкл 0,1 мг / мл BSA), 2 мг / мл (20 мкл 0,1 мг / мл BSA), 4 мг / мл (4 мкл 1 мг / мл BSA ), 6 мг / мл (6 мкл 1 мг / мл BSA).
  6. Приготовьте экспериментальные кюветы для 2 мкл образца и 4 мкл образца.
  7. Добавьте 200 мкл агента Брэдфорда в каждую кювету и хорошо перемешайте пипетированием. Инкубируйте при комнатной температуре не менее 10 мин.
  8. Получите стандартную кривую при OD 595 нм, используя кюветы из шага 6.5. Отклонить стандартную кривую, если r 2 <0,95.
  9. Определите концентрацию экстракта при OD 595 нм, используя кюветы из шага 6.6.

Дополнительный материал 3. Таблица калибровки буфера.

См. TXTL_e (шаблон) _calibration_JoVE.xlsx.

Дополнительные материалы 4. Таблица бесклеточного прогона выражений.

См. TXTL _JoVE.xlsx.

Протоколы для реализации системы бесклеточной экспрессии TX-TL на основе Escherichia coli для синтетической биологии

J Vis Exp.2013; (79): 50762.

, # 1 , 2 , 3 , 4 , 2 и 4

Zachary Z. Sun

1 Департамент биологии Калифорнийского технологического института

Клармира А. Хейс

2 Департамент биоинженерии Калифорнийского технологического института

Jonghyeon Shin

3 Центр синтетической биологии , Департамент биоинженерии, Массачусетский технологический институт

Филиппо Кашера

4 Школа физики и астрономии Миннесотского университета

Ричард М.Мюррей

2 Департамент биоинженерии Калифорнийского технологического института

Винсент Нуаро

4 Школа физики и астрономии Миннесотского университета

1 Биологический факультет Калифорнийского технологического института

2 Департамент биоинженерии, Калифорнийский технологический институт

3 Центр синтетической биологии, Департамент биоинженерии, Массачусетский технологический институт

4 Школа физики и астрономии, Университет Миннесоты

# Участвовал в равной степени.

Copyright © 2013, Журнал визуализированных экспериментов Эта статья цитируется в других статьях PMC.

Abstract

Идеальные бесклеточные экспрессирующие системы теоретически могут имитировать клеточную среду in vivo на контролируемой платформе in vitro . 1 Это полезно для контролируемой экспрессии белков и генетических цепей, а также для создания прототипов среды для синтетической биологии. 2,3 Для достижения последней цели бесклеточные системы экспрессии, которые сохраняют эндогенные механизмы транскрипции-трансляции Escherichia coli, способны более точно отражать in vivo клеточную динамику, чем системы, основанные на транскрипции РНК-полимеразы Т7.Мы описываем подготовку и выполнение эффективной эндогенной системы бесклеточной экспрессии на основе транскрипции-трансляции (TX-TL) E. coli , которая может производить эквивалентные количества белка, как системы на основе T7, при 98% снижении затрат по сравнению с аналогичными коммерческими системами. системы. 4,5 Описано приготовление буферов и неочищенного клеточного экстракта, а также проведение реакции TX-TL в трех пробирках. Подготовка всего протокола занимает пять дней и дает достаточно материала для до 3000 отдельных реакций в одном препарате.После подготовки каждая реакция занимает менее 8 часов от настройки до сбора и анализа данных. Могут быть дополнены механизмы регуляции и транскрипции, экзогенные для E. coli , такие как репрессоры lac / tet и РНК-полимераза T7. 6 Эндогенные свойства, такие как скорость деградации мРНК и ДНК, также можно регулировать. 7 Система бесклеточной экспрессии TX-TL была продемонстрирована для крупномасштабной сборки цепей, изучения биологических явлений и экспрессии белков как под Т7-, так и под эндогенными промоторами. 6,8 Имеются сопутствующие математические модели. 9,10 Полученная система имеет уникальные применения в синтетической биологии в качестве среды для создания прототипов или «биомолекулярного макета TX-TL».

Ключевые слова: Клеточная биология, выпуск 79, биоинженерия, синтетическая биология, химические методы, синтетический, молекулярная биология, теория контроля, TX-TL, бесклеточная экспрессия, in vitro, транскрипция-трансляция, бесклеточный синтез белка, синтетическая биология, системная биология, экстракт клеток Escherichia coli, биологические схемы, биомолекулярный макет

Введение

Технология бесклеточной экспрессии началась в 1950-х годах как чисто трансляционная, а годы спустя она развивалась и охватывала связанные механизмы транскрипции-трансляции с использованием ДНК бактериофага Т7. 11,12 С тех пор были предприняты многочисленные усилия по оптимизации создания неочищенного клеточного экстракта (или экстракта E. coli S30). 13,14 Эти оптимизации включают продление внеклеточного синтеза белка за счет регенерации АТФ или модификаций штаммов, а также сокращение времени и стоимости протокола. 15-17 Существуют альтернативные бесклеточные системы экспрессии, в которых для экспрессии используются восстановленные компоненты вместо сырого клеточного экстракта. 5 Как неочищенный клеточный экстракт, так и методы восстановления были разработаны для коммерческого использования.

С появлением синтетической биологии возросла потребность в хорошо охарактеризованной платформе для тестирования и выражения сконструированных биологических модулей и схем. 18,19 Эта платформа должна быть универсальной, хорошо охарактеризованной, простой в использовании и ориентированной на компоненты, предоставляемые пользователем. Несмотря на то, что они были разработаны полвека назад, бесклеточные системы на основе E. coli по сути разделяют эти требования, поскольку они представляют собой упрощенное представление in vitro клеточных процессов без сложности роста и метаболизма.Кроме того, все фундаментальные знания из in vivo работают с E. coli , легко применимы к бесклеточным системам E. coli .

Хотя бесклеточные системы экспрессии могут найти применение в синтетической биологии, на сегодняшний день целью большинства бесклеточных систем экспрессии является максимальное увеличение выхода белков и метаболитов. Это достигается с помощью транскрипции последовательностей бактериофагом Т7, управляемых промоторами Т7. 20 Хотя экспрессия эффективна и надежна, эти системы служат узкоспециализированной цели.Методы регуляции клеток ограничены, матрица ДНК-мишени должна быть переработана, чтобы включить промоторы Т7, а определенные последовательности, такие как рибосомные комплексы, не могут быть транскрибированы и собраны. 21,22 Существующие бесклеточные системы экспрессии неспособны поддерживать высокие урожаи при сохранении эндогенных регуляторных механизмов, универсальность, необходимая для синтетической биологии.

Мы разработали эндогенную бесклеточную систему экспрессии E. coli , которая сохраняет эффективность экспрессии белка, продемонстрированную предыдущими системами, но добавляет дополнительную гибкость, позволяя экспрессию и регуляцию на основе как эндогенных, так и экзогенных (Т7 или других) механизмов.Описанный здесь протокол изначально основан на Kigawa et al. (2004) и Liu et al. (2005 г.), но имеет значительные модификации. Он использует Mg- и K-глутамат вместо Mg- и K-ацетата для повышения эффективности, удаляет 2-меркаптоэтанол и лизирует клетки с помощью миксера. 17,23,24 Измельчение бисером предпочтительнее гомогенизации, методов, основанных на давлении, или обработки ультразвуком из-за его более низкой стоимости и сопоставимой производительности с конкурирующими системами. 23 3-фосфоглицериновая кислота (3-PGA) используется в качестве источника энергии, поскольку было обнаружено, что она дает более высокий выход белка по сравнению с креатинфосфатом и фосфоенолпируватом. 4,25 Наша система может производить до 0,75 мг / мл репортерного белка с использованием промотора на основе сигма70 с лямбда-фаговыми операторами или промотора, управляемого Т7, аналогично выходам из других коммерческих систем. 4,6 Для производства всех необходимых реагентов требуется пять дней ( Рисунок 1 ). Кроме того, он обеспечивает снижение затрат на 98% по сравнению с сопоставимыми коммерческими бесклеточными системами - затраты на материалы составляют 0,11 доллара США на 10 мкл реакции, что с учетом трудозатрат возрастает до 0,26 доллара США (, рисунок 2, ).

Протокол

1. Приготовление неочищенного клеточного экстракта

Приготовление неочищенного клеточного экстракта в течение трех дней требует двух человек для эффективного проведения. Функционально протокол состоит из трех частей: рост культуры (шаг 1.1 - шаг 1.11), лизис клеток (шаг 1.12 - шаг 1.37) и извлечение осветления (шаг 1.38 - шаг 1.52). Для удобства он разделен на дни. Идеальный экстракт может продуцировать 0,75 мг / мл deGFP из плазмиды pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene # 40019) и имеет концентрацию неочищенного клеточного экстракта между 27-30 мг / мл белка. 4 Однако характеристики экстракта варьируются от партии к партии. В следующем рецепте достаточно примерно для 3000 одиночных реакций (6 мл неочищенного клеточного экстракта). При уменьшении рекомендуется использовать не менее 1/6 приведенных здесь значений. Из-за нехватки времени масштабирование не рекомендуется.

День 1

  1. Приготовьте бактериальную культуральную среду, культуральный планшет и добавки к средам, как описано в таблице . См. Рецепты в Supplemental Material 1 .

  2. Штамм Streak BL21-Rosetta2 при температуре от -80 ° C на чашку с агаром 2xYT + P + Cm и инкубируйте не менее 15 часов при 37 ° C или до тех пор, пока колонии не станут легко заметными. Примечание. Хлорамфеникол (Cm) используется для отбора плазмиды, кодирующей редкие тРНК в штамме BL21-Rosetta2.

День 2

  1. Приготовьте буферы и добавки, как описано в таблице 2 . См. Рецепты в Supplemental Material 1 .

  2. Подготовьте и стерилизуйте материалы, необходимые для 3-го дня, включая: 6 колб Эрленмейера по 4 л с крышкой из алюминиевой фольги (автоклавированные), стерильные центрифужные флаконы 4 х 1 л, воронку (автоклавированную), 100 г 0.Стеклянные шарики 1 мм (в автоклаве), 2 стержня для перемешивания (в автоклаве), градуированный цилиндр на 1 и 500 мл (в автоклаве), 2 стакана по 1 л (в автоклаве), шприц на 3 мл с иглами 18 G (стерильные), 2-3 поплавковые буи, 2-3 диализных кассеты 10к MWCO (стерильные), кюветы.

  3. Подготовка мини-культуры 1. Добавьте 4 мл среды 2xYT + P и 4 мкл Cm в стерильную пробирку для культивирования на 12 мл и предварительно нагрейте до 37 ° C в течение 30 мин.

  4. Засейте мини-культуру 1 колонией из чашки с агаром 2xYT + P + Cm. Инкубируйте при 220 об / мин, 37 ° C в течение 8 часов.

  5. Через 7 часов 30 минут приготовьте мини-культуру 2. Добавьте 50 мл среды 2xYT + P и 50 мкл Cm в стерильную колбу Эрленмейера на 250 мл и предварительно нагрейте до 37 ° C в течение 30 минут.

  6. Засейте мини-культуру 2 100 мкл мини-культуры 1 и инкубируйте при 220 об / мин, 37 ° C в течение 8 часов.

День 3

  1. Взвесьте четыре пустых стерильных 50 мл пробирки Falcon и запишите массу в Таблицу 3 . Охладите трубки Falcon на льду; они будут впоследствии использованы на шаге 1.18.

  2. Через 7 часов 30 минут после шага 1.8 приготовьте окончательную бактериальную культуральную среду. Используя стерильный градуированный цилиндр на 1 л, перенесите 660 мл среды 2xYT + P в каждую из шести колб Эрленмейера на 4 л и предварительно нагрейте до 37 ° C в течение 30 мин. Примечание. Для надлежащей аэрации рекомендуются колбы Эрленмейера объемом 4 л или больше.

  3. Добавьте 6,6 мл мини-культуры 2 в каждую колбу Эрленмейера на 4 л. Инкубируйте при 220 об / мин, 37 ° C, пока культура не достигнет ОП 1,5–2,0 при 600 нм (соответствует фазе роста в середине логарифма).Периодически проверяйте OD с помощью разведения культуры 1:10 на точность. Этот шаг должен занимать не более 3 часов - 3 часов 45 минут; Быстрый рост и сбор в середине фазы регистрации критически важны для качества экстракта.

  4. Сразу после выращивания равномерно перенесите все культуры в четыре центрифужные флаконы объемом 1 л и центрифугируйте при 5000 x g в течение 12 минут при 4 ° C для осаждения бактериальных клеток.

  5. Во время центрифугирования завершите приготовление буфера S30A, добавив 4 мл 1 М DTT к 2 л ранее приготовленного S30A.Перемешайте и сохраните буфер на льду.

  6. По окончании центрифугирования полностью удалите надосадочную жидкость с шага 1.12 путем декантации и промокания центрифужных бутылок на стерильной бумажной салфетке.

  7. Добавьте 200 мл буфера S30A при 4 ° C в каждую из четырех центрифужных бутылей и энергично встряхните бутылки до тех пор, пока осадок полностью не солюбилизируется без оставшихся комков . Центрифугируйте четыре флакона при 5000 g в течение 12 минут при 4 ° C.

  8. Полностью удалите супернатант с предыдущего шага путем декантации и промокания центрифужных бутылок на стерильном бумажном полотенце.

  9. Повторите шаги 1.15 и 1.16.

  10. Добавьте 40 мл буфера S30A при 4 ° C в каждую центрифужную бутыль. Перенести каждую гранулу и комбинацию S30A в охлажденную пробирку Falcon из версии 1.9). Примечание. На этом этапе гранулы перемещаются в контейнер меньшего размера.

  11. Центрифугируйте пробирки Falcon при 2000 g в течение 8 минут при 4 ° C. Удалите супернатант путем декантации.

  12. Повторно центрифугируйте пробирки Falcon при 2000 g в течение 2 минут при 4 ° C.Полностью удалите пипеткой остаточный супернатант. Держите на льду.

  13. Взвесьте четыре пробирки Falcon с гранулами и запишите массу в Table 3 . Рассчитайте массу гранул, необходимый объем буфера S30A и массу необходимых гранул на основе конкретных формул в , Таблица 3 .

  14. Правильная загрузка и измельчение гранул имеет решающее значение для получения качественного экстракта и является наиболее сложным этапом. Перед попыткой рекомендуется просмотреть видео.Неспособность избежать пузырьков воздуха и равномерно распределить шарики приведет к неэффективной вытяжке.

  15. Добавьте количество буфера S30A, рассчитанное в Таблице 3 , в каждую пробирку Falcon, перемешайте на вортексе до гомогенного состояния и верните в лед.

  16. Держа другие пробирки Falcon на льду, периодически добавляйте шарики в одну пробирку Falcon тремя аликвотами, каждая из которых использует 1/3 всех шариков. После добавления каждой аликвоты шариков встряхивают в течение 30 секунд.Поместите трубку Falcon на лед между ступенями вихря и после последнего вихря. После добавления последней аликвоты убедитесь, что гранулы распределены равномерно. Должна образоваться густая паста.

