Оформление выписки из протокола образец: Выписка из протокола — общего собрания, образец, аттестационной комиссии на соответствие, педагогического совета

Оформление выписки из протокола образец: Выписка из протокола — общего собрания, образец, аттестационной комиссии на соответствие, педагогического совета

образец и порядок составления, кто ее подписывает

Юридические лица, созданные на основании членства в них граждан и иных организаций, решают основные вопросы деятельности на общем собрании участников, которое является высшим органом управления. Уставами или положениями устанавливается его компетенция и определяется, решения по каким вопросам правомочны принимать все участники.

К таким организациям, образованным по принципу членства, относятся хозяйственные общества, наиболее распространенными из них являются акционерные и общества с ограниченной ответственностью, а также некоммерческие объединения граждан и юридических лиц: всевозможные ТСЖ, СНТ, ЖСК, некоммерческие партнерства, ассоциации и союзы.

Содержание статьи

Порядок проведения

Как правило, на общем собрании большинством голосов принимаются решения:

• о создании, реорганизации, ликвидации ООО;
• утверждение устава и внесение в него изменений;
• участие в других юридических лицах;
• образование исполнительных органов и выборы органов управления;
• утверждение годового отчета;
• назначение ревизионной или аудиторской проверки.

Инициатива созыва собрания принадлежит исполнительному органу или группе участников, числом не менее определенного процента от их числа согласно учредительным документам. Процедура должна отвечать требованиям закона, регулирующего деятельность организации, и устава. Всем членам заблаговременно должно быть выслано уведомление, содержащее дату, время, место проведения и повестку дня.

В целях проверки правомочности собрания и наличия кворума рекомендуется проводить регистрацию прибывших с указанием документа, удостоверяющего личность, и проставлением подписи участника напротив своей фамилии.

Собрание в самом начале должно выбрать председательствующего, на которого возлагается его проведение, и секретаря для ведения протокола.

В протоколе должен быть отражен весь его ход, выступления участников, прения, обсуждения вопросов повестки, голосование и его результаты, принятые решения

• Во вводной части указывается дата начала и окончания сбора, количество лиц, принимающих в нем участие, процентное соотношение прибывших к общему количеству членов организации, наличие или отсутствие кворума, а также вопросы, включенные в повестку.
• В основной части описывается последовательность рассмотрения вопросов, при этом можно составить краткий протокол с фиксацией пункта повестки и принятого решения или полный с записью речей докладчиков, реплик, мнений.

По окончании собрания составляется официальный протокол на основании записей, которые вел избранный секретарь. Срок его изготовления обычно – от 3 до 5 дней. Изготовленный документ подписывается председательствующим и секретарем и хранится вместе со всей документацией сбора: уведомлением, листом регистрации, черновыми записями о ходе обсуждений.

Ненадлежащее составленный протокол может быть основанием для признания принятого решения недействительным.

Собрания участников могут проводиться путем заочного голосования, без созыва всех членов организации. В таких случаях инициаторы уведомляют в обычном порядке о созыве и порядке принятия решений по вопросам повестки. Голосование проводится путем заполнения высланных организатором бюллетеней в течение определенного срока. По итогам подсчета голосов, отраженных в бюллетенях, составляется протокол. Такая форма голосования может быть применена и в обычных очных сборах в целях исключения факта отказа участником от выраженного мнения.

Для АО и ООО законодательством предусмотрено нотариальное удостоверение принятых решений. Но если в уставе установлено, что протокол должен быть подписан всеми участниками лично или с использованием электронной подписи, позволяющей достоверно установить волю голосовавшего, то можно не привлекать нотариуса.

Что собой представляет выписка?

Выписка из протокола – это точная его копия по конкретному вопросу или части

Выписку не нужно путать с ксерокопией, поскольку это отдельный документ, и составляется он в том же порядке, что и сам протокол с указанием присутствовавших, повестки, обсуждения по конкретному вопросу и принятому решению.

Заверяет ее руководитель организации в лице директора, председателя правления или председателя совета партнерства и скрепляет печатью.

На документе ставится отметка «верно», подпись и должность заверяющего лица и дата составления. Он предоставляется в тех случаях, когда на повестке собрания было большое количество вопросов и протокол содержит большое количество информации, не относящейся к правам лица, требующего его выдачи.

Общее собрание акционеров

Деятельность акционерных обществ регулируется федеральным законом, который содержит требование по раскрытию информации, в том числе и о проведении общего собрания, путем опубликования

В случае нарушения указанной нормы общество может быть привлечено к административной ответственности. Сам же документ должен быть составлен не позднее 3-х дней с даты закрытия собрания.

Публикация не лишает акционеров права требовать выписку, которую ему обязан предоставить единоличный орган управления в лице директора.

Собрание участников ООО

Законом об обществах с ограниченной ответственностью не установлен срок изготовления протокола, но он может быть предусмотрен в уставе. В документе, помимо информации, указанной выше, обязательно должны быть отражены результаты голосования с указанием количества голосовавших за принятие решения, против и воздержавшихся.

В течение 10 дней с даты оформления итогов собрания они должны быть направлены всем участникам, в противном случае органы управления могут быть привлечены к административной ответственности. Выписку также может требовать любой участник.

Подробнее о том, как провести данное собрание, смотрите на следующем видео:

Собрание некоммерческих организаций

Законодательство не содержит строгих требований к составлению протокола общего собрания различных товариществ и некоммерческих партнерств, в форме которых создаются СРО – профессиональные объединения.

Обязанность ведения документа предусмотрена законом и внутренними документами, уставом и положениями.

После проведения собрания протокол, в котором отражены все рассмотренные вопросы и принятые решения, подписывается председателем и секретарем и хранится у руководства. Выписка может быть предоставлена любому члену организации.

В случае сомнений в ее подлинности у третьих лиц, для представления которым участник ее затребовал, может быть истребована копия протокола, заверенная единоличным исполнительным органом.

Как составить выписку из протокола собрания образец

Протоколы очень важная часть в любом делопроизводстве. С их помощью оформляются все важные собрания или заседания на предприятии. Но, в некоторых случаях нужна выписка из документа, по одному какому то пункту.

Основные моменты, которые понадобятся при составлении

Если возникает потребность цитировать определенную часть протокола, а весь остальной его смысл просто не нужен, делается выписка. При этом совсем не нужно предоставлять полную версию протокола, достаточно чтоб документ был правильно оформлен. Так же выписка поможет донести до масс только некоторые сведения, а основную информацию оставить за кадром.

Не смотря на то, что не существует унифицированной формы оформления выписки, все же есть несколько пунктов и советов, к которым стоит прислушаться. Протокол составляется для документирования заседаний, собраний, конференций, докладов, и прочего. В зависимости от типа собрания протоколы разделяются на:

• Полный протокол. В нем обязательно должна быть зафиксирована вся информация о ходе собрания, включая высказывания ее участников, замечания и реплики. Это более точная форма фиксации.
• Краткие, которые составляются, если нужно зафиксировать только данные докладчиков, вопросы которые обсуждались, и окончательное решение, которое было принято. Чаще всего такой тип документа используется для фиксирования оперативок или других коротких рабочих собраний.