  17. Подготовьте наконечник пипетки объемом 5 мл, отрезав конец стерильной бритвой до отверстия 3-4 мм. Набрать пипеткой на 2 мл. Примечание: разные наборы пипеток и наконечники обеспечивают разную мощность всасывания, которой может быть недостаточно для вытягивания и высвобождения густого раствора клеток-шариков; вместо него можно использовать наконечник пипетки объемом 1 мл со снятым концом.

  18. Поместите 20 трубок для взбивания шариков на лед.

  19. Проверьте высокую вязкость раствора клеточных гранул с помощью модифицированной пипетки. Он должен быть вязким, чтобы не выходить из наконечника пипетки во время выброса. Если слишком вязкий, отрегулируйте наконечник дозатора согласно шагу 1.25. Если гранулы недостаточно вязкие, можно добавлять шарики с шагом ( массы гранул * 0,05 ) до максимальной массы ( масс гранул * 5,1 ). После каждого добавления шариков встряхивайте в течение 30 секунд и возвращайтесь в лед.См. Рисунок 3a для демонстрации вязкости.

  20. Удалите раствор клеток-гранул из пробирки Falcon с помощью модифицированной пипетки и перенесите в стерильную пробирку для взбивания шариков, наполнив ее на три четверти раствором клеток-гранул. Очень быстро прокрутите (1 с) на встречной мини-центрифуге, чтобы удалить пузырьки воздуха без перераспределения шариков. См. Рисунки 3b-d для получения неподвижных изображений загрузки трубки для отбивания шариков.

  21. Завершите добавление раствора бусинок для образования вогнутого мениска.

  22. Добавьте очень маленькую каплю раствора ячеек для шариков на внутреннюю часть колпачка пробирки для взбивания шариков, соблюдая осторожность, чтобы не мешать внешнему выступу колпачка; в противном случае трубка для отбивания бус не закроется в достаточной мере на л. Постучите колпачком по плоской поверхности и убедитесь, что на дне колпачка нет пузырьков воздуха.

  23. Закройте трубку для взбивания бус колпачком из предыдущего шага. Рука помощнику для взбивания бус. Если все сделано правильно, крышка должна быть плотно закрыта, пузырьков воздуха не должно быть видно, а небольшое количество (если таковое имеется) раствора для гранулированных ячеек должно переливаться через .Повторите процесс загрузки, если видны пузырьки воздуха или крышка не закрывается полностью.

  24. Пробирка Vortex Falcon из шага 1.24 с оставшимся раствором бусинок для обеспечения равномерного распределения бусинок. Повторяйте шаги 1,28–1,31, пока пробирка Falcon не станет пустой; затем повторите шаги 1,24–1,31 для каждой дополнительной трубки Falcon.

  25. Выполнить шаги 1,33–1,38 одновременно . Попросите помощника взять заполненные трубочки для взбивания шариков из емкости 1,31 и поместить на лед. После того, как две заполненные пробирки для взбивания бус были собраны и пролежали на льду не менее одной минуты, начинайте взбивание бусин.

  26. Взбивайте одну трубку в течение 30 секунд при 46 об / мин. Положите на лед вверх дном на 30 секунд, взбивая другую трубку.

  27. Повторите предыдущий шаг так, чтобы каждая заполненная трубка для взбивания шариков взбивалась в течение 1 мин.

  28. Повторяйте шаги с 1.33 по 1.35 до тех пор, пока не будут обработаны 8 заполненных пробирок для взбивания шариков (или максимальное количество, которое может вместить центрифуга). Затем сконструируйте фильтрующий аппарат из 15 мл Falcon ( Рисунок 3e ). Добавьте новый колпачок для взбивания бус, плоской стороной вверх, на дно 15 мл Falcon.Затем снимите колпачок с обработанной пробирки для взбивания шариков и плотно прижмите колонку для микрохроматографии к концу обработанной пробирки для взбивания шариков до полного закрытия . Отломите конец элюции от колонки для микрохроматографии и поместите колонку для микрохроматографии концом вниз в пустую пробирку с шариками. Поместите этот комплекс в сок 15 мл. Повторите эти действия для всех 8 заполненных трубок для взбивания шариков; по завершении оставьте на льду.

  29. Центрифуга с 8 фильтрующими устройствами, пробирка Falcon без крышки, при 6000 g в течение 5 мин при 4 ° C для отделения экстракта и осадка от шариков.

  30. Убедитесь, что каждая трубка для взбивания шариков произвела жизнеспособный экстракт . Правильно взбитый экстракт не будет мутным, а гранула будет состоять из двух отдельных слоев. Выбросьте все мутные пробирки и перенесите супернатант из немутных пробирок в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,75 мл, при этом забирает как можно меньше осадка . Держите на льду, пока не будут обработаны все трубки для взбивания шариков. См. Рисунок 3f , сравнивающий правильно обработанную и неправильно обработанную трубку для взбивания шариков.

  31. Центрифужные микроцентрифужные пробирки из предыдущего шага при 12000 g в течение 10 минут при 4 ° C.

  32. Перенесите супернатант без гранул в пустые пробирки для взбивания шариков с помощью пипетки, объединив 500 мкл в новую пробирку для взбивания шариков.

  33. Инкубируйте предыдущий шаг, со снятыми колпачками для взбивания шариков , при 220 об / мин, 37 ° C в течение 80 мин. На этом этапе расщепляются оставшиеся нуклеиновые кислоты с использованием эндогенных экзонуклеаз, высвобождаемых во время процесса нарезания шариков, и его можно выполнить, поставив трубку для взбивания шариков вверх в пробирке для культуры ткани.

  34. Подготовьте материалы для диализа. Завершите подготовку буфера S30B, добавив 2 мл 1 M DTT к 2 л ранее приготовленного S30B. Перемешайте и добавьте по 900 мл в каждый из двух стерильных стаканов на 1 л. Добавьте стерильную магнитную мешалку в каждый стакан; хранить при 4 ° C.

  35. После шага 1.41 экстракт должен выглядеть мутным . Объедините экстракт в аликвоты по 1,5 мл в микроцентрифужные пробирки объемом 1,75 мл и центрифугируйте при 12000 g в течение 10 мин при 4 ° C.

  36. С помощью пипетки объедините супернатант без гранул в 15 мл пробирки Falcon на льду и хорошо перемешайте, закрыв пробирку и перевернув. Сохраните 10 мкл надосадочной жидкости на льду для этапа 1.47 .

  37. Определите общее количество полученного экстракта и гидратируйте необходимое количество диализных кассет 10k MWCO путем погружения в S30B на 2 мин, принимая 2,5 мл экстракта на кассету.

  38. Загрузите кассеты с 2,5 мл экстракта. Каждый стакан вмещает до 2 кассет; диализуют при перемешивании при 4 ° C в течение 3 часов. Примечание: частичная загрузка кассет допустима. Диализ увеличивает выход протеина.

  39. На предыдущем этапе охарактеризуйте концентрацию белка экстракта с помощью анализа Брэдфорда, используя экстракт, сохраненный на этапе 1.44. Подробнее см. Supplemental Material 2 .

  40. После завершения диализа аликвоты экстрагируют по 1,5 мл в микроцентрифужные пробирки на 1,75 мл. Центрифуга при 12000 g в течение 10 мин при 4 ° C. На дне пробирки образуется шарик.

  41. Собрать прозрачный супернатант с предыдущего шага путем пипетирования в пробирку Falcon на 15 мл на льду.Гомогенизируйте, переворачивая 5-10x.

  42. На основании концентрации, определенной Брэдфордом на этапе 1.47, определите количество экстракта для аликвотирования в отдельные пробирки на 1,75 мл. Каждая отдельная пробирка должна иметь объем, содержащий 810–900 мг общего белка. Экстракт должен иметь концентрацию общего белка более 27 мг / мл. Этот шаг требует помощи для целесообразного проведения . Примечание: аликвоты экстракта ниже 30 мг / мл на аликвоты по 30 мкл и масштабирование, если концентрация выше; например, аликвоты экстракта с концентрацией 28 мг / мл на 30 мкл и аликвоты экстракта с концентрацией 32 мг / мл на 28 мкл.1 мкл.

  43. Аликвотируйте экстракт после шага 1.50, стараясь не допускать появления пузырьков. Экстракт мгновенного замораживания в жидком азоте. Примечание. Аликвоты с пузырьками можно удалить центрифугированием при 10 000 x g в течение 30 секунд при 4 ° C.

  44. Удалите пробирки из жидкого азота с помощью сетчатого фильтра и немедленно храните при -80 ° C. Безопасность: Носите защитные очки; колпачки экстракционных трубок могут оторваться из-за разницы температур между жидким азотом и комнатной температурой .

2. Приготовление аминокислотного раствора

Аминокислотный раствор следует готовить без упаковки. В следующем рецепте используется один полный набор RTS Amino Acid Sampler, которого достаточно для приблизительно 11000 отдельных реакций. При уменьшении рекомендуется использовать не менее половины комплекта. Каждая аминокислота в исходном растворе поставляется в количестве 1,5 мл, 168 мМ, за исключением лейцина в концентрации 140 мМ. Окончательный состав раствора аминокислот: лейцин 5 мМ, все остальные аминокислоты 6 мМ.Это 4-кратная рабочая концентрация.

  1. Удалите все 20 аминокислот из -20 ° C и разморозьте при комнатной температуре. После размораживания перемешайте на вортексе до растворения аминокислот, при необходимости инкубируя при 37 ° C. После растворения аминокислот поместите все аминокислоты на лед , за исключением Asn, Phe и Cys, которые хранят при комнатной температуре. Cys не может полностью растворяться .

  2. На льду добавьте 12 мл стерильной воды в стерильную пробирку Falcon на 50 мл.

  3. Добавить 1.5 мл каждой аминокислоты в следующем порядке , тщательно перемешивая пробирку Falcon после каждого добавления и оставляя раствор на льду: Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys , Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Leu, Cys. Cys может быть добавлен в виде суспензии. После добавления перемешайте на вортексе, пока раствор не станет относительно прозрачным, при необходимости инкубируйте при 37 ° C. Cys не может полностью растворяться .

  4. Аликвоты раствора аминокислоты в 50 пробирок по 26 мкл каждая на льду.Остальные аликвоты по 500 мкл на пробирку на льду. Аликвоты по 26 мкл будут использоваться для калибровки экстракта, а аликвоты по 500 мкл будут использоваться для приготовления буфера. При распределении аликвот часто перемешивайте основную массу, чтобы избежать неравномерного распределения суспензии .

  5. Аликвоты мгновенно замораживают в жидком азоте и хранят при -80 ° C. Безопасность: Носите защитные очки; колпачки экстракционных трубок могут оторваться из-за разницы температур между жидким азотом и комнатной температурой .

  6. Необязательно: Проведите анализ активности свежеприготовленного раствора аминокислот по сравнению с ранее приготовленными растворами аминокислот.

3. Приготовление энергетического раствора

Энергетический раствор используется как для калибровки неочищенного клеточного экстракта, так и для создания буфера, и его следует готовить в больших количествах. По следующему рецепту достаточно примерно для 10000 одиночных реакций. При уменьшении рекомендуется использовать не менее 1/24 приведенных здесь значений. Поскольку энергетическое решение требует значительных денежных затрат, пользователи, впервые использующие его, могут захотеть подготовиться в масштабе 1/24.Конечный состав энергетического раствора: HEPES pH 8 700 мМ, АТФ 21 мМ, GTP 21 мМ, CTP 12,6 мМ, UTP 12,6 мМ, тРНК 2,8 мг / мл, CoA 3,64 мМ, NAD 4,62 мМ, цАМФ 10,5 мМ, фолиновая кислота. 0,95 мМ, спермидин 14 мМ, 3-PGA 420 мМ. Это 14-кратная рабочая концентрация. При желании каждый отдельный элемент в Table 4 можно хранить при -80 ° C для дальнейшего использования.

  1. Удалите все химические вещества из Table 4 от -80 ° C, -20 ° C или 4 ° C до комнатной температуры в течение 30 мин.

  2. Приготовьте исходные растворы, как описано в Таблице 4 .См. Рецепты в Supplemental Material 1 . После приготовления все растворы поместить на лед.

  3. В 15-миллилитровую пробирку Falcon добавьте в следующем порядке , тщательно перемешивая пробирку Falcon после каждого добавления и сохраняя растворы на льду: 3,6 мл 2 M HEPES, 144 мкл воды, 1,39 мл нуклеотида. смесь, 576 мкл 50 мг / мл тРНК, 576 мкл 65 мМ CoA, 276 мкл 175 мМ NAD, 170 мкл 650 мМ цАМФ, 288 мкл 33,9 мМ фолиновой кислоты, 144 мкл 1 M спермидина и 3,09 мл 1,4 M 3-PGA.

  4. Аликвотируйте энергетический раствор в 50 пробирок по 7 мкл в каждой на льду.Остальные аликвоты по 150 мкл на пробирку на льду. Аликвоты по 7 мкл будут использоваться для калибровки экстракта, а аликвоты по 150 мкл будут использоваться для приготовления буфера. Во время аликвотирования часто перемешивайте основную массу .

  5. Аликвоты мгновенно замораживают в жидком азоте и хранят при -80 ° C. Безопасность: Носите защитные очки; колпачки экстракционных трубок могут оторваться из-за разницы температур между жидким азотом и комнатной температурой .

  6. Необязательно: Проведите анализ активности нового энергетического раствора по сравнению с ранее созданным энергетическим раствором.

4. Приготовление буфера

Приготовление буфера требует завершения подготовки экстракта сырых клеток, приготовления раствора аминокислот и приготовления энергетического раствора. Каждый буфер уникален для партии неочищенного клеточного экстракта . В этом разделе оптимизированы Mg-глутамат, K-глутамат и DTT (в указанном порядке) для получения реакций с максимальными уровнями экспрессии. В следующем протоколе используется предварительно написанный шаблон TXTL_e (шаблон) _calibration_JoVE.xlsx ( Supplemental Material 3 ), чтобы откалибровать предварительно приготовленный неочищенный клеточный экстракт и подготовить буфер. Однако можно также откалибровать неочищенный клеточный экстракт и приготовить буфер без матрицы, оптимизировав Mg-глутамат, K-глутамат и DTT вручную и настроив буфер таким образом, чтобы вместе с экстрактом он составлял 75% от общего реакционного объема. При ручной калибровке окончательные условия реакции можно найти на шаге 5.

  1. Заполните форму «Общие данные».