Чаще всего протоколы, как и выписки из них, составляются на фирменных бланках предприятия, или на альбомных листах со штампом компании. Обязательно в бумаге должна быть указана такая информация:

1. Полное название компании или организации.
2. Название документа, который составляется. В нашем случае это протокол или выписка из него.
3. Порядковый номер протокола.
4. Место, где проводилось заседание.
5. Если необходимо ставится гриф утверждения, но это не является обязательным условием.
6. Дата, когда проводилось собрание или оперативка.
7. Текст документа, который разделяется на вводный и основной. В вводной части обязательно указываются данные обо всех участниках собрания, их данные и должности, которые они занимают.
8. Подписи все участников мероприятия, которыми они подтверждают правильность и достоверность всего изложенного в документе.

В полном варианте протокол получается значительных размеров, основная часть может занимать даже несколько листов.

В выписке вы можете подать сведения, которые касаются только одного конкретного явления или действия, и не давать знать о всех вопросах, которые обсуждались во время заседания.

Правовые нормы

В терминологическом стандарте «Делопроизводство и архивное дело» нет определения термину «выписка из протокола». Этот вид документа относится к разделу архивных выписок из документов.

Но, понятие выписка из документа есть в современном словаре архивной терминологии. При этом нужно понимать, что правила и порядок оформления выписок соответствует оформительской последовательности копий документов. Но, такие данные можно назвать правильными только частично.

На самом деле выписка составляется в тех ситуациях, когда копировать весь протокол не имеет смысла, или если в документе есть конфиденциальная информация, которую нежелательно знать посторонним людям.

Документ не считается действующим, пока он не заверен документально. Обязательно должно быть:

1. От руки написано «Верно»
2. Полное название должности, которую занимает ответственное лицо, которое заверяет документ
3. Личная подпись
4. После подписи в скобках нужно ее расшифровать.
5. Дата, когда бумага была заверена.

Если следовать всем правилам, документ будет заверен правильно, и приобретет юридическую силу.

Что представляет собой выписка, и зачем она нужна?

Выпиской из протокола называется копия части документа, которая несет основные сведения по отдельному пункту или вопросу. При составлении документа важно обозначить:

• Вводную часть, в которой будут указаны вопросы, которые рассматривались на повестке дня.
• Копия нужных абзацев документа, где указаны заслушанные вопросы и принятые по ним решения.
• Реквизиты, которые являются копией тех, которые стоят на оригинале.
• Заверительная подпись. Она обязательно должна содержать слово «верно», а далее подпись составителя с расшифровкой, его подпись, дата, когда документ был написан.

Чаще всего выписки используются для донесения нужной информации, которая была принята во время заседания, до заинтересованных субъектов.

Выписка из протокола

На деле именно с помощью таких выписок происходит контроль за процессами производства или выполнением административных решений, формируется документация организации.

По правилам, секретарь организации в течении двух дней после оформления и подписания договора, должен оформить все необходимые копии, и отправить их по почте или вручить лично ответственным лицам.

Как оформляется выписка из протокола?

Не смотря на то, что нет четко регулированного порядка составления выписки, лучше всего придерживаться такого проверенного алгоритма:

1. Для начала нужно дать название документу. В данном случае это будет « Выписка из протокола собрания…». Обязательно правильно укажите название собрания, его дату и присутствующих на ней работников.
2. Из основного документа следует скопировать вводную часть. При этом обязательно прописываются все реквизиты оригинала, в которые входит дата и место собрания, количество присутствующих работников.
3. Процитируйте из протокола нужный отрывок, делать это нужно предельно внимательно, которая касается именно нужного вопроса. Так же обязательно указывается порядковый номер пункта, по которому делается выписка.
4. Основной текст документа формируется с помощью копирования основного текста нужного пункта. Нужно скопировать только ту часть, которая касается именно того вопроса, который нужен для раскрытия темы.

Обязательно укажите такие части, как «Слушали», суть обсуждения вопроса, и пункт «Постановили».

Пример протокола общего собрания

1. Укажите должностных лиц, которые подписались в конце протокола, тем самым заверили правильность его составления.
2. Руководитель или секретарь должен заверить получившуюся бумагу. Для этого в конце он пишет слово «Верно», и ставит собственную подпись и дату.

Кто должен подписывать документ

В законодательстве нет такого закона, который бы заставил заверять бумагу только руководителям. Иногда их нужно оформить очень много, и вместо того чтоб решать текущие важные вопросы, директор должен заниматься бумажной работой. В некоторых случаях выписка может заверяться руководством, но в большинстве случаев это делают секретари предприятия. В конце бумаги секретарь ставит свою подпись, чем подтверждает, что документ составлен правильно, и написанное абсолютно верно. Это правило касается внутренних документов предприятия.

Что же касается документов, которые отправляются в другие организации, то они заверяются исключительно руководством. Секретарь может поставить и свою роспись, но подпись начальника должна быть обязательно. Иначе бумага не будет иметь никакой юридической силы.

В нашем материале вы подробно ознакомитесь с тем, как составить протокол общего собрания трудового коллектива.

Здесь мы подробно рассмотрим, как верно составить коллективный трудовой договор.

Что нужно делать для получения выписки из ЕГРИП? Об этом вы узнаете из нашего материала.

Кроме этого обязательно должна присутствовать печать компании. Она должна быть расположена таким образом, чтоб край захватывал подпись директора или ответственного лица, и название его должности.

В итоге можно сказать, что выписка из протокола общего собрания это документ, в котором содержится копия вводной части бумаги с необходимым вводным вопросом, которая не включает в себя повестку дня, и копия отдельного абзаца об итоговом постановлении.

В выписке могут быть ответы как на несколько вопросов сразу, так и на один из них отдельно, в зависимости от потребности.

Остались вопросы? Узнайте, как решить именно Вашу проблему — позвоните прямо сейчас:

+7 (499) 577-03-71
(Москва)

+7 (812) 425-60-36
(Санкт-Петербург)

8 (800) 350-23-69 доб 680
Для всех регионов!

Это быстро и бесплатно!

Главная суть документа в информировании ответственных лиц организации о решениях, которые были приняты на собраниях. Так же выписки из документов могут отсылаться в заинтересованные организации для того чтоб наладить сотрудничество.

Что такое протокол мероприятия

Протокол — это официальный документ, который ведется в письменном виде в ходе общего собрания людей, объединенных одним делом или проблемой. Общий сбор может быть у жильцов одного дома, акционеров или работников предприятия, а записывать результаты события сейчас требуют даже на родительских собраниях в школах. В резолюции отражают ход событий, перечень затрагиваемых вопросов и обсуждений, очередность выступлений и их основные тезисы, а также принятые решения.

Поскольку выписка из протокола общего собрания, образец которой представлен в статье, — это частичная копия стенограммы мероприятия, в которой содержатся краткие сведения и итог рассмотрения конкретного вопроса, в ней нужно указать полное наименование организации (юридического лица), дату проведения сбора, и сформулировать вопрос, который является основной темой фрагмента. При необходимости могут полностью копироваться абзацы текста, в которых приводятся принятые по вопросу решения. В юридических лицах такая форма документации используется для донесения новой информации. По сути она является основанием для изменений в производственных процессах организации и уточнения частностей. В этом случае делопроизводитель компании оформляет необходимое число копий и передает ответственным за исполнение лицам. Эти же копии впоследствии будут основным документом для контроля за исполнением принятых решений.

В отношении физических лиц фрагменты из документов, касающихся прав и законных интересов граждан, выдаются по их требованию, в порядке, установленном актуальным на сегодняшний день Указом Президиума ВС СССР от 04.08.1983 № 9779-X (ред. от 08.12.2003) «О порядке выдачи и свидетельствования предприятиями, учреждениями и организациями копий документов, касающихся прав граждан».

В каких случаях нужна

Чаще всего фрагменты резолюций требуются:

• для предоставления в финансовые организации;
• для ФНС или иных контролирующих органов;
• для предоставления информации участникам общества в части, их касающейся;
• при обращении заинтересованных лиц по вопросам, которые были рассмотрены.

Как написать выписку из протокола собрания

Составлением подобной документации занимается секретарь организации или сотрудник, ответственный за делопроизводство. Единого регламентированного порядка составления этого документа не разработано. Существуют лишь общепринятые правила оформления:

• начинаться она должна со слов «Выписка из протокола общего собрания. »;
• в вводной части текста указывают количество участников события и основные реквизиты протокола;
• указывается не только суть вопроса, но и его номер (пункт), под которым он фигурирует в основном документе;
• составитель — тот, кто подписывает выписку из протокола общего собрания, после текста пишет фразу «Выписка верна», расшифровывает свою подпись, должность и также указывает дату составления;
• подпись составителя и верификация дополняются печатью организации.

В документах для внутреннего пользования заверить документ может секретарь, а вот копия для внешних организаций заверяется обязательно руководством.

Копии выписок имеют разный срок хранения. В зависимости от важности затронутых во время заседания вопросов, они могут храниться от 5 до 75 лет (пункты 415 и 656 перечня, утвержденного Приказом Минкультуры России от 25.08.2010 № 558).

Выписка из протокола заседания комиссии – документ, который может потребоваться в самых разных случаях.

Что такое протокол заседания комиссии

На предприятиях и в организациях работа всевозможных комиссий не такое уж и редкое явление. Обычно в состав комиссий включается несколько сотрудников компании, которые профессионально решают поставленные перед ними задачи. Комиссии бывают учредительные, аттестационные, приемочные, инвентаризационные, они собираются по поводу конференций, семинаров и т.д. При этом работа любой комиссии обязательно фиксируется в специальном протоколе. В него заносятся сведения о том, кто входит в комиссию, какие цели перед участниками были поставлены, каким образом они были достигнуты и решение комиссии.

Виды протоколов

Протоколы условно можно поделить на два типа. К первому относятся краткие протоколы – они обычно применяются для регистрации работы комиссий, созванных в оперативном порядке, в том числе и незапланированных заранее. В них вносится только та информация, которая касается обсуждаемых вопросов, мнения участников и общего решения. А вот в полных протоколах сведения более объемны. В них вписываются не только основные данные, но и вся процедура заседания, включая подробное обсуждение, реплики, мнения, ход голосования, итоги. На таких заседаниях с полным протоколом всегда есть председатель, который им руководит и секретарь, который во всех деталях фиксирует происходящее. Иногда полный протокол может достигать нескольких страниц.

Зачем делать выписку

Зачастую информация, содержащаяся в протоколах, отражает секретные моменты текущей деятельности фирмы и не предназначена для широкой аудитории. Выписка помогает решить эту проблему.

С ее помощью заинтересованные лица получают нужные им данные, а конфиденциальность протокола сохраняется. Также выписка целесообразна при чрезмерно большом объеме протокола. Как правило, речь в выписке идет только о каком-то конкретном принятом решении.

Если говорить о практике, которая имеет широчайшее распространение, то выписки из протоколов заседаний помогают руководству компаний осуществлять деятельность по организации работы своих предприятий, контролировать работу производств, регулировать выполнение распоряжений, приказов (иногда выписки даже являются своего рода их заменителем) и т.д.

При помощи выписок государственные надзорные ведомства, контрагенты, банковские кредитные учреждения своевременно информируются о деятельности фирмы.

Чем отличаются выписка и копия

Некоторые работники организаций ошибочно полагают, что копия и выписка – это одно и то же. Это не совсем так. Между ними есть принципиальное отличие: копия – это абсолютно идентичный оригиналу документ, который делается обычно при помощи копировальной техники. Выписка же – это только некоторая часть оригинала и достаточно часто формируется она от руки (когда из документа берутся только те куски текста, которые требуются в каком-то конкретном случае).

Кто делает выписку

Выписку обычно делает сотрудник предприятия, в чьем ведении находится работа с протоколами, в том числе по их сохранению (это может быть секретарь, юрист или сам руководитель организации).

При этом выписка обязательно должна быть заверена уполномоченным на этом работником компании. Также на выписке должна стоять печать (если компания применяет штампы для визирования бумаг).

Как получить выписку

Чтобы получить требуемую выписку от заинтересованного лица, должен поступить соответствующий запрос или заявление в письменном виде с обозначением причин, по которым ему нужен данный документ и указанием учреждения, для предоставления в которое он понадобился.

Образец выписки из протокола заседания комиссии

При необходимости сделать выписку, посмотрите ее пример – с его помощью вы без труда сделаете то, что вам нужно.

1. В начале документа обязательно напишите наименование организации, также укажите состав комиссии, отметьте повестку дня.
2. Далее выпишите те данные из хода заседания, которые касаются заинтересованного лица и обязательно – решение комиссии.
3. После этого, в конце документа поставьте надпись «Верно» или «Выписка верна», подпишите и датируйте бланк.

образец по трудовому коллективу и ООО, реквизиты

Общее собрание участников проводится юридическими организациями, которые основаны на участии в них других людей. Именно эти собрания и становятся своеобразным высшим органом управления. Компетенция этого органа определяется уставами и положениями. Среди важных документов и выписки из протоколов.

О порядке проведения собраний

Общие собрания проводятся для того, чтобы принять решение по важным вопросам, которые касаются всех:

• Назначение проверки, аудиторского или ревизионного характера.
• Утверждение отчёта за целый год.
• Выборы в органы управления, образование исполнительных органов.
• Принятие участия в образовании других юридических лиц.
• Утверждение Устава, либо изменение.
• Ликвидация ООО, создание или реорганизация.

Обычно собрания организуются собственниками ООО. Или группой участников, которых не менее определённого процента от других участников, согласно учредительным документам. Устав и законодательство, регулирующее деятельность общества – главные документы, на которые надо опираться при проведении собраний.

Уведомление с информацией о дате и времени проведения заблаговременно отправляется каждому из участников.

Кто такие индоутки и как превратить их разведение в свой бизнес, вы узнаете по ссылке.

Правила создания протокола

Отдельно во время проведения собраний выбирают секретаря, который ведёт протокол.

В протоколе отражается ход ведения собрания. А так же – выступления участников вместе с прениями, обсуждениями вопросов на повестке, голосованием и результатами. Принятые решения так же описываются как можно точнее.

1. О дате, когда собрание началось и закончилось, пишут в вводной части. Здесь пишут о количестве лиц, принявших участие. И процентное отношение тех, кто был на собрании к общему количеству участников. Обязательно указывается наличие или отсутствие кворума. И информация о вопросах, поставленных на повестку.
2. Основная часть посвящена последовательности решения каждого вопроса. Запись по ним может быть краткой, либо иметь полную форму.