  2. Размораживание на льду 100 мМ Mg-глутамат (4 ° C), 3 M K-глутамат (4 ° C), 6 мМ раствор аминокислот (26 мкл, -80 ° C), энергетический раствор (7 мкл, -80 ° C), 100 мМ DTT (-20 ° C), положительный контроль ДНК (-20 ° C), 40% PEG-8000 (4 ° C), неочищенный клеточный экстракт (-80 ° C) и вода ( 4 ° С). Примечание: используйте 1 нМ рабочую концентрацию pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (плазмида Addgene 40019) для положительного контроля (возбуждение 485 нм, испускание 525 нм) или другой эталон, который дает высокую интенсивность сигнала. 4

  3. Приготовьте семь реакций по 10,5 мкл, протестировав диапазон 4–10 мМ дополнительного Mg-глутамата, путем аликвотирования заданных количеств исходного Mg-глутамата в отдельные микроцентрифужные пробирки. Примечание. Хотя изначально готовится 10,5 мкл реакционной смеси, конечная реакционная способность составляет 10 мкл.

  4. Приготовьте мастер-микс, как указано в шаблоне в разделе «Калибровка Mg-глутамата», добавив дополнительно 80 мМ K-глутамата. Держите на льду и завихряйте после добавления каждого элемента . Примечание. Значения, приведенные здесь и в шаблоне, являются дополнением к количествам Mg-глутамата, K-глутамата и DTT, присутствующих в буфере S30B, используемом для приготовления неочищенного клеточного экстракта.

  5. Добавьте мастер-микс к образцам, содержащим Mg-глутамат, и подготовьте реакции.См. Шаги с 5.10 по 5.13 для получения подробных инструкций.

  6. Запустите реакцию при 29 ° C в инкубаторе или планшет-ридере.

  7. Определите оптимальную концентрацию Mg-глутамата по уровню конечной экспрессии и максимальной скорости экспрессии белка ( Рисунок 4a ). Примечание. Время работы зависит от эксперимента, но обычно длится менее 8 часов.

  8. Повторите шаги с 4.2 по 4.7 для K-глутамата в разделе «Калибровка K-глутамата», установив уровни Mg-глутамата на значения, найденные на этапе 4.7.

  9. Повторите шаги с 4.2 по 4.7 для DTT в разделе «Калибровка DTT», установив уровни Mg-глутамата на значения, найденные на шаге 4.7, и уровни K-глутамата на значения, найденные на шаге 4.8. Примечание. Мы обнаружили, что добавление DTT не оказывает значительного влияния на уровни конечной экспрессии.

  10. Используйте значения, полученные при калибровке в разделе «Состав буфера», чтобы определить состав буфера, который будет приготовлен. На основе количества произведенного неочищенного клеточного экстракта создается рецепт мастер-микса для заданного количества буферов.

  11. Аликвоты разморозить, как указано в рецепте мастер-микса, на льду. После размораживания приготовьте мастер-микс, сохраняя его на льду и встряхивая после добавления каждого элемента .

  12. Аликвота по количеству, указанному в разделе «Состав буфера». Буферные пробирки для мгновенного замораживания в жидком азоте. Во время аликвотирования часто перемешивайте основную массу .

  13. Удалите пробирки из жидкого азота с помощью сетчатого фильтра и немедленно храните при -80 ° C. Безопасность: Носите защитные очки; колпачки экстракционных трубок могут оторваться из-за разницы температур между жидким азотом и комнатной температурой .

5. Экспериментальное выполнение реакции TX-TL

Конечные условия реакции: 8,9-9,9 мг / мл белка (из неочищенного экстракта), 4,5-10,5 мМ Mg-глутамат, 40-160 мМ K-глутамат. , 0,33-3,33 мМ DTT, 1,5 мМ каждой аминокислоты, кроме лейцина, 1,25 мМ лейцина, 50 мМ HEPES, 1,5 мМ АТФ и GTP, 0,9 мМ CTP и UTP, 0,2 мг / мл тРНК, 0,26 мМ CoA, 0,33 мМ NAD, 0,75 мМ цАМФ, 0,068 мМ фолиновой кислоты, 1 мМ спермидин, 30 мМ 3-PGA, 2% PEG-8000. Основная реакция TX-TL состоит из 3 частей (пробирок): неочищенного клеточного экстракта, буфера и ДНК .Соотношение составляет: 75% буфера и экстракта, 25% ДНК. Реакции могут различаться по объему. , и мы условно используем 10 мкл, чтобы минимизировать объем реакции и позволить запуск в 384-луночном планшете. Большие объемы требуют перемешивания для надлежащей оксигенации. В следующем протоколе используется предварительно написанный шаблон TXTL_JoVE.xlsx ( Supplemental Material 4 ) для проведения реакции объемом 10 мкл. Пункты фиолетового цвета указывают значения, введенные пользователем, а пункты синего цвета указывают на дополнительные реагенты, которые нужно добавить в реакцию .Однако можно также провести реакцию без темплата, следуя условиям реакции, изложенным выше.

  1. Заполните форму «Общие данные».

  2. В разделе «Приготовление основной смеси» введите процентное значение экстракта из шага 4.1 в фиолетовое поле.

  3. Спроектируйте свой эксперимент in silico , используя разделы «Подготовка основной смеси» (строки 10-17) и «Подготовка ДНК» (строки 19-50). Как правило, константы можно поместить в раздел «Подготовка основной смеси», а переменные - в раздел «Подготовка ДНК». Уменьшите количество образцов за эксперимент, чтобы избежать испарения образца и смещения времени начала эксперимента . См. Рисунок 6 для примера установки.

  4. В разделе «Приготовление основной смеси» добавьте реагенты, такие как индукторы или белки, которые будут входить во все образцы в постоянной концентрации. Начиная со строки 14, заполните области, заштрихованные синим цветом, оставляя по одному реагенту в каждой строке. Единицы - относительные отношения.

  5. В разделе «Подготовка ДНК» добавьте ДНК, которая будет зависеть от образца.Идентификаторы образцов №1 и №2 соответствуют положительному и отрицательному контролю соответственно. Идентификаторы образцов №3 и выше могут быть изменены пользователем для ДНК, исходной концентрации в нг / мкл, длины в парах оснований, желаемой конечной концентрации в нМ и повторов (10 мкл реакций). Количество исходной ДНК для достижения желаемой конечной концентрации рассчитывается автоматически. Сумма по строке составляет 10,5 * n, где n - количество повторов. Примечание. Хотя конечный объем реакции составляет 10 мкл, в расчетах предполагается, что общий объем составляет 10 мкл.5 мкл на реакцию, чтобы учесть потерю объема при дозировании.

  6. В разделе «Подготовка ДНК» добавьте реагенты или дополнительную ДНК, которая будет использоваться в синих колонках. Исходные концентрации ДНК в нМ можно рассчитать в разделе «Подготовка ДНК», в то время как реагенты для конкретных образцов требуют ручного расчета на основе общего реакционного объема 10,5 * n. Введенные объемы вычитаются из объема воды той же строки.

  7. Удалите необходимое количество пробирок с буфером, неочищенным клеточным экстрактом и положительным контролем в разделе «Пробирки для оттаивания» от -20 ° C или -80 ° C и разморозьте на льду.

  8. Подготовьте образцы ДНК. Для каждого идентификатора образца выделите аликвотирование указанной ДНК, воды и предметов, поставляемых пользователем, из раздела «Подготовка ДНК» в микроцентрифужную пробирку при комнатной температуре. Примечание: во избежание потери образца рекомендуется использовать недавно откалиброванные пипетки, наконечники для пипеток с низким прилипанием и микроцентрифужные пробирки.

  9. Когда пробирки из шага 5.7 оттаивают, приготовьте мастер-микс, состоящий из буфера, экстракта и любых глобальных элементов, предоставленных пользователем, на основе прямоугольников с оранжевым заштрихованием, хранения на льду и встряхивания после добавления каждого элемента. . Примечание: Экстракт очень вязкий. Аликвоты с пузырьками могут быть удалены центрифугированием при 10 000 x g в течение 30 секунд при 4 ° C.

  10. Добавьте количество мастер-микса, указанное в оранжевых ячейках в разделе «Подготовка ДНК» (столбец O), к каждому образцу ДНК и храните при комнатной температуре. Считайте это временем начала реакции .

  11. Вортексируйте каждый образец и центрифугируйте при 10 000 x g в течение 30 секунд при комнатной температуре, чтобы удалить остатки образца и уменьшить образование пузырьков.

  12. Если реакцию проводят в микроцентрифужных пробирках, инкубируйте непосредственно при 29 ° C. В противном случае внесите пипеткой 10 мкл образца в 384-луночный планшет. Примечание: реакции в объемах более 10 мкл могут потребовать перемешивания для насыщения кислородом.

  13. Центрифужный планшет при 4000 x g в течение 30 секунд при комнатной температуре, чтобы удалить остатки образца и уменьшить пузырьки. После этого закройте пластину, чтобы предотвратить испарение.

  14. Запустите реакцию при 29 ° C. Примечание. Время работы зависит от эксперимента, но обычно длится менее 8 часов.

Репрезентативные результаты

Мы представили пятидневный протокол для приготовления эндогенной системы бесклеточной экспрессии TX-TL на основе Escherichia coli . Пример временной шкалы для создания реагентов - неочищенного клеточного экстракта и буфера - можно найти на Рис. 1 . После создания они могут храниться при -80 ° C до одного года. После создания реагентов установка и выполнение эксперимента могут быть выполнены менее чем за 8 часов.

Кроме того, мы оптимизировали условия экспрессии системы бесклеточной экспрессии TX-TL. Другие добавки, поставляемые пользователем, такие как буферы или растворы ДНК, должны быть предварительно откалиброваны на токсичность. Например, разные методы обработки плазмид приводят к разной экспрессии из-за содержания соли. Мы также проверили влияние буфера для элюции Tris-Cl на эффективность реакции (, рис. 5, ).

Пример калибровки неочищенного экстракта клеток, относящийся к шагу 4.1–4,9, показано на Рис. 4a . В целом, наши эксперименты показывают, что неочищенный клеточный экстракт наиболее чувствителен к уровням Mg-глутамата, за которым следуют уровни K-глутамата. Чтобы продемонстрировать бесклеточную систему экспрессии, мы сконструировали и протестировали петлю отрицательной обратной связи на основе репрессии tet . 26 ( рисунок 6 ). В системе бесклеточной экспрессии та же схема, работающая с aTc и без нее, показывает 7-кратное изменение конечной точки экспрессии репортера deGFP после восьми часов экспрессии.Хотя для этого эксперимента не требуются глобальные индукторы или репрессоры, при необходимости они могут быть добавлены в разделе «Приготовление основной смеси».

Рис. 1. График времени для неочищенного клеточного экстракта, раствора аминокислот и приготовления энергетического раствора. Пятидневный график для типичного выполнения протокола приведен выше, оптимизированный для ночных инкубаций и дневных рабочих этапов.

Рис. 2. Анализ стоимости и экспрессии конкурирующих неочищенных клеточных экстрактов. a) Структура затрат на рабочую силу и материалы для бесклеточной экспрессионной системы TX-TL.На основе стоимости реагентов по состоянию на декабрь 2012 г. и затрат на рабочую силу в размере 14 долларов США в час. b) Сравнение стоимости бесклеточной экспрессионной системы TX-TL и других коммерческих систем. Стоимость указана в расчете на мкл, хотя объемы реакции могут варьироваться в зависимости от набора. c) Сравнение выхода бесклеточной экспрессионной системы TX-TL с другими коммерческими системами. Выход экспрессии белка определяется стандартами производителя. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.

Рис. 3. Загрузка и обработка бисерной трубки.а) Демонстрация правильной вязкости раствора ячеек-бус. Раствор клеточных гранул будет иметь вязкость, зависящую от многих факторов, включая количество добавленного буфера S30A, количество добавленных гранул и время, проведенное на льду. b) Загрузка пробирки для взбивания шариков перед быстрым настольным центрифугированием. Центрифугирование удаляет пузырьки, скопившиеся во время загрузки. c) Всплытие пузырьков после настольного центрифугирования. Размер пузырей может быть разным; их можно вытащить или удалить с помощью наконечника пипетки. d) Полностью заполненная трубка для взбивания шариков перед укупоркой. В трубке для взбивания шариков образуется мениск, и колпачок имеет достаточно, чтобы покрыть и вызвать переполнение небольших количеств. д) Правильно загруженный фильтрующий аппарат. Их можно использовать повторно. f) Сравнение правильно обработанной и неправильно обработанной трубки для взбивания шариков. Пробирка слева - это пробирка с хорошим биением - она ​​имеет небольшой и хорошо очерченный верхний слой и очень прозрачный супернатант. Пробирка справа неоптимальна, исходя из более крупного мутного второго слоя и мутного супернатанта.Неоптимальные трубки не должны подвергаться дополнительной обработке.

Рисунок 4. Свойства препаратов сырого экстракта. а) Типичные калибровочные графики для неочищенного клеточного экстракта. Неочищенный экстракт калибруется для дополнительных уровней Mg-глутамата, K-глутамата и DTT в указанном порядке. Показана конечная флуоресценция через 8 часов, а также максимальная скорость продукции белка на основе 12-минутного скользящего среднего. На основании этих графиков приемлемый диапазон дополнительного количества Mg-глутамата составляет 4 мМ, K-глутамата составляет 60-80 мМ, а DTT составляет 0-3 мМ.Обратите внимание, что каждый неочищенный экстракт необходимо калибровать независимо по этим трем переменным. б) Варианты приготовления экстрактов. Показана конечная флуоресценция двух сырых экстрактов, приготовленных в разные даты; планки погрешностей - это 1 стандартное отклонение от трех независимых прогонов в разные дни. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.

Рис. 5. Влияние раствора ДНК на эффективность экспрессии. а) Сравнение двух различных методов очистки плазмид.1 нМ pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 получают с использованием только набора QiaPrep Spin Miniprep (метод очистки 1) или после обработки с помощью набора для очистки QiaQuick PCR (метод очистки 2). Показана конечная флуоресценция через 8 часов, а также максимальная скорость продукции белка на основе 12-минутного скользящего среднего. Планки погрешностей - это 1 стандартное отклонение от четырех независимых прогонов в разные дни. b) Эффект элюирующего буфера (Трис-Cl). Различные концентрации Трис-Cl сравнивают в реакции внеклеточной экспрессии на основе экспрессии 1 нМ pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500.Приведенные концентрации представляют собой конечные концентрации Трис-Cl в реакции; Используемый буфер для элюции представляет собой 10 мМ Tris-Cl. Планки погрешностей - это 1 стандартное отклонение от трех независимых прогонов в разные дни. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.

Рис. 6. Пример выполнения TX-TL контура отрицательной обратной связи. а) Пример настройки бесклеточной реакции исполнения. Проверяет состояние «включено» и «выключено» цепи отрицательной обратной связи с положительным и отрицательным контролями. б) Плазмидная карта петли отрицательной обратной связи. c) Репрезентативные результаты. Данные отражают эксперимент в а) и б) с отрицательным контролем, вычтенным из сигнала. Генетическая схема показана на вставке. Планки погрешностей - это 1 стандартное отклонение от трех независимых прогонов в разные дни. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.