Официальный протокол в полной форме составляется только после того, как собрание было проведено. Его основа – записи, составленные секретарём. На изготовление документа уходит не больше 3-5 дней. Председательствующий и секретарь обязательно ставят свои подписи на документе.

Что такое форма Р26001 и зачем она вам может понадобиться? Всю информацию вы найдете тут.

Он хранится вместе с другими бумагами, которые касаются собрания. Принятое решение могут признать недействительным, если протокол составлен не по правилам действующего законодательства.

Можно организовать заочное голосование, не приглашая всех членов общества. Тогда уведомления направляются не только о проведении собрания, но и о решениях, которые были приняты.

Для проведения голосования участники организации должны заполнить опросные листки на протяжении некоторого срока.

Протокол составляется после подсчёта голосов в этих документах. Нотариальное удостоверение принятых решений предусмотрено только для форм собственности вроде ООО и АО.

Что такое выписки, зачем они нужны?

Выписка из протоколов представляет собой точную копию самого протокола. Только не полностью, а конкретной его части, отдельного вопроса. По первому требованию выписку выдают участникам за срок, обычно не превышающий семи дней.

Живете в деревне и хотите заняться разведением животных, чтобы это еще и приносило стабильный доход? Статья Разведение цесарок, как бизнес: что нужно знать? расскажет, как это сделать.

Выписка не равна ксерокопии, она является отдельным документом. Составляется она в том же порядке, что и сам протокол.

Составляем выписку из собрания трудового коллектива

В данном случае существует всего несколько правил заполнения выписки из собрания трудового коллектива.

• Сначала дают название самому документу.
• Потом вставляют вводную часть из самого протокола.
• Далее идёт отдельный пункт, процитированный из общей повестки.
• Основной текст выписки формируется копированием необходимого отрывка в основном документе.
• Важны ссылки на лиц, подписавших договор. И их должности.
• Последний этап – заверение документа.

При проведении общего собрания ООО

Здесь так же используются фрагменты, которые присутствовали в самом протоколе.

Основные принципы составления будут такими.

1. Начинают с оформления заголовка.
2. Копируются все реквизиты, перечисленные в протоколе.
3. Далее пишут о количестве тех, кто принял участие в собрании.
4. Переходят к копированию пункта протокола, интересующего посылавшего запрос.
5. Далее идёт основная часть обсуждения по тому или иному вопросу.
6. Следующий – пункт, касающийся принятого решения.
7. Ссылка на лиц, заполнивших протокол.
8. Заверение документа лицом с соответствующими полномочиями.

Становитесь ИП, значит вам надо зарегистрироваться, а как это сделать? Ответы вы найдете в этой статье.

При проведении собрания акционеров

Здесь правила остаются теми же. Выписка играет просто роль копии какой-либо части основного документа. Но не всего целиком, а отдельной его части. И сама выписка оформляется отдельно.

Образец выписки из протокола можно скачать тут.

Обязательно наличие вводной части, включая описание повестки дня. Только после этого идёт дословное содержание абзацев, интересующих заявителя в той или иной ситуации. Обязательным становится наличие информации о том, где и когда проводилось собрание.

Как быть некоммерческим организациям?

И здесь правила остаются почти одинаковыми. Начинается всё с вводной части, после которой идёт основная. В этой основной части перечисляют вопросы из повестки дня.

Обязательно надо указать о том, каким образом проводится голосование.

Где и как, с использованием каких материалов. Можно полностью скопировать то, что было написано в самом протоколе. Некоммерческая организация так же должна указать своё название, в полной форме.

Кто несёт ответственность за подписание документа?

Для выписок не требуется заверения со стороны лиц, подписавших основной документ. Достаточно наличия подписи секретаря, ответственного за ведение записей.

Как заполнить и получить больничный лист, вы узнаете здесь.

Реквизит «Отметка о заверении копии» позволит наделить бумагу юридической силой. Подпись ставится вручную. Надо написать о том, что вся информация указана в документе верно, без ошибок. Подпись руководителя вместе с печатью организации нужна лишь в том случае, если выписку предоставляют специалистам в сторонних компаниях.

Заключение и дополнительные советы

По своей сути, любые выписки являются внутренними документами. Они дадут возможность для сохранения конфиденциальности по остальным вопросам, которые рассматриваются в ходе собрания, но не интересуют конкретного заявителя.

Для документа не существует унифицированной формы, на каждом предприятии разрабатывают свою собственную. Главное – соблюдать общие требования, указанные в законодательстве.

Разъяснения и дополнения в выписках отсутствуют. Они должны быть посвящены только одному конкретному вопросу. Только в этом случае документ можно заверить и сделать так, чтобы он обладал юридической силой.

Наняли экономиста, а теперь столкнулись с необходимостью составления должностной инструкции? Как это правильно сделать и что должен в себя включать такой документ, вы узнаете по ссылке.

Для получения выписок на предприятиях рекомендуется обратиться к секретарю. Именно они отвечают за оформление, заверение документов. Иногда за оформление отвечают другие службы, если должность секретаря не оформлена соответствующим образом.

Главное, чтобы у них были полномочия по составлению и хранению отчётной документации. Например, это может быть отдел кадров.

Сами протоколы хранятся в зависимости от того, как ведётся делопроизводство на том или ином предприятии. Один из самых удобных способов – централизованный, когда за хранение отвечает секретарь, либо отдел кадров.

Подробнее о протоколе собрания учредителей вы узнаете в этом видео: 

Протоколы заседаний — Студенческий совет — Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики»

2020

Протокол № 81 заседания от 17 января 2019

2019

Протокол № 80 заседания от 17 октября 2019

Протокол №79 заседания от 10 сентября 2019

Протокол №78 заседания от 24 мая 2019

Протокол №77 заседания от 14 мая 2019

Протокол №76 заседания от 9 апреля 2019

2017

Протокол № 60 заседания от 23 ноября 2017.docx 

2016

 Протокол №31 заседания от 30 декабря 2016 (PDF, 123 Кб)

 Выписка из протокола №29 заседания от 22 декабря 2016 (PDF, 109 Кб)

 Протокол №28 заседания от 11 декабря 2016 (PDF, 130 Кб)

 Протокол №27 заседания от 9 декабря 2016 (PDF, 130 Кб)

 Протокол №25 заседания от 11 ноября 2016 (PDF, 114 Кб) 

 Протокол №24 заседания от 29 октября 2016 (PDF, 118 Кб)

 Протокол №23 заседания от 17 октября 2016 (PDF, 102 Кб)

 Протокол №22 заседания от 13 сентября 2016 (PDF, 265 Кб)

 Протокол №21 заседания от 9 сентября 2016 (PDF, 191 Кб)

 Протокол №20 заседания от 4 сентября 2016 (PDF, 200 Кб)

 Протокол №19 заседания от 3 августа 2016 (PDF, 190 Кб)

 Протокол №18 заседания от 9 июля 2016 (PDF, 193 Кб)

 Протокол №17 заседания от 4 июля 2016 (PDF, 199 Кб)

 Протокол №16 заседания от 2 июля 2016 (PDF, 189 Кб)

 Протокол №15 заседания от 23 июня 2016 (PDF, 192 Кб)

 Протокол №14 заседания от 22 июня 2016 (PDF, 190 Кб)

 Протокол №13 заседания от 15 июня 2016 (PDF, 378 Кб)

 Приложение 1. Отчёт о работе за январь-июнь 2016 (PDF, 505 Кб)

 Приложение 2. План работы на июль-декабрь 2016 (PDF, 157 Кб)

 Протокол №12 заседания от 5 июня 2016 (PDF, 203 Кб)

 Протокол №11 заседания от 2 июня 2016 (PDF, 192 Кб)

 Протокол №10 заседания от 24 мая 2016 (PDF, 358 Кб)

 Приложение. Концепция информационной политики Студенческого совета ФСН (PDF, 188 Кб)

 Протокол №9 заседания от 13 апреля 2016 (PDF, 343 Кб)

 Протокол №8 заседания от 27 марта 2016 (PDF, 201 Кб)

 Приложение (PDF, 124 Кб)

 Протокол №7 заседания от 16 марта 2016 (PDF, 363 Кб)

 Приложение 1. Регламент работы студсовета ФСН (PDF, 305 Кб)

 Приложение 2. Заключение Правового комитета Студсовета НИУ ВШЭ (PDF, 104 Кб)

 Протокол №6 заседания от 17 февраля 2016 (PDF, 236 Кб)

 Протокол №5 совместного заседания с администрацией от 10 февраля 2016 (PDF, 359 Кб)

 Протокол №4 заседания от 29 января 2016 (PDF, 245 Кб)

2015

 Протокол №3 заседания от 26 декабря 2015 (PDF, 279 Кб)

 Протокол №2 заседания от 15 декабря 2015 (PDF, 141 Кб)

 Протокол №1 заседания от 9 декабря 2015 (PDF, 270 Кб)

Выписка из протокола о назначении директора образец

выписка из протокола о назначении директора образец

Выписка из протокола родительского собрания на тему «Адаптация учащихся 1 класса» ( с вопросом о Критериальном оценивании учащихся)

Выписка из протокола №2 родительского собрания в 1 классе

на тему «Проблема адаптации первоклассников»

Присутствовали: 10

Отсутствовали: —

Повестка дня

1. Доклад «Проблема адаптации первоклассников» (Классный руководитель Калиева К.И.)

2. Ознакомление родителей с методикой критериального оценивания в обновленном содержании образования. (Школьный координатор Белая С.В.)

3. Разное.

Школьный координатор Белая С.В. начала встречу с психологического настроя. Прошло разделение родителей на группы.

На втором этапе при определении темы занятий она провела тренинг «Нарисуйте медведя». После подсчета баллов по предложенным критериям, родители пришли к выводу, что эффективность выполнения работы зависит от знания критериев оценивания.

Педагог познакомила родителей с основными понятиями: «оценивание», «критериальное оценивание», «формативное оценивание», «суммативное оценивание», «дескрипторы», «рубрика», «рубрикаторы». Главной целью критериального оценивания является получение объективной информации о результатах обучения обучающихся на основе критериев оценивания и предоставление ее всем заинтересованным участникам для дальнейшего совершенствования учебного процесса.

При подаче материала она демонстрировала на ноутбуке и на бумаге образцы формативного оценивания и суммативного оценивания, чтобы родители наглядно видели, как строится работа учителя по оцениванию учащихся, а также показала документ в помощь: «Критериальное оценивание для родителей»

Особое внимание координатор уделила формативному оцениванию, которое проводится ежедневно в индивидуальной, парной и групповой работе как устно, так и письменно.

Родители должны знакомиться с результатами выполненных учащимися работ, отслеживая уровень знаний и понимания детьми учебных программ.

Выступили родители:

Гельманова О.А. – мама Калиевой Даны. Обновленные программы тяжело даются моему ребенку, она испытывает трудности в запоминании и понимании материала. Нас пугает то, что при суммативном оценивании итоги будет подсчитывать электронный журнал, а не учитель. Необходимо покупать компьютеры, планшеты, чтобы помогать детям в подготовке проектов, исследовательских работ.

Гельманова Н.И. – бабушка Калиевой Снежаны. Мы с внучкой дома занимаемся, что-то дается ей легко, что-то с трудом. Дети пришли не совсем готовыми к такой системе, но по истечению 1 четверти заметен прогресс, хотя надо еще с ними работать, потому что программа сложная.

В конце встречи с родителями были подведены итоги и сделаны выводы.

Школьный координатор довела до сведения родителей, что по вопросам критериального, формативного и суммативного оценивания необходимо будет обращаться к ней.

Постановили:

Родителям принять к сведению методику критериального оценивания в обновленном содержании образования.

Родителям сотрудничать с учителями-предметниками, классным руководителем и школьным координатором в течение всего учебного года.

Председатель родительского комитета: Белая Н.Я.

Секретарь: Гельманова О.А.

Классный руководитель: Калиева К.И.

Школьный координатор: Белая С.В.

Адрес публикации: https://www.prodlenka.org/metodicheskie-razrabotki/235840-vypiska-iz-protokola-roditelskogo-sobranija-n

для реализации системы бесклеточной экспрессии TX-TL на основе Escherichia coli для синтетической биологии

Мы представили пятидневный протокол для приготовления эндогенной системы бесклеточной экспрессии TX-TL на основе Escherichia coli . Пример временной шкалы для создания реагентов — неочищенного клеточного экстракта и буфера — можно найти на Рис. 1 . После создания они могут храниться при -80 ° C до одного года. После создания реагентов установка и выполнение эксперимента могут быть выполнены менее чем за 8 часов.

Кроме того, мы оптимизировали условия экспрессии системы бесклеточной экспрессии TX-TL. Другие добавки, поставляемые пользователем, такие как буферы или растворы ДНК, должны быть предварительно откалиброваны на токсичность. Например, разные методы обработки плазмид приводят к разной экспрессии из-за содержания соли. Мы также проверили влияние буфера для элюции Tris-Cl на эффективность реакции (, рис. 5, ).

Пример калибровки неочищенного экстракта клеток, относящийся к шагу 4.1–4,9, показано на Рис. 4a . В целом, наши эксперименты показывают, что неочищенный клеточный экстракт наиболее чувствителен к уровням Mg-глутамата, за которым следуют уровни K-глутамата. Чтобы продемонстрировать бесклеточную систему экспрессии, мы сконструировали и протестировали петлю отрицательной обратной связи на основе репрессии tet . ²⁶ ( рисунок 6 ). В системе бесклеточной экспрессии та же схема, работающая с aTc и без нее, показывает 7-кратное изменение конечной точки экспрессии репортера deGFP после восьми часов экспрессии.Хотя для этого эксперимента не требуются глобальные индукторы или репрессоры, при необходимости они могут быть добавлены в разделе «Приготовление основной смеси».

Рис. 1. График времени для неочищенного клеточного экстракта, раствора аминокислоты и приготовления энергетического раствора. Пятидневный график для типичного выполнения протокола приведен выше, оптимизированный для ночных инкубаций и дневных рабочих этапов.

Рис. 2. Анализ стоимости и экспрессии конкурирующих неочищенных клеточных экстрактов.a) Структура затрат на рабочую силу и материалы для бесклеточной экспрессионной системы TX-TL. На основе стоимости реагентов по состоянию на декабрь 2012 г. и затрат на рабочую силу в размере 14 долларов США в час. b) Сравнение стоимости бесклеточной экспрессионной системы TX-TL и других коммерческих систем. Стоимость указана в расчете на мкл, хотя объемы реакции могут варьироваться в зависимости от набора. c) Сравнение выхода бесклеточной экспрессионной системы TX-TL с другими коммерческими системами. Выход экспрессии белка определяется стандартами производителя.Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.