32 32 900 + P среда
Имя Концентрация Сумма Стерилизация Банкноты
Хлорамфеникол (Cm) 34 мг / мл в этаноле 1 мл Стерилизация фильтра (0.22 мкМ) Может быть произведено в больших объемах, хранящихся при -20 ° C для дальнейшего использования.
2xYT + P + Cm пластина с агаром 31 г / л 2xYT, 40 мМ двухосновный фосфат калия, 22 мМ одноосновный фосфат калия, 34 мкг / мл хлорамфеникол 1 пластина Автоклав
Автоклав
31 г / л 2xYT, 40 мМ двухосновный фосфат калия, 22 мМ одноосновный фосфат калия 4 л Автоклав

Таблица 1.Реагенты для 1 дня протокола сырого экстракта клеток.

Имя Концентрация Сумма Стерилизация Банкноты
Трис-база 2 M 250 мл Стерилизовать на фильтре (0,22 мкМ) или в автоклаве Может храниться при комнатной температуре.
DTT 1 M 6 мл Стерилизация фильтра (0.22 мкМ) Можно производить в больших объемах и хранить при -20 ° C для дальнейшего использования.
Буфер S30A 14 мМ Mg-глутамата, 60 мМ K-глутамата, 50 мМ Tris, pH 7,7 2 л Автоклав Для достижения pH 7,7 титровать уксусной кислотой. Добавьте DTT до конечной концентрации 2 мМ непосредственно перед использованием. Хранить при 4 ° C.
Буфер S30B 14 мМ Mg-глутамата, 60 мМ K-глутамата, ~ 5 мМ Трис, pH 8,2 2 л Автоклав Для достижения pH 8.2, титровать 2М трис. Добавьте DTT до конечной концентрации 1 мМ непосредственно перед использованием. Хранить при 4 ° C.

Таблица 2. Реагенты для 2-го дня протокола сырого экстракта клеток.

Сокол
1 2 3 4
Пустые 50 мл Falcon (г)
50 мл Falcon с гранулами (г)
Масса гранул (50 мл) с осадком - пустой 50 мл Falcon) (г)
Объем буфера S30A для добавления (масса гранулы * 0.9) (мл)
Общая масса добавляемых шариков (масса гранул * 5,0) (г)

Таблица 3. Буфер S30A и калькулятор массы шариков для 3-го дня протокола экстракции сырых клеток.

Имя Концентрация Сумма Стерилизация Банкноты
HEPES 2 M, pH 8 4 мл Нет Для достижения pH 8 титровать КОН.
Смесь нуклеотидов 156 мМ АТФ и GTP, 94 мМ CTP и UTP, pH 7,5 1,5 мл Нет Для достижения pH 7,5 титровать КОН.
тРНК 50 мг / мл 600 мкл Нет
CoA 65 мМ 600 мкл Нет
NAD -8 300 мкл Нет Для достижения pH 7.5-8, титровать Трис при 2 М.
cAMP 650 мМ, pH 8 200 мкл Нет Для достижения pH 8 титровать Трис при 2 М.
Фолиновая кислота 33,9 мМ 300 мкл Нет Хотя требуется всего 300 мкл, рецепт в добавке рассчитан на 1,15 мл.
Спермидин 1 M 150 мкл Нет Хранить при 4 ° C, нагревать до 37 ° C до расплавления.
3-PGA 1,4 M, pH 7,5 3,2 мл Нет Для достижения pH 7,5 титровать Tris на 2 M.

Таблица 4. Реагенты для подготовки к протоколу Energy Solution.

Дополнительные материалы 1. Рецепты предметов.

Хлорамфеникол, 34 мг / мл: Приготовьте 0,51 г хлорамфеникола и добавьте этанол до 15 мл. Стерилизовать фильтрованием (0,22 мкМ), аликвотировать в пробирки по 1 мл, хранить при -20 ° C для дальнейшего использования.

Планшет с агаром 2xYT + P + Cm: Приготовьте 1,24 г 2xYT, 1,6 мл раствора двухосновного фосфата калия @ 1 M, 0,88 мл одноосновного раствора фосфата калия @ 1 M, 0,6 г агара и воды до 40 мл. Автоклав. Дать остыть до 50 ° C и добавить 40 мкл Cm. Разлить по 25 мл в чашку Петри размером 100 x 15 мм и дать остыть в течение часа.

Среда 2xYT + P: Приготовьте 124 г 2xYT, 160 мл раствора двухосновного фосфата калия @ 1 M, 88 мл одноосновного раствора фосфата калия @ 1 M и воду до 4 л.Разложите аликвоты в 2 автоклава по 1,88 л и 0,24 л.

Трис-основа, 2 M: Приготовьте 60,57 г Трис-основы и воды до 250 мл. Стерилизовать, хранить при комнатной температуре для дальнейшего использования.

DTT, 1 M: Приготовьте 2,31 г DTT и воды до 15 мл. Стерилизовать фильтрованием (0,22 мкМ), аликвотировать в пробирки по 1 мл, хранить при -20 ° C для дальнейшего использования.

Буфер S30A: Приготовить 10,88 г Mg-глутамата и 24,39 г K-глутамата, 50 мл 2M триса, уксусной кислоты (до pH 7,7) и воды до 2 л. Автоклав, хранить при 4 ° C, добавить 4 мл 1 M DTT перед использованием.

Буфер S30B: Приготовьте 10,88 г Mg-глутамата и 24,39 г K-глутамата, трис при 2 M (до pH 8,2) и воду до 2 л. Автоклав, храните при 4 ° C, добавьте 2 мл 1 M DTT. перед использованием.

HEPES: Приготовьте 1,91 г HEPES (MW 238,21), КОН (до pH 8) и воду до 4 мл.

тРНК: Подготовьте 30 мг тРНК и воду до 600 мкл.

КоА: Приготовьте 30 мг КоА (молекулярная масса 767,53) и воду до 600 мкл.

NAD: Добавить 34,83 ​​мг NAD (молекулярная масса 663.43), Трис в 2 М (до pH 7,5-8) и воду до 300 мкл. (Добавьте 27 мкл триса в концентрации 2 M, чтобы довести pH раствора до 7,5-8).

цАМФ: Добавить 42,80 мг цАМФ (молекулярная масса 329,22), трис 2 М (до рН 8) и воду до 200 мкл. (Добавьте 73 мкл триса в концентрации 2 M, чтобы довести раствор до pH 8).

Фолиновая кислота (33,9 мМ): К 20 мг твердой кальциевой соли фолиновой кислоты (MW 511.5) добавьте 1,15 мл воды.

Спермидин: Приготовьте 23,55 мкл спермидина (молекулярная масса 145,25) и воды до 150 мкл.Приготовьте при комнатной температуре после кратковременного плавления при 37 ° C. 3-PGA: Добавить 1,03 г 3-PGA (MW 230,02), 2 M трис (до pH 7,5) и воду до 3,2 мл. (Добавьте 1,73 мл 2 M триса, чтобы довести pH раствора до 7,5).

Смесь нуклеотидов: Добавьте 145 мг дигидрата дикалиевой соли АТФ (молекулярная масса 619.4), 133 мг динатриевой соли GTP (молекулярная масса 567,14), 79,4 мг дигидрата динатриевой соли CTP (молекулярная масса 563,16), 82,6 мг дигидрата тринатриевой соли UTP. (MW 586,12), КОН при 15% разбавлении (до pH 7,5) и вода до 1.5 мл. (Добавьте 353 мкл КОН при 15% разбавлении, чтобы довести раствор до pH 7,5).

Дополнительные материалы 2. Анализ Брэдфорда.

  1. Удалите средство Брэдфорда с 4 ° C и поставьте на комнатную температуру.

  2. Приготовьте 50 мкл стандарта BSA в концентрации 1 мг / мл и 0,1 мг / мл.

  3. Приготовьте 40 мкл 20-кратного разведения экстракта из шага 1.47.

  4. Добавьте 800 мкл воды в 7 кювет.

  5. Приготовьте стандартные кюветы для 0 мг / мл, 1 мг / мл (10 мкл 0.1 мг / мл BSA), 2 мг / мл (20 мкл 0,1 мг / мл BSA), 4 мг / мл (4 мкл 1 мг / мл BSA), 6 мг / мл (6 мкл 1 мг / мл BSA).

  6. Приготовьте экспериментальные кюветы для 2 мкл образца и 4 мкл образца.

  7. Добавьте 200 мкл агента Брэдфорда в каждую кювету и хорошо перемешайте пипеткой. Инкубируйте при комнатной температуре не менее 10 мин.

  8. Получите стандартную кривую при OD 595 нм, используя кюветы из шага 6.5. Отклонить стандартную кривую, если r 2 <0,95.

  9. Определите концентрацию экстракта при OD 595 нм, используя кюветы из шага 6.6.

Обсуждение

Эндогенная бесклеточная экспрессионная система TX-TL на основе Escherichia coli , описанная здесь, представляет собой простую в использовании трехпробирную реакцию, которая может занять менее восьми часов от настройки до сбора данных. Процесс создания всех реагентов занимает в общей сложности пять дней (со значительными трудозатратами всего за один день), но производит неочищенный экстракт для 3000 реакций и реагенты для создания буфера для 10 000 реакций ( Рисунок 1 ).Кроме того, неочищенный экстракт и реагенты для создания буфера стабильны не менее 1 года при -80 ° C, что позволяет использовать один препарат несколько раз. 4 При цене 0,11 доллара США за 10 мкл реакции (0,26 доллара США, включая труд) затраты на 98% ниже, чем у сопоставимых коммерческих систем (, рисунок 2, ).

Однако в системе есть некоторые нерешенные ограничения. Конечная эффективность приготовления каждого неочищенного клеточного экстракта может варьироваться в зависимости от квалификации пользователя и условий окружающей среды, хотя типичное изменение выхода составляет от 5 до 10% (, рис. 4b, ).В результате следует ожидать вариабельности от партии к партии как в конечной точке экспрессии, так и в динамике экспрессии. Эти вариации, вероятно, сохранятся до тех пор, пока экстракт не будет полностью охарактеризован или пока создание экстракта не будет полностью автоматизировано. Если бесклеточная экспрессионная система используется для проведения чувствительных количественных экспериментов, рекомендуется проводить все эксперименты с одной и той же партией неочищенного клеточного экстракта. Выход из одной партии неочищенного клеточного экстракта, около 3000 реакций, должен быть достаточным для типичных экспериментальных курсов.Хотя мы подозреваем, что вариации можно устранить, увеличив масштаб и автоматизируя процедуру, такие попытки потребуют значительных вложений ресурсов.

Кроме того, хотя конечные уровни экспрессии достаточно легко определить, необходимо проделать большую работу для понимания динамики, присущей бесклеточной системе. Известно, что как конкуренция за ресурсы, так и ограничение ресурсов могут влиять на динамику экспрессии. Например, ограниченная эндогенная сигма 70 может привести к режиму насыщения с увеличенной ДНК-матрицей, производящей профиль экспрессии, аналогичный профилю истощения нуклеотидов или аминокислот. 9,27 Однако не обязательно полностью понимать динамику, чтобы использовать систему. Для чистого увеличения урожайности оптимизацию можно выполнить с помощью подходов машинного обучения. 28 Вопросы конкуренции и ограничения ресурсов могут быть решены с помощью математических моделей, проверенных с использованием экспериментальных данных.

Протокол, представленный здесь, оптимизирован для штамма BL21-Rosetta2, но может быть распространен на другие штаммы E. coli . Модификации BL21-Rosetta2, такие как удаление гена, кодирующего протеазу lon, и добавление генов, кодирующих редкие тРНК, позволяют максимально продуцировать белок.Мы попытались использовать протокол с двумя другими штаммами экстрактов - только BL21 и нокаутом BL21 trxA - и обнаружили на 50% меньший выход белка. Мы предполагаем, что урожайность снижается аналогичным образом при использовании других штаммов. Другие изменения в параметрах, такие как замена ростовой среды 2xYT на LB и другие богатые бульоны, привели к снижению выхода белка.

Бесклеточные системы экспрессии, использующие как эндогенные, так и экзогенные механизмы транскрипции-трансляции и механизмы регуляции, имеют широкое применение как в экспрессии белков и метаболитов, так и в синтетической биологии. 3,29 Вместо того, чтобы ограничиваться контурами, регулируемыми Т7, можно представить себе получение сложных биомолекул в контролируемых пользователем условиях с использованием смеси природных промоторов E.coli и экзогенно поставляемых механизмов транскрипции и регуляции. Без ограничений клеточного деления и метаболизма вариабельность синтетических цепей, таких как репрессилатор, или метаболических путей, таких как продуцирующие артемизинин, можно уменьшить или лучше понять. 30,31 Мы использовали эти преимущества для реализации генетических переключателей, а также для понимания секвестрации сигма-фактора. 9,32 Такая технология может также стать основой «минимальных» или «искусственных» ячеек - небольших, хорошо охарактеризованных и самодостаточных воплощенных единиц экстракта. 33,34

В конечном итоге мы ожидаем немедленного использования этой эндогенной бесклеточной системы экспрессии в качестве прототипа среды для синтетической биологии. Система бесклеточной экспрессии, получившая прозвище «биомолекулярный макет TX-TL», обеспечивает контролируемую среду, в которой синтетические цепи, в конечном итоге предназначенные для экспрессии in vivo , могут проходить этапы прототипирования - циклы тестирования базовой плазмиды, линейной или химически синтезированной ДНК. с последующим анализом и быстрой модификацией.Раунды прототипирования могут быть поддержаны прогнозирующими математическими моделями, разрабатываемыми в настоящее время. Отказавшись от клонирования и манипуляции in vivo с для незавершенных цепей, мы ожидаем, что время инженерного цикла сократится до 1–3 дней вместо стандартных недель.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Чонмина Кима, Дэна Сигал-Гаскинса, Ану Тубагере и Эноха Йенга за помощь в оптимизации протокола, а также Клэр Чен и Барклай Ли за помощь на ранних этапах проекта.Этот материал основан на работе, частично поддерживаемой программой Living Foundries Агентства перспективных исследовательских проектов Министерства обороны США (DARPA / MTO), номер контракта HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS также поддерживается ученым-медиком UCLA / Caltech. Стипендия по программе обучения и стипендия Министерства обороны, Управления научных исследований ВВС, Национальной оборонной науки и инженерии (NDSEG), 32 CFR 168a. Взгляды и выводы, содержащиеся в этом документе, принадлежат авторам и не должны толковаться как представляющие официально политика, явно или подразумеваемая, Агентства перспективных оборонных исследовательских проектов или U.С. Правительство.