Рис. 3. Нагрузка и обработка бисерной трубки. а) Демонстрация правильной вязкости раствора ячеек-бус. Раствор клеточных гранул будет иметь вязкость, зависящую от многих факторов, включая количество добавленного буфера S30A, количество добавленных гранул и время, проведенное на льду. b) Загрузка пробирки для взбивания шариков перед быстрым настольным центрифугированием. Центрифугирование удаляет пузырьки, скопившиеся во время загрузки. c) Всплытие пузырьков после настольного центрифугирования.Размер пузырей может быть разным; их можно вытащить или удалить с помощью наконечника пипетки. d) Полностью заполненная трубка для взбивания шариков перед укупоркой. В трубке для взбивания шариков образуется мениск, и колпачок имеет достаточно, чтобы покрыть и вызвать переполнение небольших количеств. д) Правильно загруженный фильтрующий аппарат. Их можно использовать повторно. f) Сравнение правильно обработанной и неправильно обработанной трубки для взбивания шариков. Пробирка слева — это пробирка с хорошим биением — она ​​имеет небольшой и хорошо очерченный верхний слой и очень прозрачный супернатант.Пробирка справа неоптимальна, исходя из более крупного мутного второго слоя и мутного супернатанта. Неоптимальные трубки не должны подвергаться дополнительной обработке.

Рисунок 4. Свойства препаратов сырого экстракта. а) Типичные калибровочные графики для неочищенного клеточного экстракта. Неочищенный экстракт калибруется для дополнительных уровней Mg-глутамата, K-глутамата и DTT в указанном порядке. Показана конечная флуоресценция через 8 часов, а также максимальная скорость продукции белка на основе 12-минутного скользящего среднего.На основании этих графиков приемлемый диапазон дополнительного количества Mg-глутамата составляет 4 мМ, K-глутамата составляет 60-80 мМ, а DTT составляет 0-3 мМ. Обратите внимание, что каждый неочищенный экстракт необходимо калибровать независимо по этим трем переменным. б) Варианты приготовления экстрактов. Показана конечная флуоресценция двух сырых экстрактов, приготовленных в разные даты; планки погрешностей — это 1 стандартное отклонение от трех независимых прогонов в разные дни. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.

Рисунок 5.Влияние раствора ДНК на эффективность экспрессии. а) Сравнение двух различных методов очистки плазмид. 1 нМ pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 получают с использованием только набора QiaPrep Spin Miniprep (метод очистки 1) или после обработки с помощью набора для очистки QiaQuick PCR (метод очистки 2). Показана конечная флуоресценция через 8 часов, а также максимальная скорость продукции белка на основе 12-минутного скользящего среднего. Планки погрешностей — это 1 стандартное отклонение от четырех независимых прогонов в разные дни. b) Эффект элюирующего буфера (Трис-Cl). Различные концентрации Трис-Cl сравнивают в реакции внеклеточной экспрессии на основе экспрессии 1 нМ pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Приведенные концентрации представляют собой конечные концентрации Трис-Cl в реакции; Используемый буфер для элюции представляет собой 10 мМ Tris-Cl. Планки погрешностей — это 1 стандартное отклонение от трех независимых прогонов в разные дни. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.

Рис. 6. Пример выполнения TX-TL контура отрицательной обратной связи.а) Пример настройки бесклеточной реакции исполнения. Проверяет состояние «включено» и «выключено» цепи отрицательной обратной связи с положительным и отрицательным контролями. б) Плазмидная карта петли отрицательной обратной связи. c) Репрезентативные результаты. Данные отражают эксперимент в а) и б) с отрицательным контролем, вычтенным из сигнала. Генетическая схема показана на вставке. Планки погрешностей — это 1 стандартное отклонение от трех независимых прогонов в разные дни. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.

Таблица 1.Реагенты для 1 дня протокола сырого экстракта клеток.

Таблица 2. Реагенты для 2-го дня протокола сырого экстракта клеток.

Таблица 3. Буфер S30A и калькулятор массы шариков для дня 3 протокола экстракции сырых клеток.

Таблица 4. Реагенты для подготовки к протоколу Energy Solution.

Дополнительные материалы 1.Рецепты предметов.

Хлорамфеникол, 34 мг / мл: Приготовьте 0,51 г хлорамфеникола и добавьте этанол до 15 мл. Стерилизовать фильтрованием (0,22 мкМ), аликвотировать в пробирки по 1 мл, хранить при -20 ° C для дальнейшего использования.

Планшет с агаром 2xYT + P + Cm: Приготовьте 1,24 г 2xYT, 1,6 мл раствора двухосновного фосфата калия @ 1 M, 0,88 мл раствора одноосновного фосфата калия @ 1 M, 0,6 г агара и воды до 40 мл. Автоклав. Дать остыть до 50 ° C и добавить 40 мкл Cm. Разлить по 25 мл в чашку Петри размером 100 x 15 мм и дать остыть в течение часа.

Среда 2xYT + P: Приготовьте 124 г 2xYT, 160 мл раствора двухосновного фосфата калия @ 1 M, 88 мл одноосновного раствора фосфата калия @ 1 M и воду до 4 л. Разложите аликвоты в 2 x 1,88 л и 0,24 л. Автоклав.

Трис-основа, 2 M: Приготовьте 60,57 г Трис-основы и воды до 250 мл. Стерилизовать, хранить при комнатной температуре для дальнейшего использования.

DTT, 1 M: Приготовьте 2,31 г DTT и воды до 15 мл. Стерилизовать фильтрованием (0,22 мкМ), аликвотировать в пробирки по 1 мл, хранить при -20 ° C для дальнейшего использования.

Буфер S30A: Приготовьте 10,88 г Mg-глутамата и 24,39 г K-глутамата, 50 мл 2M триса, уксусную кислоту (до pH 7,7) и воду до 2 л. Автоклав, храните при 4 ° C, добавьте 4 мл. 1 M DTT перед использованием.

Буфер S30B: Приготовьте 10,88 г Mg-глутамата и 24,39 г K-глутамата, трис при 2 M (до pH 8,2) и воду до 2 л. Автоклав, храните при 4 ° C, добавьте 2 мл 1 M DTT перед использовать.

HEPES: Приготовьте 1,91 г HEPES (MW 238,21), КОН (до pH 8) и воду до 4 мл.

тРНК: Подготовьте 30 мг тРНК и воду до 600 мкл.

КоА: Приготовьте 30 мг КоА (молекулярная масса 767,53) и воду до 600 мкл.

NAD: Добавьте 34,83 ​​мг NAD (молекулярная масса 663,43), 2 M трис (до pH 7,5-8) и воду до 300 мкл. (Добавьте 27 мкл триса в концентрации 2 M, чтобы довести pH раствора до 7,5-8).

цАМФ: Добавить 42,80 мг цАМФ (MW 329,22), трис 2 М (до рН 8) и воду до 200 мкл. (Добавьте 73 мкл триса в концентрации 2 M, чтобы довести раствор до pH 8).

Фолиновая кислота (33,9 мМ): К 20 мг твердой кальциевой соли фолиновой кислоты (MW 511,5) добавьте 1,15 мл воды.