Ссылки

  • Нуаро В., Бар-Зив Р., Либхабер А. Принципы бесклеточной сборки генетической цепи. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2003; 100: 12672–12677. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • He MY, He YZ, Luo Q, Wang MR. От ДНК к белку: живые клетки не требуются. Process Biochem. 2011; 46: 615–620. [Google Scholar]
  • Forster AC, Church GM. Проекты синтетической биологии in vitro.Genome Res. 1101; 17: 1–6. [PubMed] [Google Scholar]
  • Шин Дж., Нуаро В. Эффективная бесклеточная экспрессия с помощью эндогенной РНК-полимеразы E. Coli и сигма-фактора 70. Журнал биологической инженерии. 2010; 4: 8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Shimizu Y, et al. Бесклеточная трансляция, восстановленная очищенными компонентами. Nat Biotechnol. 2001; 19: 751–755. [PubMed] [Google Scholar]
  • Шин Дж., Нуаро В. Набор инструментов для внеклеточной экспрессии E. coli: применение в синтетических генных цепях и искусственных клетках.Acs Synth Biol. 2012; 1: 29–41. [PubMed] [Google Scholar]
  • Шин Дж., Нуаро В. Изучение инактивации информационной РНК и деградации белка в бесклеточной системе экспрессии Escherichia coli. Журнал биологической инженерии. 2010; 4: 9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Шин Дж., Джардин П., Нуаро В. Репликация, синтез и сборка бактериофага Т7 в бесклеточной реакции. Acs Synth Biol. 2012; 1: 408–413. [PubMed] [Google Scholar]
  • Сигал-Гаскинс Д., Нуаро В., Мюррей Р.М.Использование биомолекулярных ресурсов в элементарных бесклеточных генных цепях. В: Пао Л., Абрамович Д., редакторы. Американская конференция по контролю; 17-19 июня; Вашингтон. AACC; 2013. С. 1531–1536. [Google Scholar]
  • Карцбрун Э., Шин Дж., Бар-Зив Р. Х., Нуаро В. Крупнозернистая динамика синтеза белка в бесклеточной системе. Письма с физическим обзором. 2011; 106: 048104. [PubMed] [Google Scholar]
  • Хоагланд М.Б., Стивенсон М.Л., Скотт Дж. Ф., Хехт Л. И., Замечник ПК. Растворимый промежуточный продукт рибонуклеиновой кислоты в синтезе белка.J Biol Chem. 1958; 231: 241–257. [PubMed] [Google Scholar]
  • Wood WB, Берг П. Влияние ферментативно синтезированной рибонуклеиновой кислоты на включение аминокислот с помощью системы растворимый белок-рибосома из Escherichia Coli. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 1962; 48: 94. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Зубай Г. Синтез белка в микробных системах in vitro. Анну Рев Жене. 1973; 7: 267–287. [PubMed] [Google Scholar]
  • Пратт Дж.В кн .: Транскрипция и перевод: практический подход. Хеймс Б.Д., Хиггинс С.Дж., редакторы. IRL Press; 1984. С. 179–209. [Google Scholar]
  • Ким Х.С., Ким Д.М. Способы активизации внеклеточного синтеза белка. Журнал бионауки и биоинженерии. 2009; 108: 1–4. [PubMed] [Google Scholar]
  • Мишель-Рейделле Н., Калхун К., Шварц Дж. Стабилизация аминокислот для внеклеточного синтеза белка путем модификации генома Escherichia coli. Метаболическая инженерия. 2004. 6: 197–203. [PubMed] [Google Scholar]
  • Лю Д.В., Завада Дж. Ф., Шварц Дж. Р.Оптимизация приготовления экстракта Escherichia coli S30 для экономичного бесклеточного синтеза белка. Прогресс биотехнологии. 2005. 21: 460–465. [PubMed] [Google Scholar]
  • Андриантоандро Э., Басу С., Кариг Д. К., Вайс Р. Синтетическая биология: новые инженерные правила для развивающейся дисциплины. Молекулярная системная биология. 2006; 2: 2006.0028. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Квок Р. Пять твердых истин для синтетической биологии. Природа. 2010; 463: 288–290. [PubMed] [Google Scholar]
  • Tabor S, Richardson CC.Система РНК-полимераза / промотор бактериофага Т7 для контролируемой эксклюзивной экспрессии определенных генов. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 1985; 82: 1074–1078. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Левицки Б.Т., Маргус Т., Ремме Дж., Нирхаус К.Х. Сцепление транскрипции рРНК и сборки рибосом in vivo. Формирование активных рибосомных субъединиц в Escherichia coli требует транскрипции генов рРНК с помощью РНК-полимеразы хозяина, которая не может быть заменена РНК-полимеразой бактериофага Т7.Журнал молекулярной биологии. 1993; 231: 581–593. [PubMed] [Google Scholar]
  • Искакова М.Б., Шафларски В., Дрейфус М., Ремме Дж., Нирхаус К.Х. Устранение неполадок в сопряженной системе транскрипции-трансляции in vitro, полученной из клеток Escherichia coli: синтез полностью активных белков с высоким выходом. Исследование нуклеиновых кислот. 2006; 34: e135. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Кигава Т. и др. Приготовление экстракта клеток Escherichia coli для высокопродуктивной бесклеточной экспрессии белка.Журнал структурных и. 2004. 5: 63–68. [PubMed] [Google Scholar]
  • Мацуда Т. и др. Улучшение внеклеточного синтеза белка для мечения стабильных изотопов. Журнал биомолекулярный. ЯМР. 2007. 37: 225–229. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ситараман К. и др. Новая система бесклеточного синтеза белка. Журнал биотехнологии. 2004. 110: 257–263. [PubMed] [Google Scholar]
  • Беккей А., Серрано Л. Разработка стабильности в генных сетях с помощью ауторегуляции. Природа. 2000; 405: 590–593.[PubMed] [Google Scholar]
  • Маеда Х., Фуджита Н., Исихама А. Конкуренция между семью сигма-субъединицами Escherichia coli: относительное сродство связывания с основной РНК-полимеразой. Исследование нуклеиновых кислот. 2000; 28: 3497–3503. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Caschera F, et al. Справиться со сложностями: оптимизация внеклеточного синтеза белка с помощью машинного обучения. Биотехнология и биоинженерия. 2011; 108: 2218–2228. [PubMed] [Google Scholar]
  • Hodgman CE, Jewett MC.Бесклеточная синтетическая биология: мышление вне клетки. Метаболическая инженерия. 2012; 14: 261–269. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Эловиц М.Б., Лейблер С. Синтетическая осцилляторная сеть регуляторов транскрипции. Природа. 2000. 403: 335–338. [PubMed] [Google Scholar]
  • Цурута Х. и др. Высокий уровень продукции аморфо-4,11-диена, предшественника противомалярийного агента артемизинина, в Escherichia coli. Plos One. 2009; 4: e4489. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Gardner TS, Cantor CR, Collins JJ.Конструирование генетического переключателя на Escherichia coli. Природа. 2000; 403: 339–342. [PubMed] [Google Scholar]
  • Jewett MC, Forster AC. Обновленная информация о проектировании и строительстве минимальных ячеек. Современное мнение в области биотехнологии. 2010; 21: 697–703. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Нуаро В., Либхабер А. Биореактор везикул как шаг к сборке искусственных клеток. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2004; 101: 17669–17674.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Подготовка проб путем простого извлечения и разложения (SPEED)

% PDF-1.4 % 1 0 obj > эндобдж 3 0 obj > поток GPL Ghostscript 9.222021-03-27T00: 18: 58-07: 002018-08-16T08: 37: 11 + 02: 00PDF24 Creator2021-03-27T00: 18: 58-07: 00uuid: 4dd8c18e-a37a-11e8-0000-e4e4c76eeb7cuuid : d289163f-1dd1-11b2-0a00-8100983a8bffapplication / pdf

  • Подготовка проб путем простой экстракции и разложения (SPEED) - универсальный, быстрый и не содержащий детергентов протокол протеомики на основе экстракции кислоты
  • DoellingerJ
  • конечный поток эндобдж 2 0 obj > эндобдж 4 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 5 0 obj > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 6 0 obj > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 7 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / XObject >>> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 8 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 9 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 10 0 obj > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / XObject >>> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 11 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 12 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 13 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 14 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 15 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 16 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 17 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 18 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 19 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / XObject >>> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 20 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / XObject >>> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 21 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 22 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / XObject >>> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 23 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 24 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / XObject >>> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 25 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 26 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / Type / Page >> эндобдж 315 0 объект [318 0 R] эндобдж 316 0 объект > поток HWˎ W4RF

    Экстракция общего белка с помощью TRIzol

    Извлечение ДНК, РНК и белков - это обычная процедура, включающая молекулярные подходы для исследования генома, транскриптома и протеома биологических образцов.Хотя TRIzol разработан для экстракции ДНК, РНК и белков, он наиболее часто используется для экстракции нуклеиновых кислот, в то время как RIPA является наиболее широко используемым агентом для экстракции белков. Одновременное извлечение ДНК, РНК и белков позволяет сэкономить образцы, а скоординированный анализ отдельного образца имеет решающее значение для точной корреляции между геномными аберрациями и их последствиями для транскриптома и протеома. Таким образом, мы предоставляем подробный протокол, описывающий экстракцию общего белка после выделения нуклеиновых кислот TRIzol.

    Реагенты:

    • ТРИзол
    • Хлороформ
    • Изопропанол
    • Этанол
    • PBS: Для приготовления 1 л 1X PBS: растворите 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na 2 HPO 4 , 0,24 г KH 2 PO 4 в 800 мл дистиллированной H 2 O, затем доведите pH до 7.4 с HCl и отрегулируйте объем до 1 л добавлением дистиллированной H 2 O.
    • 0,3 M раствор гидрохлорида гуанидина: Для приготовления 100 мл: растворяют 2,87 г гидрохлорида гуанидина в 80 мл 95% этанола и доводят объем до 100 мл с помощью дополнительных 95% этанола.
    • 1% раствор SDS: Для приготовления 100 мл: растворите 1 г SDS в 100 мл дистиллированной воды.

    Оснащение:

    • Гомогенизатор (предлагается механический гомогенизатор)

    Шагов:

    Пробоподготовка:

    1.Для культивированных клеток: промойте клетки холодным PBS, добавьте 1 мл TRIzol для 1 ~ 5 x 10 7 клеток, а затем удалите в 1,5 мл пробирку EP на льду.

    Переходите к шагу 3.

    2. Для образцов ткани: взвесьте образец, добавьте 1 мл TRIzol для 50 ~ 100 мг ткани, гомогенизируйте на льду с помощью механического гомогенетра и инкубируйте на льду в течение 5 минут.
    Примечание: будьте осторожны при использовании ультразвукового гомогенизатора, так как это может вызвать разрыв цепи нуклеиновых кислот.

    3.Центрифуга при 12000 об / мин при 4 ° C в течение 5 мин, собрать супернатант в свежую пробирку EP объемом 1,5 мл.

    4. Добавьте 200 мл хлороформа и тщательно перемешайте, а затем инкубируйте на льду в течение 5 минут.

    5. Центрифуга при 12000 об / мин при 4 ° C в течение 15 мин.

    Рисунок 1. Разделение фаз.

    Экстракция белка:

    6. Удалите водную фазу для экстракции РНК.

    7.Осаждение ДНК путем добавления 300 мл (на 1 мл TRIzol) этанола. Тщательно перемешайте и инкубируйте 3 мин при комнатной температуре.

    8. Центрифугируйте при 2000 g при 4 ° C в течение 5 минут, соберите супернатант в свежую EP-пробирку объемом 2,0 мл.

    9. Осаждение белков путем добавления 1,5 мл изопропанола (на 1 мл TRIzol). Тщательно перемешайте и инкубируйте 10 мин при комнатной температуре.

    10. Центрифуга при 12 000 g при 4 ° C в течение 10 мин, слить супернатант.

    11. Добавьте 2 мл 0,3 М раствора гидрохлорида гуанидина и инкубируйте 20 мин при комнатной температуре.

    12. Центрифугируйте при 12000 g при 4 ° C в течение 5 минут, удалите супернатант.

    13. Повторите шаги 11 и 12.

    14. Промойте белковый осадок 2 мл этанола, как описано в шагах 11–12.

    15. Сушите белковый осадок в вакууме в течение 5-10 мин.
    Примечание. Избегайте длительной сушки, так как это может вызвать трудности с повторной растворимостью белковой фракции.

    Ресолюбилизация белков:

    16. Добавьте 1 мл 1% раствора SDS на 50 ~ 100 мг ткани, растворите белок повторным пипетированием.
    Примечание. Инкубируйте при 50 ° C после пипетирования, чтобы растворить белок.

    17. Центрифуга при 10 000 g при 4 ° C в течение 10 мин, собрать супернатант в свежую пробирку на 1,5 мл.

    18. Анализ белка вестерн-блоттингом.

    Если у вас возникнут вопросы, свяжитесь с нами по адресу:.

    Артикул:

    1. Аманда Б. Хаммон, и др. , Выделение и солюбилизация белков после экстракции РНК и ДНК TRIzol ® из материала пациента после длительного хранения, Biotechniques. 2007 Apr; 42 (4): 467–472.

    Вернуться к ресурсам

    Твиттер Facebook

    Сравнение методов прямого контакта и воздействия экстракта для оценки цитотоксичности ПФО

    % PDF-1.4 % 1 0 obj > эндобдж 2 0 obj > поток application / pdfdoi: 10.1038 / s41598-018-19428-5

  • Springer US
  • Научные отчеты, DOI: 10.1038 / s41598-018-19428-5
  • Сравнение методов прямого контакта и воздействия экстракта для оценки цитотоксичности ПФО
  • Гириш К. Шривастава
  • Мария Л. Алонсо-Алонсо
  • Иван Фернандес-Буэно
  • Мария Т. Гарсия-Гутьеррес
  • Фернандо Рулл
  • Jesamp # x000FA; s Медина
  • Роза М.Коко
  • Дж. Карлос Пастор
  • 10.1038 / s41598-018-19428-5 http://dx.doi.org/10.1038/s41598-018-19428-5journal Научные отчеты © 2018, Автор (ы) 2045-232210.1038 / s41598-018-19428-5Springer2018-01- 17T13: 24: 47 + 01: 002018-01-13T15: 05: 35 + 05: 302018-01-17T13: 24: 47 + 01: 00TrueiText® 5.3.5 © 2000-2012 1T3XT BVBA (версия AGPL) VoRuuid: a4

    6-7ba4-4560-b214-0d5b8a139e3euuid: a5602dcf-c128-4113-b8b2-7bcbd06b0585default1
  • converteduuid: 21b2e354-4374-46b9-945e-e727converted topdbox 2: 06b9-945e-e727converted-2: PDF-файл 2B
  • http: // ns.adobe.com/xap/1.0/mm/xmpMMXMP Media Management Schema
  • Внутренний идентификатор на основе UUID для конкретного воплощения документа InstanceIDURI
  • internal Общий идентификатор для всех версий и представлений документа. OriginalDocumentIDURI
  • http://ns.adobe.com/pdf/1.3/pdf Adobe PDF Schema
  • internal Объект имени, указывающий, был ли документ изменен для включения информации о треппинге TrappedText
  • http: // ns.adobe.com/pdfx/1.3/pdfxpdfx
  • внутренний идентификатор стандарта PDF / X GTS_PDFXVersionText
  • внутренний Уровень соответствия стандарту PDF / X GTS_PDFXConformanceText
  • internal Компания, создающая PDFCompanyText
  • internal Дата последнего изменения документа SourceModifiedText
  • Внутренние зеркала Крест: DOIdoiText
  • http: // www.aiim.org/pdfa/ns/id/pdfaidPDF/A ID Schema
  • internalPart of PDF / A standardpartInteger
  • внутренняя Поправка к стандарту PDF / A amdText
  • внутренний Уровень соответствия стандарту PDF / A Текст
  • http://prismstandard.org/namespaces/basic/2.0/prismPrism
  • external Тип агрегирования определяет единицу агрегирования для коллекции контента. Комментарий PRISM рекомендует использовать словарь с контролируемым типом агрегирования PRISM для предоставления значений для этого элемента.Примечание: PRISM не рекомендует использовать значение #other, разрешенное в настоящее время в этом контролируемом словаре. Вместо использования #other обратитесь к группе PRISM по адресу [email protected], чтобы запросить добавление вашего термина в словарь с контролируемым типом агрегирования. aggregationTypeText
  • externalCopyright copyrightText
  • external - цифровой идентификатор объекта для статьи. DOI также может использоваться как идентификатор dc :.Если используется в качестве идентификатора dc: identifier, форма URI должна быть захвачена, а пустой идентификатор также должен быть захвачен с помощью prism: doi. Если в качестве требуемого идентификатора dc: identifier используется альтернативный уникальный идентификатор, то DOI следует указывать как чистый идентификатор только в пределах prism: doi. Если URL-адрес, связанный с DOI, должен быть указан, тогда prism: url может использоваться вместе с prism: doi для предоставления конечной точки службы (то есть URL-адреса). doiText
  • externalISSN для электронной версии проблемы, в которой встречается ресурс.Разрешает издателям включать второй ISSN, идентифицирующий электронную версию проблемы, в которой встречается ресурс (следовательно, e (lectronic) Issn. Если используется, prism: eIssn ДОЛЖЕН содержать ISSN электронной версии. См. Prism: issn. issnText
  • external Название журнала или другого издания, в котором был / будет опубликован ресурс. Обычно это используется для предоставления названия журнала, в котором появилась статья, в качестве метаданных для статьи, а также такой информации, как название статьи, издатель, том, номер и дата обложки.Примечание. Название публикации можно использовать для различения печатного журнала и онлайн-версии, если названия различаются, например, «журнал» и «magazine.com». PublicationNameText
  • externalЭтот элемент предоставляет URL-адрес статьи или единицы содержания. Платформа атрибутов необязательно разрешена для ситуаций, в которых необходимо указать несколько URL-адресов. PRISM рекомендует использовать вместе с этим элементом подмножество значений платформы PCV, а именно «мобильный» и «Интернет».ПРИМЕЧАНИЕ. PRISM не рекомендует использовать значение #other, разрешенное в управляемом словаре платформы PRISM. Вместо использования #other обратитесь к группе PRISM по адресу [email protected], чтобы запросить добавление вашего термина в словарь, контролируемый платформой. urlText
  • http://www.niso.org/schemas/jav/1.0/javNISO
  • external Значения для версии статьи журнала являются одним из следующих: AO = Авторский оригинал SMUR = Представленная рукопись на рассмотрении AM = принятая рукопись P = Доказательство VoR = версия записи CVoR = Исправленная версия записи EVoR = Расширенная версия Recordjournal_article_versionClosed Выбор текста
  • конечный поток эндобдж 3 0 obj > эндобдж 8 0 объект [9 0 R 10 0 R 11 0 R 12 0 R 13 0 R 14 0 R 15 0 R] эндобдж 9 0 объект

    500 Внутренняя ошибка сервера | Документы Apigee

    Вы просматриваете документацию Apigee Edge.
    См. Документацию Apigee X.

    Была ли эта инструкция по устранению неполадок полезной? Пожалуйста дай нам знать кликнув Отправить отзыв .

    Видео

    Посмотрите следующие видео, чтобы узнать больше об устранении 500 внутренних ошибок сервера.

    Видео Описание
    Введение Содержит введение в 500 внутренних ошибок сервера и возможные причины.Также демонстрирует ошибка внутреннего сервера 500 в реальном времени вместе с инструкциями по поиску и устранению ошибки.
    Обработка вызовов службы и извлечение ошибок переменных Демонстрирует две 500 внутренних ошибок сервера, вызванных политиками Service Callout и Extract Variable. и показывает, как искать и устранять эти ошибки.
    Обработка ошибок политики JavaScript показывает внутреннюю ошибку сервера 500, вызванную политикой JavaScript и действиями. для поиска и устранения этой ошибки.
    Обработка отказов внутренних серверов Показывает пример 500 внутренних ошибок сервера, вызванных отказом внутреннего сервера, и показывает шаги. для устранения ошибок.

    Признак

    Клиентское приложение получает код состояния HTTP 500 с сообщением «Внутренняя ошибка сервера» как ответ на вызовы API. Внутренний сервер 500 ошибка может быть вызвана ошибкой во время выполнения любой политики в Edge или ошибкой на целевом / внутреннем сервере.

    Код состояния HTTP 500 - это общий ответ об ошибке. Это означает, что сервер обнаружил непредвиденное условие, которое помешало ему выполнить запрос. Эта ошибка обычно возвращается сервером, когда другой код ошибки не подходит.

    Сообщения об ошибках

    Может появиться следующее сообщение об ошибке:

    HTTP / 1.1 500 Внутренняя ошибка сервера
     

    В некоторых случаях вы можете увидеть другое сообщение об ошибке с более подробной информацией.Вот образец сообщение об ошибке:

    {
       "вина":{
          "деталь": {
             "errorcode": "steps.servicecallout.ExecutionFailed"
          },
          "faultstring": "Выполнение ServiceCallout callWCSAuthServiceCallout завершилось неудачно. Причина: ResponseCode 400 рассматривается как ошибка"
       }
    }
     

    Возможные причины

    Ошибка 500 Internal Server Error может возникать по разным причинам. В Edge, причины можно разделить на две основные категории в зависимости от того, где произошла ошибка:

    Ошибка выполнения в пограничной политике

    Политика внутри прокси API может выйти из строя по какой-либо причине.В этом разделе объясняется, как устранить проблему, если внутренняя ошибка сервера 500 происходит во время выполнения политики.

    Диагностика

    Примечание: Ошибка 500 Internal Server может возникать из-за множества различных причины. Например, ошибка 500 может возникать при выполнении политики или возникать на внутренний целевой сервер. По этой причине ниже мы предоставили несколько общих диагностических шагов, чтобы поможет вам определить и устранить проблемы этого типа. Мы также приводим несколько примеров, которые дают конкретные шаги по устранению этих ошибок в зависимости от причины проблемы.
    Шаги диагностики для пользователей частного и публичного облака

    Если у вас есть сеанс трассировки пользовательского интерфейса для ошибки, то:

    1. Убедитесь, что ошибка была вызвана выполнением политики. Подробнее см. Определение источника проблемы.
    2. Если ошибка произошла во время выполнения политики, продолжить. Если ошибка была вызвана внутренний сервер, перейдите в раздел Ошибка на внутреннем сервере.
    3. Выберите запрос API, который завершился ошибкой 500 Internal Server Error в трассировке.
    4. Изучите запрос и выберите конкретную политику, в которой произошел сбой, или поток с именем «Ошибка», которая следует сразу после неудачной политики в трассировке.
    5. Получите более подробную информацию об ошибке, проверив поле «error» в разделе «Свойства». или содержание ошибки.
    6. Используя собранную вами информацию об ошибке, попытайтесь определить ее причину.
    Действия по диагностике только для пользователей частного облака

    Если у вас нет сеанса трассировки UI, тогда:

    1. Убедитесь, что ошибка произошла во время выполнения политики.Подробнее см. Определение источника проблемы.
    2. Если ошибка была вызвана выполнением политики, продолжить. Если ошибка произошла во время политики исполнение, продолжайте. Если ошибка была вызвана внутренним сервером, перейдите в раздел Ошибка на внутреннем сервере.
    3. Используйте журналы доступа Nginx, как описано в разделе Определение источник проблемы для определения политики сбоя в прокси API, а также уникальный идентификатор сообщения запроса
    4. Проверьте журналы обработчика сообщений ( / opt / apigee / var / log / edge-message-processor / logs / system.log ) и найдите уникальный идентификатор сообщения запроса в нем.
    5. Если вы найдете уникальный идентификатор сообщения-запроса, попробуйте получить дополнительную информацию о причина неудачи.

    Разрешение

    Если вы определили причину проблемы с политикой, попробуйте исправить проблему, исправление политики и повторное развертывание прокси.

    Следующие примеры показывают, как определить причину и устранить различные типы вопросов.

    Если вам нужна дополнительная помощь в устранении неполадок 500 Internal Server Error или вы подозреваете что это проблема в Edge, свяжитесь с Apigee Служба поддержки.

    Пример 1: сбой в политике вызова службы из-за ошибки в серверной части сервер

    Если вызов внутреннего сервера завершается неудачно в рамках политики вызова службы с любой ошибкой, например как 4XX или 5XX, то это будет рассматриваться как 500 Internal Server Error.

    1. Вот пример, когда серверная служба дает сбой с ошибкой 404 внутри службы. Политика выноски.Конечному пользователю отправляется следующее сообщение об ошибке:
      {
      "вина":
           {"деталь":
                 {"errorcode": "steps.servicecallout.ExecutionFailed"
                 }, "faultstring": "Выполнение ServiceCallout service_callout_v3_store_by_lat_lon
       не смогли. Причина: ResponseCode 404 рассматривается как ошибка "
                }
           }
      }
       
    2. В следующем сеансе пользовательского интерфейса трассировки отображается код состояния 500, вызванный ошибкой в ​​службе. Политика выноски:

    3. В этом примере свойство «error» указывает причину политики вызова службы. сбой как «ResponseCode 404 обрабатывается как ошибка». Эта ошибка может возникнуть, если ресурс, доступ к которому осуществляется через URL-адрес внутреннего сервера в политике Service Callout, не доступный.
    4. Проверить доступность ресурса на внутреннем сервере. Это может быть недоступно временно / навсегда или он мог быть перемещен в другое место.
    Пример 1 Разрешение
    1. Проверить доступность ресурса на внутреннем сервере. Это может быть недоступно временно / навсегда или он мог быть перемещен в другое место.
    2. Исправьте URL-адрес внутреннего сервера в политике вызова службы, чтобы он указывал на действительный и существующий ресурс.
    3. Если ресурс недоступен только временно, попробуйте сделать запрос API после того, как ресурс доступен.

    Давайте теперь посмотрим на другой пример, где 500 Internal Server Error вызвана ошибкой. в политике извлечения переменных и узнайте, как устранить и устранить проблему.

    1. Следующая трассировка в сеансе пользовательского интерфейса показывает код состояния 500 из-за ошибки в извлечении. Политика переменных:

    2. Выберите неудачную политику извлечения переменных, прокрутите вниз и посмотрите на ошибку ". Контент » раздел подробнее:

    3. Содержимое ошибки указывает, что услуга "serviceCallout.oamCookieValidationResponse " переменная недоступна в политика извлечения переменных. Как видно из названия переменной, она должна содержать ответ предыдущей политики вызова службы.
    4. Выберите политику вызова службы в трассировке, и вы можете обнаружить, что Переменная « serviceCallout.oamCookieValidationResponse » не была установлена. Этот указывает, что вызов серверной службы завершился неудачно, в результате чего был получен пустой ответ. Переменная.
    5. Хотя политика вызова службы завершилась неудачно, выполнение политик после службы Политика обратного вызова продолжается, поскольку установлен флаг continueOnError в политике вызова службы. к истине, как показано ниже:
      
         Callout.OamCookieValidation 
        <Свойства />
        
           false 
        
         serviceCallout.oamCookieValidationResponse 
        
          <Свойства />
           http: // {URL} 
        
      
       
    6. Обратите внимание на уникальный идентификатор сообщения «X-Apigee.Message-ID» для этого конкретного API. запрос от трассировки, а именно:
      1. Выберите в запросе этап «Записанные данные аналитики».
      2. Прокрутите вниз и обратите внимание на значение X-Apigee.Message-ID.

      Примечание: Следующие шаги может выполнять только Пользователи Edge Private Cloud .
    7. Просмотр журнала обработчика сообщений ( /opt/apigee/var/log/edge-message-processor/system.log ) и найдите уникальный идентификатор сообщения, записанный на шаге №6. Следующее сообщение об ошибке было обнаружено для конкретного API запрос:
      2017-05-05 07: 48: 18,653 org: myorg env: prod api: myapi rev: 834 messageid: rrt-04984fed9e5ad3551-c-wo-32168-77563 NIOThread @ 5 ОШИБКА HTTP.КЛИЕНТ - HTTPClient $ Context.onTimeout (): ClientChannel [C:] @ 149081 useCount = 1 bytesRead = 0 bytesWritten = 0 age = 3002ms lastIO = 3002ms .onConnectTimeout connectAddress = mybackend.domain.com / XX.XX.XX.XX: 443 resolvedAddress = mybackend.domain.com / XX.XX.XX.XX
       

      Вышеупомянутая ошибка указывает на то, что политика вызова службы не удалась из-за подключения. ошибка тайм-аута при подключении к внутреннему серверу.

    8. Чтобы определить причину ошибки тайм-аута подключения, выполните telnet к внутреннему серверу от процессора (ов) сообщений.Телнет команда выдала ошибку «Время ожидания соединения истекло», как показано ниже:
      telnet mybackend.domain.com 443
      Пробуем XX.XX.XX.XX ...
      telnet: подключиться к адресу XX.XX.XX.XX: время ожидания соединения истекло
       

      Обычно эта ошибка наблюдается при следующих обстоятельствах:

      • Когда внутренний сервер не настроен для разрешения трафика от пограничного сообщения Процессоры.
      • Если внутренний сервер не прослушивает определенный порт.

      В проиллюстрированном выше примере, хотя политика извлечения переменных не удалась, фактическая причина заключалась в том, что Edge не смог подключиться к внутреннему серверу в вызове службы политика. Причина этого сбоя заключалась в том, что внутренний сервер не был настроен на разрешить трафик от пограничных процессоров сообщений.

      Ваша собственная политика извлечения переменных будет вести себя иначе и может не работать для другого причина. Вы можете устранить проблему соответствующим образом в зависимости от причины сбоя свою политику извлечения переменных, проверив сообщение об ошибке имущество.

    Пример 2 Разрешение
    1. Исправьте причину ошибки или сбоя в политике извлечения переменных.
    2. В проиллюстрированном выше примере решение состояло в том, чтобы исправить конфигурацию сети, чтобы разрешить трафик от пограничных процессоров сообщений к вашему внутреннему серверу. Это было сделано разрешить список IP-адресов процессоров сообщений на конкретном внутреннем сервере. Например, в Linux вы можете использовать iptables , чтобы разрешить трафик из IP-адреса обработчика сообщений на внутреннем сервере.
    Пример 3: Ошибка в политике JavaCallout

    Давайте теперь рассмотрим еще один пример, где 500 Internal Server Error вызвана ошибкой. в политике Java Callout и узнайте, как устранить и устранить проблему.