Спермидин: Приготовьте 23,55 мкл спермидина (молекулярная масса 145,25) и воду до 150 мкл. Приготовьте при комнатной температуре после кратковременного плавления при 37 ° C.
3-PGA: Добавьте 1,03 г 3-PGA (MW 230,02), 2 M трис (до pH 7,5) и воду до 3,2 мл. (Добавьте 1,73 мл 2 M триса, чтобы довести pH раствора до 7,5).

Смесь нуклеотидов: Добавить 145 мг дигидрата дикалиевой соли АТФ (MW 619.4), 133 мг динатриевой соли GTP (MW 567,14), 79,4 мг дигидрата динатриевой соли CTP (MW 563,16), 82,6 мг дигидрата тринатриевой соли UTP (MW 586,12), КОН при 15% разбавлении (до pH 7,5) и вода до 1,5 мл. (Добавьте 353 мкл КОН при 15% разбавлении, чтобы довести раствор до pH 7,5).

Дополнительные материалы 2. Анализ Брэдфорда.

1. Удалите средство Брэдфорда с 4 ° C и поставьте при комнатной температуре.
2. Приготовьте 50 мкл стандарта BSA с концентрацией 1 мг / мл и 0,1 мг / мл.
3. Приготовьте 40 мкл 20-кратного разведения экстракта из шага 1.47.
4. Добавьте 800 мкл воды в 7 кювет.
5. Приготовьте стандартные кюветы для 0 мг / мл, 1 мг / мл (10 мкл 0,1 мг / мл BSA), 2 мг / мл (20 мкл 0,1 мг / мл BSA), 4 мг / мл (4 мкл 1 мг / мл BSA ), 6 мг / мл (6 мкл 1 мг / мл BSA).
6. Приготовьте экспериментальные кюветы для 2 мкл образца и 4 мкл образца.
7. Добавьте 200 мкл агента Брэдфорда в каждую кювету и хорошо перемешайте пипетированием. Инкубируйте при комнатной температуре не менее 10 мин.
8. Получите стандартную кривую при OD 595 нм, используя кюветы из шага 6.5. Отклонить стандартную кривую, если r ² <0,95.
9. Определите концентрацию экстракта при OD 595 нм, используя кюветы из шага 6.6.

Дополнительный материал 3. Таблица калибровки буфера.

См. TXTL_e (шаблон) _calibration_JoVE.xlsx.

Дополнительные материалы 4. Таблица бесклеточного прогона выражений.

См. TXTL _JoVE.xlsx.

Протоколы для реализации системы бесклеточной экспрессии TX-TL на основе Escherichia coli для синтетической биологии

J Vis Exp.2013; (79): 50762.

Zachary Z. Sun

¹ Департамент биологии Калифорнийского технологического института

Клармира А. Хейс

² Департамент биоинженерии Калифорнийского технологического института

Jonghyeon Shin

³ Центр синтетической биологии , Департамент биоинженерии, Массачусетский технологический институт

Филиппо Кашера

⁴ Школа физики и астрономии Миннесотского университета

Ричард М.Мюррей

² Департамент биоинженерии Калифорнийского технологического института

Винсент Нуаро

⁴ Школа физики и астрономии Миннесотского университета

¹ Биологический факультет Калифорнийского технологического института

² Департамент биоинженерии, Калифорнийский технологический институт

³ Центр синтетической биологии, Департамент биоинженерии, Массачусетский технологический институт

⁴ Школа физики и астрономии, Университет Миннесоты

^# Участвовал в равной степени.

Abstract

Идеальные бесклеточные экспрессирующие системы теоретически могут имитировать клеточную среду in vivo на контролируемой платформе in vitro . ¹ Это полезно для контролируемой экспрессии белков и генетических цепей, а также для создания прототипов среды для синтетической биологии. ^2,3 Для достижения последней цели бесклеточные системы экспрессии, которые сохраняют эндогенные механизмы транскрипции-трансляции Escherichia coli, способны более точно отражать in vivo клеточную динамику, чем системы, основанные на транскрипции РНК-полимеразы Т7.Мы описываем подготовку и выполнение эффективной эндогенной системы бесклеточной экспрессии на основе транскрипции-трансляции (TX-TL) E. coli , которая может производить эквивалентные количества белка, как системы на основе T7, при 98% снижении затрат по сравнению с аналогичными коммерческими системами. системы. ^4,5 Описано приготовление буферов и неочищенного клеточного экстракта, а также проведение реакции TX-TL в трех пробирках. Подготовка всего протокола занимает пять дней и дает достаточно материала для до 3000 отдельных реакций в одном препарате.После подготовки каждая реакция занимает менее 8 часов от настройки до сбора и анализа данных. Могут быть дополнены механизмы регуляции и транскрипции, экзогенные для E. coli , такие как репрессоры lac / tet и РНК-полимераза T7. ⁶ Эндогенные свойства, такие как скорость деградации мРНК и ДНК, также можно регулировать. ⁷ Система бесклеточной экспрессии TX-TL была продемонстрирована для крупномасштабной сборки цепей, изучения биологических явлений и экспрессии белков как под Т7-, так и под эндогенными промоторами. ^6,8 Имеются сопутствующие математические модели. ^9,10 Полученная система имеет уникальные применения в синтетической биологии в качестве среды для создания прототипов или «биомолекулярного макета TX-TL».

Ключевые слова: Клеточная биология, выпуск 79, биоинженерия, синтетическая биология, химические методы, синтетический, молекулярная биология, теория контроля, TX-TL, бесклеточная экспрессия, in vitro, транскрипция-трансляция, бесклеточный синтез белка, синтетическая биология, системная биология, экстракт клеток Escherichia coli, биологические схемы, биомолекулярный макет

Введение

Технология бесклеточной экспрессии началась в 1950-х годах как чисто трансляционная, а годы спустя она развивалась и охватывала связанные механизмы транскрипции-трансляции с использованием ДНК бактериофага Т7. ^11,12 С тех пор были предприняты многочисленные усилия по оптимизации создания неочищенного клеточного экстракта (или экстракта E. coli S30). ^13,14 Эти оптимизации включают продление внеклеточного синтеза белка за счет регенерации АТФ или модификаций штаммов, а также сокращение времени и стоимости протокола. ^15-17 Существуют альтернативные бесклеточные системы экспрессии, в которых для экспрессии используются восстановленные компоненты вместо сырого клеточного экстракта. ⁵ Как неочищенный клеточный экстракт, так и методы восстановления были разработаны для коммерческого использования.

С появлением синтетической биологии возросла потребность в хорошо охарактеризованной платформе для тестирования и выражения сконструированных биологических модулей и схем. ^18,19 Эта платформа должна быть универсальной, хорошо охарактеризованной, простой в использовании и ориентированной на компоненты, предоставляемые пользователем. Несмотря на то, что они были разработаны полвека назад, бесклеточные системы на основе E. coli по сути разделяют эти требования, поскольку они представляют собой упрощенное представление in vitro клеточных процессов без сложности роста и метаболизма.Кроме того, все фундаментальные знания из in vivo работают с E. coli , легко применимы к бесклеточным системам E. coli .