    1. Следующая трассировка пользовательского интерфейса показывает код состояния 500 из-за ошибки в политике вызовов Java:

    2. Выберите поток с именем «Ошибка» , за которым следует неудачная политика вызова Java. чтобы получить подробную информацию об ошибке, как показано на рисунке ниже:

    3. В этом примере свойство «ошибка» в разделе «Свойства» показывает что сбой вызван просроченным паролем, используемым при подключении к базе данных Oracle. из политики JavaCallout.Ваш собственный вызов Java будет вести себя иначе и будет заполните другое сообщение в свойстве error .
    4. Проверьте код политики JavaCallout и подтвердите правильность конфигурации, которая должна быть использовал.
    Пример 3 Разрешение

    Исправьте код или конфигурацию выноски Java соответствующим образом, чтобы избежать исключения времени выполнения. В проиллюстрированный выше пример сбоя вызова Java, приведенный выше, потребуется использовать правильный пароль для подключения к базе данных Oracle для решения проблемы.

    Ошибка на внутреннем сервере

    Внутренняя ошибка сервера 500 также может исходить от внутреннего сервера. Эта секция объясняет, как устранить проблему, если ошибка исходит от внутреннего сервера.

    Диагностика

    Этапы диагностики для всех пользователей

    Причины других внутренних ошибок могут сильно различаться. Вам нужно будет диагностировать каждую ситуацию независимо.

    1. Убедитесь, что ошибка была вызвана внутренним сервером.Подробнее см. Определение источника проблемы.
    2. Если ошибка была вызвана внутренним сервером, продолжайте. Если ошибка произошла во время выполнение политики, перейдите к Ошибка выполнения в Edge Политика.
    3. Выполните следующие действия в зависимости от того, есть ли у вас доступ к сеансу трассировки для сбой API, или если бэкэнд является сервером Node.js:

    Если у вас нет сеанса трассировки для неудачного вызова API :

    1. Если трассировка пользовательского интерфейса недоступна для неудачного запроса, проверьте внутренний сервер журналы, чтобы получить подробную информацию об ошибке.
    2. Если возможно, включите режим отладки на внутреннем сервере, чтобы получить дополнительные сведения о ошибка и причина.

    Если у вас есть сеанс трассировки для неудачного вызова API :

    Если у вас есть сеанс трассировки, следующие шаги помогут вам диагностировать проблему.

    1. В инструменте трассировки выберите запрос API, который завершился неудачно с 500 Internal Server Ошибка.
    2. Выберите этап «Ответ, полученный от целевого сервера» из сбойного Запрос API, как показано на рисунке ниже:

    3. Просмотрите раздел «Содержимое ответа» , чтобы получить подробную информацию об ошибке.

    4. В этом примере содержимое ответа, которое является конвертом SOAP, показывает строку ошибки как «Не авторизован» сообщение . Наиболее вероятная причина этого проблема в том, что правильные учетные данные (имя пользователя / пароль, токен доступа и т. д.) не передаются в внутренний сервер пользователем. Эту проблему можно решить, передав правильные учетные данные в внутренний сервер.

    Если серверная часть является Node.js сервер:

    1. Если бэкэнд - это сервер Node.js Backend Server , проверьте логи Node.js для конкретного прокси API в пользовательском интерфейсе Edge ( пользователи публичного и частного облака могут проверьте логи Node.js ). Если вы являетесь пользователем Edge Private Cloud , вы также можете проверить журналы обработчика сообщений ( /opt/apigee/var/log/edge-message-processor/logs/system.log ) для получения дополнительных сведений. по поводу ошибки.

      Параметр журналов NodeJS в пользовательском интерфейсе Edge - вкладка «Обзор» прокси-сервера API

    Разрешение
    1. После того, как вы определили причину ошибки, устраните проблему на своем внутреннем сервере.
    2. Если это внутренний сервер Node.js:
      1. Проверьте, не вызвана ли ошибка вашим пользовательским кодом, и, если возможно, устраните проблему.
      2. Если ошибка возникает не из-за вашего пользовательского кода или вам нужна помощь, свяжитесь с Поддержка Apigee.

    Если вам нужна дополнительная помощь в устранении неполадок 500 Internal Server Error или вы подозреваете что это проблема в Edge, свяжитесь с Apigee Служба поддержки.

    Определение источника проблемы

    Используйте одну из следующих процедур, чтобы определить, возникла ли ошибка 500 Internal Server Error. во время выполнения политики в прокси-сервере API или внутренним сервером.

    Использование трассировки в пользовательском интерфейсе

    Примечание: Действия в этом разделе могут выполняться как общедоступными, так и Пользователи частного облака.

    1. Если проблема все еще активна, включите трассировку в пользовательском интерфейсе для уязвимого API.
    2. После записи трассировки выберите запрос API, который показывает код ответа как 500.
    3. Просмотрите все этапы неудачного запроса API и проверьте, какая фаза возвращается. 500 Внутренняя ошибка сервера:
      1. Если ошибка возникает во время выполнения политики, перейдите к «Ошибка выполнения» в пограничной политике.
      2. Если внутренний сервер ответил с помощью внутреннего сервера 500, перейдите к ошибке на внутреннем сервере.

    Использование мониторинга API

    Примечание: Действия, описанные в этом разделе, могут выполнять только пользователи публичного облака.

    API Monitoring позволяет быстро изолировать проблемные области для диагностики ошибок, проблем с производительностью и задержкой, а также их источника, такие как приложения для разработчиков, прокси API, серверные цели или платформа API.

    Рассмотрим пример сценария, демонстрирующий, как устранять проблемы 5xx с вашими API-интерфейсами с помощью API-мониторинга. Например, вы можете настроить оповещение, чтобы получать уведомления, когда количество ошибок из 500 кодов состояния или шагов.servicecallout.ExecutionFailed превышает определенный порог.

    Использование Nginx Access Журналы

    Примечание: Действия, описанные в этом разделе, предназначены для пользователей Edge Private Cloud. Только.

    Вы также можете обратиться к журналам доступа Nginx, чтобы определить, был ли выдан код состояния 500 во время выполнения политики в прокси-сервере API или внутренним сервером.Это особенно полезно, если проблема возникала в прошлом или если проблема периодически возникает, и вы не могут зафиксировать трассировку в пользовательском интерфейсе. Используйте следующие шаги, чтобы определить эту информацию из Журналы доступа Nginx:

    1. Проверьте журналы доступа Nginx ( / opt / apigee / var / log / edge-router / nginx / ~ . <номер порта> _ журнал_доступа ).
    2. Поиск, если есть какие-либо 500 ошибок для конкретного прокси API на конкретном продолжительность.
    3. Если есть какие-либо 500 ошибок, проверьте, является ли ошибка политикой или ошибкой целевого сервера, как показано ниже:

      Пример записи, показывающей ошибку политики

      Пример записи, показывающей ошибку целевого сервера

    4. После того, как вы определили, является ли это ошибкой политики или целевого сервера:
      1. Перейти к ошибке выполнения в пограничной политике, если это ошибка политики.
      2. Перейти к ошибке на внутреннем сервере, если это целевой Ошибка сервера.

    Политика обслуживания вызовов | Документы Apigee

    Вы просматриваете документацию Apigee Edge.
    См. Документацию Apigee X.

    Что

    Политика вызова службы позволяет вам вызывать другую службу из потока прокси-сервера API. Ты может выполнять вызовы либо к внешней службе (например, к внешней конечной точке службы RESTful), либо внутренние службы (например, прокси API в той же организации и среде).

    • Во внешнем варианте использования вы выполняете вызов стороннего API, который является внешним по отношению к вашему прокси. Ответ стороннего API анализируется и вставляется в ответ вашего API. сообщение, обогащение и «смешивание» данных для конечных пользователей приложения. Вы также можете сделать запрос используя политику Service Callout в потоке запроса, а затем передать информацию в ответ в TargetEndpoint прокси API.
    • В другом случае вы вызываете прокси, который находится в той же организации и среде, что и тот, с которого вы звоните.Например, вы можете найти это полезным, если у вас есть прокси, который предлагает некоторую дискретную низкоуровневую функциональность, которую будут использовать один или несколько других прокси. Для Например, прокси, который предоставляет операции создания / чтения / обновления / удаления с внутренним хранилищем данных может быть целевым прокси для нескольких других прокси, которые предоставляют данные клиентам.

    Политика поддерживает запросы по HTTP и HTTPS.

    Образцы

    Локальный вызов внутреннего прокси-сервера

    
         менеджер данных 
         по умолчанию 
    
     

    В этом примере создается выноска для локального прокси-сервера API (то есть в той же организации и окружение) вызвал диспетчер данных , указав свою конечную точку прокси, имя которой по умолчанию .

    URL как переменная

    
         http://example.com/{request.myResourcePath} 
    
     

    В этом примере используется переменная в URL-адресе для динамического заполнения URL-адреса цели. В часть протокола URL-адреса, http: //, не может быть указана Переменная. Кроме того, вы должны использовать отдельные переменные для доменной части URL-адреса и для остальной части URL.

    Google геокодирование / определение запроса

    
         Встроенное сообщение запроса 
        <Переменная запроса = "authenticationRequest">
          <Установить>
            
               {запрос.queryparam.postalcode} 
               {request.queryparam.country} 
               false 
            
          
        
         GeocodingResponse 
         30000 
        
           http://maps.googleapis.com/maps/api/geocode/json 
        
    
     
    http: // maps.googleapis.com/maps/api/geocode/json

    Вместо использования такой политики, как «Назначить сообщение» для создания объекта запроса, вы можете определите его непосредственно в политике Service Callout. В этом примере политика вызова службы устанавливает значения трех параметров запроса, передаваемых внешней службе. Вы можете создать все сообщение запроса в политике Service Callout, которое определяет полезную нагрузку, тип кодирования например application / xml, заголовки, параметры формы и т. д.

    Вот еще один пример, когда запрос формируется до достижения Service Callout. политика.

    
        
         GeocodingResponse 
         30000 
        
           http://maps.googleapis.com/maps/api/geocode/json 
        
    
     

    Содержимое сообщения запроса извлекается из переменной GeocodingRequest (которая может быть заполняется, например, политикой AssignMessage).Ответное сообщение назначается переменная с именем GeocodingResponse, где это доступны для анализа политикой извлечения переменных или пользовательским кодом, написанным на JavaScript. или Java. Политика ожидает 30 секунд ответа от Google Geocoding API, прежде чем тайм-аут.

    Для полного образца прокси API, который использует этот пример Service Callout, вместе с Назначение политик сообщений и извлечения переменных, см. Использование политики. состав.

    Вызов целевых серверов

    
         выноска службы 
        <Свойства />
        
             false 
        
         myResponse 
        
            <Балансировщик нагрузки>
                 RoundRobin 
                <Имя сервера = "httpbin" />
                <Имя сервера = "yahoo" />
            
             / получить 
        
    
     

    Эта политика использует атрибут LoadBalancer для вызова целевых серверов и балансировки нагрузки. через них.В этом примере нагрузка распределяется между двумя целевыми серверами с именем httpbin. и "yahoo". Для получения информации о настройке целевых серверов для вашего прокси и настройке балансировка нагрузки, см. Балансировка нагрузки по бэкэнд-серверы.


    О политике обращения в службу поддержки

    Существует множество сценариев, в которых вы можете использовать политику вызова службы в своем прокси-сервере API. Для Например, вы можете настроить прокси API для выполнения вызовов внешней службы для доставки данные о геолокации, отзывы покупателей, товары из розничного каталога партнера и т. д.

    Пример: Учитесь на практике!
    Если вы хотите увидеть Service Callout в действии, ознакомьтесь с этим примером «Учимся на практике» в примерах Apigee GitHub. Просто клонируйте репозиторий и следуйте инструкциям в этой теме. В примере используется Assign Message для установки пути запроса, затем использует политику вызова службы для отправки запроса внешней службе.

    Выноска обычно используется с двумя другими политиками: «Назначить сообщение» и «Извлечь переменные».

    В состав типичной политики обращения за услугами входят:

    1. Назначить сообщение policy: создает сообщение запроса, заполняет заголовки HTTP, параметры запроса, устанавливает HTTP глагол и т. д.
    2. Service Callout policy: ссылается на сообщение, созданное с помощью Assign Message policy, определяет целевой URL для внешнего вызова и определяет имя для объекта ответа что целевая служба возвращает.

      Для повышения производительности вы также можете кэшировать ответы на вызовы службы, как описано в этом Тема сообщества Apigee: https://community.apigee.com/questions/34110/how-can-i-store-the-results-of-the-servicecallout.html.

    3. Извлечь переменные policy: обычно определяет выражение JSONPath или XPath, которое анализирует созданное сообщение. по вызову службы.Затем политика устанавливает переменные, содержащие значения, извлеченные из Ответ на вызов службы.

    См. Раздел Использование политики состав для полного образца прокси API, который использует политику Service Callout вместе с политики «Назначить сообщения» и «Извлечь переменные».

    Примечание: Альтернативный подход к сервисному вызову - HTTPClient. написано на JavaScript с использованием объектной модели JavaScript.

    Пользовательская обработка ошибок

    Пример: Учитесь на практике!
    В этом примере Learn Edge показано, как проверить код HTTP в вызове службы. ответ и выбросить настраиваемое исключение в зависимости от значения кода.Пример возвращает настраиваемое сообщение об ошибке, когда целевая служба возвращает статус 404. Просто клонируйте репозиторий и следуйте инструкциям в этой теме. Пример иллюстрирует общий шаблон для обработки ошибки вызова службы. .

    Ссылка на элемент

    Ниже приведены элементы и атрибуты, которые можно настроить в этой политике:

    
         Пользовательская метка, используемая в пользовательском интерфейсе 
        
             false 
            <Удалить>
                
                
                <Путь />
                <Версия />
                <Глагол />
             
             <Копировать>
                
                
                <Путь />
                <Версия />
                <Глагол />
            
            <Добавить>
                <Заголовки />
                
                
            
            <Установить>
                <Заголовки />
                
                
                <Полезная нагрузка />
                
                
                <Путь />
                <Версия />
                <Глагол />
            
        
         calloutResponse 
         30000 
        
             http: // пример.ru 
            
            
            <Свойства />
        
        
            
            
            <Путь />
        
    
     

    Атрибуты

    
     

    В следующей таблице описаны атрибуты, общие для всех родительских элементов политики:

    Атрибут Описание По умолчанию Присутствие
    название

    Внутреннее имя политики.Значение атрибута name может содержат буквы, цифры, пробелы, дефисы, подчеркивания и точки. Это значение не может превышает 255 символов.

    При желании можно использовать элемент , чтобы пометить политику в редактор прокси пользовательского интерфейса управления с другим именем на естественном языке.

    НЕТ Требуется
    continueOnError

    Установите значение false , чтобы возвращать ошибку при сбое политики.Это ожидается поведение для большинства политик.

    Установите значение true , чтобы выполнение потока продолжалось даже после выполнения политики терпит неудачу.

    ложь Дополнительно
    включен

    Установите значение true , чтобы применить политику.

    Установите значение false отключите политику. Политика не будет принудительно, даже если он остается прикрепленным к потоку.

    правда Дополнительно
    асинхронный

    Этот атрибут устарел.

    ложь Устарело

    Элемент

    Используйте в дополнение к атрибуту name для обозначения политики в редактор прокси пользовательского интерфейса управления с другим названием на естественном языке.

      Отображаемое имя политики  
    По умолчанию

    НЕТ

    Если вы опустите этот элемент, значение атрибута name политики будет использовал.

    Присутствие Дополнительно
    Тип Строка

    Элемент

    Задает переменную, содержащую сообщение запроса, которое отправляется от прокси API на другая услуга.Переменная может быть создана предыдущей политикой в ​​потоке, или вы можете создать ее. встроено в политику вызова службы.

    
         false 
        <Удалить>
            
            
            <Путь />
            <Версия />
            <Глагол />
        
        <Копировать>
            
            
            <Путь />
            <Версия />
            <Глагол />
        
        <Добавить>
            <Заголовки />
            
            
        
        <Установить>
            <Заголовки />
            
            
            <Полезная нагрузка />
            
            
            <Путь />
            <Версия />
            <Глагол />
        
    
     

    Синтаксис тегов , , и такой же, как и для тегов Назначить сообщение политика.

    Подэлементы и поддерживают функция подстановки переменной строки называется создание шаблонов сообщений.

    Политика возвращает ошибку, если сообщение запроса не может быть разрешено или неверно. тип сообщения запроса.

    В простейшем примере вы передаете переменную, содержащую сообщение запроса, которое было заполнено ранее в потоке прокси API:

    
     

    Или вы можете заполнить сообщение запроса, отправленное внешней службе, в самой политике вызова службы:

    <Запрос>
      <Установить>
        <Заголовки>
          
    application / json
    POST {"message": "мое тестовое сообщение"} false
    По умолчанию Если вы опускаете элемент запроса или любой из его атрибутов, Edge назначает следующие значения по умолчанию :

    <Запрос clearPayload = "true" переменная = "servicecallout.запрос "/>

    Давайте посмотрим, что означают эти значения по умолчанию. Во-первых, clearPayload = true означает, что новый объект запроса создается каждый раз, когда выполняется политика ServiceCallout. Это означает, что запрос и путь URI запроса никогда не используются повторно. Во-вторых, переменная по умолчанию имя, servicecallout.request , является зарезервированным именем, которое назначается запросу. если вы не укажете имя.

    Важно знать об этом имени по умолчанию, если вы используете маскирование данных - если вы опускаете имя переменной, вам нужно добавить servicecallout.запросите для конфигурации вашей маски. Например, если вы хотите замаскировать заголовок авторизации, чтобы он не отображался в сеансах трассировки, вы должны добавить следующее в свою конфигурацию маскирования, чтобы захватить имя по умолчанию:

    servicecallout.request.header.Authorization .

    Присутствие По желанию.
    Тип НЕТ

    Атрибуты

    Атрибут Описание По умолчанию Присутствие
    переменная

    Имя переменной, которая будет содержать сообщение запроса.

    servicecallout.request Дополнительно
    прозрачный

    Если истина , переменная, содержащая сообщение запроса, очищается после запрос отправляется к цели HTTP, чтобы освободить память, используемую сообщением запроса.

    Установите clearPayload значение false, только если сообщение запроса требуется после вызова службы. выполнен.

    правда Дополнительно

    Элемент

    /

    Если установлено значение true, политика игнорирует любую неразрешенную ошибку переменной в запросе.

    
         false 
    
     
    По умолчанию ложь
    Присутствие Дополнительно
    Тип логическое

    Элемент

    Включите этот элемент, когда логика прокси API требует ответа от удаленного вызова для дальнейшая обработка.

    Когда этот элемент присутствует, он указывает имя переменной, которая будет содержать ответное сообщение, полученное от внешней службы. Ответ от цели присваивается переменная только тогда, когда весь ответ успешно прочитан политикой. Если удаленный вызов не выполняется по какой-либо причине, политика возвращает ошибку.

    Если этот элемент опущен, прокси API не ждет ответа; Поток прокси API выполнение продолжается с любыми последующими шагами потока.Кроме того, чтобы заявить об очевидном, без каких-либо Ответ элемент, ответ от цели недоступен для обработки последующие шаги, и прокси-поток не сможет обнаружить сбой в удаленном вызове. Обычное использование для исключения элемента Response при использовании ServiceCallout: для регистрации сообщения во внешнюю систему.

      calloutResponse 
     
    По умолчанию NA
    Присутствие Дополнительно
    Тип Строка

    Элемент

    Время в миллисекундах, в течение которого политика вызова службы будет ожидать ответа от цель.Вы не можете установить это значение динамически во время выполнения. Если для вызова службы истекло время ожидания, возвращается HTTP 500, политика не выполняется, и прокси API переходит в состояние ошибки, так как описано в разделе «Обработка неисправностей».

     30000 
     
    По умолчанию 55000 миллисекунд (55 секунд), время ожидания HTTP по умолчанию для Apigee Край
    Присутствие Дополнительно
    Тип Целое

    Элемент

    Предоставляет сведения о транспорте, такие как URL, TLS / SSL и свойства HTTP.Увидеть Справочник по конфигурации .

    Примечание. Вы можете использовать переменные потока для создания URL-адреса в элемент.
    
         http://example.com 
        
        
        <Свойства />
    
     
    По умолчанию НЕТ
    Присутствие Требуется
    Тип НЕТ

    / элемент

    URL-адрес вызываемой службы:

    Элемент поддерживает функция подстановки переменной строки называется создание шаблонов сообщений.
    
         http://example.com 
    
     

    Вы можете динамически предоставить часть URL-адреса с помощью переменной. Однако протокольная часть URL-адрес, http: // ниже, не может быть указывается переменной. В следующем примере вы используете переменную для указания значения запроса. параметр:

     http://example.com/forecastrss?w=${request.header.woeid} 
     

    Или задайте часть пути URL-адреса с помощью переменной:

     http: // пример.ru / {request.resourcePath}? w = $ {request.header.woeid} 
     

    Если вы хотите использовать переменную для указания домена и порта URL-адреса, используйте одну переменную только для домена и порта, а вторая переменная для любой другой части URL:

     http: // {request.dom_port} / {request.resourcePath} 
     
    По умолчанию НЕТ
    Присутствие Требуется
    Тип Строка

    Элемент

    /

    Конфигурация TLS / SSL для внутренней службы.Для получения справки по настройке TLS / SSL см. Настройка TLS от Edge до серверной части (облако и частное облако) и «Конфигурация TLS / SSL TargetEndpoint» в справочнике по настройке прокси API.

    
         https://example.com 
        
             true 
             true 
             myKeystore 
             myKey 
             myTruststore 
            <Шифры />
            <Протоколы />
        
    
     
    По умолчанию НЕТ
    Присутствие Дополнительно
    Тип НЕТ

    Элемент

    /

    Свойства транспорта HTTP для серверной службы.Для получения дополнительной информации см. Справочник по свойствам конечной точки.

    
         http://example.com 
        <Свойства>
             true 
            <Имя свойства = "request.retain.headers">
              User-Agent, Referer, Accept-Language
            
        
    
     
    По умолчанию НЕТ
    Присутствие Дополнительно
    Тип НЕТ

    Элемент

    /

    Вызовите один или несколько целевых серверов и выполните балансировку нагрузки на них.См. Цель Call серверы в разделе Примеры. См. Также Балансировка нагрузки на серверной части. серверы. См. Также это сообщество сообщение, в котором обсуждаются способы вызова целевых серверов как из политики Service Callout, так и из с использованием правил маршрута.

       RoundRobin      / get  
     
    По умолчанию НЕТ
    Присутствие Дополнительно
    Тип НЕТ

    Элемент

    Определяет локальный прокси, то есть прокси в той же организации и среде, что и цель сервисных вызовов.

    Для дальнейшего указания цели используйте либо элементы и , либо элемент .

    
       
       
       <Путь />
    
     
    По умолчанию НЕТ
    Присутствие Требуется
    Тип НЕТ

    Элемент

    /

    Имя прокси API, являющегося целью локального вызова.Прокси должен быть в том же организация и окружающая среда как доверенное лицо, совершающее звонок.

    
        менеджер данных 
        по умолчанию 
    
     

    Вместе с элементом включите Элемент для указания имени конечной точки прокси, которая должна быть нацеленным на звонок.

    
       
       
    
     
    По умолчанию НЕТ
    Присутствие Требуется
    Тип Строка

    Элемент

    /

    Имя конечной точки прокси, которая должна быть целью вызовов.Это конечная точка прокси в прокси API, указанный с помощью элемента .

    
        менеджер данных 
        по умолчанию 
    
     
    По умолчанию НЕТ
    Присутствие Дополнительно
    Тип НЕТ

    Элемент

    /

    Путь к целевой конечной точке.Конечная точка должна ссылаться на прокси в том же организация и окружающая среда как доверенное лицо, совершающее звонок.

    Используйте это вместо пары / , если вы этого не сделаете. знать - или не могу полагаться - на имя прокси. Путь может быть надежной целью.

    
        / data-manager 
    
     
    По умолчанию НЕТ
    Присутствие Дополнительно
    Тип НЕТ

    Схемы

    Пример: См. Наш GitHub образцы репозитория для самых последних схем.

    Переменные расхода

    Переменные потока обеспечивают динамическое поведение политик и потоков во время выполнения на основе HTTP. заголовки, содержимое сообщения или контекст потока. Доступны следующие предварительно определенные переменные потока. после выполнения политики вызова службы. Для получения дополнительной информации о переменных потока см. Справочник по переменным.

    Service Callouts имеют собственный запрос и ответ, и вы можете получить доступ к этим данным через переменные. Поскольку основное сообщение использует запрос .* и ответ. * префиксы переменных, используйте myrequest. * и calloutResponse. * Префиксы (значения по умолчанию в конфигурации Service Callout) для получить данные сообщения, относящиеся к сервисному вызову. Первый пример в следующей таблице показывает как получить HTTP-заголовки в служебном вызове.

    Переменная Описание

    Ниже приведен пример получения заголовков запроса и ответа Service Callout. аналогично тому, как вы получите заголовки из основного запроса и ответа.

    calloutResponse .header. Имя заголовка

    myRequest .header. Имя заголовка

    , где calloutResponse - это имя переменной для ответа в службе. Выноска, а myRequest - это имя переменной для запроса. Например:

    calloutResponse.header.Content-Length

    возвращает заголовок Content-Length ответа Service Callout.

    Область : из переадресации вызова службы
    Тип : Строка
    Разрешение : Чтение / запись

    Заголовок сообщения в запросе или ответе Service Callout. Например, если API цель прокси - http://example.com, а цель вызова службы - http://mocktarget.apigee.net, эти переменные являются заголовками выноски для http: //mocktarget.apigee.сеть.

    servicecallout.requesturi

    Область : Из запроса сервисного вызова вперед
    Тип : Строка
    Разрешение : Чтение / Запись

    URI TargetEndpoint для политики ServiceCallout. URI - это URL TargetEndpoint. без указания протокола и домена.

    сервисный вызов.{policy-name} .target.url

    Область : Из запроса сервисного вызова вперед
    Тип : Строка
    Разрешение : Чтение / Запись

    Целевой URL-адрес для вызова службы.

    calloutResponse.content

    , где calloutResponse - это имя переменной в конфигурации Service Callout.

    Область : из ответа на вызов службы вперед
    Тип : Строка
    Разрешение : Чтение / запись

    Тело ответа от вызова службы.

    servicecallout. {Policy-name} .expectedcn

    Область : Из запроса сервисного вызова вперед
    Тип : Строка
    Разрешение : Чтение / Запись

    Ожидаемое общее имя TargetEndpoint, как указано в ServiceCallout политика.Это имеет смысл только тогда, когда TargetEndpoint ссылается на TLS / SSL. конечная точка.

    servicecallout. {Policy-name} .failed

    Область : из ответа на вызов службы вперед
    Тип : логическое значение
    Разрешение : чтение / запись

    Логическое значение, указывающее, была ли политика успешной, ложной или неудачной, истинной.

    Ошибки

    В этом разделе описаны коды ошибок и сообщения об ошибках, которые возвращаются, а также переменные ошибок, которые устанавливаются Edge, когда эта политика вызывает ошибку.Эта информация важна, если вы разрабатываете правила сбоя, чтобы устранять неисправности. Чтобы узнать больше, см. Что вам нужно знать об ошибках политики и обработке неисправности.

    Ошибки выполнения

    Эти ошибки могут возникать при выполнении политики.

    Нужна помощь в устранении ошибки? Нажмите в столбце Исправить для получения подробной информации об устранении неполадок. Совет: Используйте API Monitoring для исследования неисправности коды и быстрее диагностируют проблемы.См. Раздел Настройка предупреждения кода ошибки политики. для примера. См. Полный перечень кодов неисправности. список всех кодов ошибок, с которыми вы можете справиться с помощью API-мониторинга.
    Код неисправности HTTP-статус Причина Исправить
    steps.servicecallout.ExecutionFailed 500

    Эта ошибка может возникнуть, если:

    • политика просит обработать неверный или недействительный ввод.
    • , внутренняя целевая служба возвращает статус ошибки (по умолчанию 4xx или 5xx).
    steps.servicecallout.RequestVariableNotMessageType 500 Переменная запроса, указанная в политике, не относится к типу Message. Например, если это строка или другой тип, не связанный с сообщением, вы увидите эту ошибку.
    ступеньки.servicecallout.RequestVariableNotRequestMessageType 500 Переменная запроса, указанная в политике, не относится к типу сообщения запроса. Для Например, если это тип ответа, вы увидите эту ошибку.

    Ошибки развертывания

    Эти ошибки могут возникать при развертывании прокси-сервера, содержащего эту политику.

    Нужна помощь в исправлении ошибки? Щелкните в столбце Fix для получения подробной информации об устранении неполадок.
    Имя ошибки Причина Исправить
    URL Отсутствует Элемент внутри отсутствует или пуст.
    ConnectionInfoMissing Эта ошибка возникает, если в политике нет или элемент.
    InvalidTimeoutValue Эта ошибка возникает, если значение отрицательное или нулевое.

    Переменные неисправности

    Эти переменные устанавливаются при возникновении ошибки времени выполнения. Для получения дополнительной информации см. Что вам нужно знать об ошибках политики.

    Переменные Где Пример
    неисправность.name = " fault_name " имя_ ошибки - это имя ошибки, как указано в таблице ошибок времени выполнения выше. Название неисправности - это последняя часть кода неисправности. fault.name = "RequestVariableNotMessageType"
    сервисный вызов. policy_name .failed имя_политики - указанное пользователем имя политики, вызвавшей ошибку. сервисный вызов.SC-GetUserData.failed = true

    Пример ответа об ошибке

    Примечание: Для обработки ошибок лучше всего перехватить код ошибки - часть сообщения об ошибке.

    Об авторе

    alexxlab administrator

    Оставить ответ