Хотя бесклеточные системы экспрессии могут найти применение в синтетической биологии, на сегодняшний день целью большинства бесклеточных систем экспрессии является максимальное увеличение выхода белков и метаболитов. Это достигается с помощью транскрипции последовательностей бактериофагом Т7, управляемых промоторами Т7. ²⁰ Хотя экспрессия эффективна и надежна, эти системы служат узкоспециализированной цели.Методы регуляции клеток ограничены, матрица ДНК-мишени должна быть переработана, чтобы включить промоторы Т7, а определенные последовательности, такие как рибосомные комплексы, не могут быть транскрибированы и собраны. ^21,22 Существующие бесклеточные системы экспрессии неспособны поддерживать высокие урожаи при сохранении эндогенных регуляторных механизмов, универсальность, необходимая для синтетической биологии.

Мы разработали эндогенную бесклеточную систему экспрессии E. coli , которая сохраняет эффективность экспрессии белка, продемонстрированную предыдущими системами, но добавляет дополнительную гибкость, позволяя экспрессию и регуляцию на основе как эндогенных, так и экзогенных (Т7 или других) механизмов.Описанный здесь протокол изначально основан на Kigawa et al. (2004) и Liu et al. (2005 г.), но имеет значительные модификации. Он использует Mg- и K-глутамат вместо Mg- и K-ацетата для повышения эффективности, удаляет 2-меркаптоэтанол и лизирует клетки с помощью миксера. ^17,23,24 Измельчение бисером предпочтительнее гомогенизации, методов, основанных на давлении, или обработки ультразвуком из-за его более низкой стоимости и сопоставимой производительности с конкурирующими системами. ²³ 3-фосфоглицериновая кислота (3-PGA) используется в качестве источника энергии, поскольку было обнаружено, что она дает более высокий выход белка по сравнению с креатинфосфатом и фосфоенолпируватом. ^4,25 Наша система может производить до 0,75 мг / мл репортерного белка с использованием промотора на основе сигма70 с лямбда-фаговыми операторами или промотора, управляемого Т7, аналогично выходам из других коммерческих систем. ^4,6 Для производства всех необходимых реагентов требуется пять дней ( Рисунок 1 ). Кроме того, он обеспечивает снижение затрат на 98% по сравнению с сопоставимыми коммерческими бесклеточными системами — затраты на материалы составляют 0,11 доллара США на 10 мкл реакции, что с учетом трудозатрат возрастает до 0,26 доллара США (, рисунок 2, ).

Протокол

1. Приготовление неочищенного клеточного экстракта

Приготовление неочищенного клеточного экстракта в течение трех дней требует двух человек для эффективного проведения. Функционально протокол состоит из трех частей: рост культуры (шаг 1.1 — шаг 1.11), лизис клеток (шаг 1.12 — шаг 1.37) и извлечение осветления (шаг 1.38 — шаг 1.52). Для удобства он разделен на дни. Идеальный экстракт может продуцировать 0,75 мг / мл deGFP из плазмиды pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene # 40019) и имеет концентрацию неочищенного клеточного экстракта между 27-30 мг / мл белка. ⁴ Однако характеристики экстракта варьируются от партии к партии. В следующем рецепте достаточно примерно для 3000 одиночных реакций (6 мл неочищенного клеточного экстракта). При уменьшении рекомендуется использовать не менее 1/6 приведенных здесь значений. Из-за нехватки времени масштабирование не рекомендуется.

День 1

1. Приготовьте бактериальную культуральную среду, культуральный планшет и добавки к средам, как описано в таблице . См. Рецепты в Supplemental Material 1 .

2. Штамм Streak BL21-Rosetta2 при температуре от -80 ° C на чашку с агаром 2xYT + P + Cm и инкубируйте не менее 15 часов при 37 ° C или до тех пор, пока колонии не станут легко заметными. Примечание. Хлорамфеникол (Cm) используется для отбора плазмиды, кодирующей редкие тРНК в штамме BL21-Rosetta2.

День 2

1. Приготовьте буферы и добавки, как описано в таблице 2 . См. Рецепты в Supplemental Material 1 .

2. Подготовьте и стерилизуйте материалы, необходимые для 3-го дня, включая: 6 колб Эрленмейера по 4 л с крышкой из алюминиевой фольги (автоклавированные), стерильные центрифужные флаконы 4 х 1 л, воронку (автоклавированную), 100 г 0.Стеклянные шарики 1 мм (в автоклаве), 2 стержня для перемешивания (в автоклаве), градуированный цилиндр на 1 и 500 мл (в автоклаве), 2 стакана по 1 л (в автоклаве), шприц на 3 мл с иглами 18 G (стерильные), 2-3 поплавковые буи, 2-3 диализных кассеты 10к MWCO (стерильные), кюветы.

3. Подготовка мини-культуры 1. Добавьте 4 мл среды 2xYT + P и 4 мкл Cm в стерильную пробирку для культивирования на 12 мл и предварительно нагрейте до 37 ° C в течение 30 мин.

4. Засейте мини-культуру 1 колонией из чашки с агаром 2xYT + P + Cm. Инкубируйте при 220 об / мин, 37 ° C в течение 8 часов.

5. Через 7 часов 30 минут приготовьте мини-культуру 2. Добавьте 50 мл среды 2xYT + P и 50 мкл Cm в стерильную колбу Эрленмейера на 250 мл и предварительно нагрейте до 37 ° C в течение 30 минут.

6. Засейте мини-культуру 2 100 мкл мини-культуры 1 и инкубируйте при 220 об / мин, 37 ° C в течение 8 часов.

День 3

1. Взвесьте четыре пустых стерильных 50 мл пробирки Falcon и запишите массу в Таблицу 3 . Охладите трубки Falcon на льду; они будут впоследствии использованы на шаге 1.18.

2. Через 7 часов 30 минут после шага 1.8 приготовьте окончательную бактериальную культуральную среду. Используя стерильный градуированный цилиндр на 1 л, перенесите 660 мл среды 2xYT + P в каждую из шести колб Эрленмейера на 4 л и предварительно нагрейте до 37 ° C в течение 30 мин. Примечание. Для надлежащей аэрации рекомендуются колбы Эрленмейера объемом 4 л или больше.

3. Добавьте 6,6 мл мини-культуры 2 в каждую колбу Эрленмейера на 4 л. Инкубируйте при 220 об / мин, 37 ° C, пока культура не достигнет ОП 1,5–2,0 при 600 нм (соответствует фазе роста в середине логарифма).Периодически проверяйте OD с помощью разведения культуры 1:10 на точность. Этот шаг должен занимать не более 3 часов — 3 часов 45 минут; Быстрый рост и сбор в середине фазы регистрации критически важны для качества экстракта.

4. Сразу после выращивания равномерно перенесите все культуры в четыре центрифужные флаконы объемом 1 л и центрифугируйте при 5000 x g в течение 12 минут при 4 ° C для осаждения бактериальных клеток.

5. Во время центрифугирования завершите приготовление буфера S30A, добавив 4 мл 1 М DTT к 2 л ранее приготовленного S30A.Перемешайте и сохраните буфер на льду.

6. По окончании центрифугирования полностью удалите надосадочную жидкость с шага 1.12 путем декантации и промокания центрифужных бутылок на стерильной бумажной салфетке.

7. Добавьте 200 мл буфера S30A при 4 ° C в каждую из четырех центрифужных бутылей и энергично встряхните бутылки до тех пор, пока осадок полностью не солюбилизируется без оставшихся комков . Центрифугируйте четыре флакона при 5000 g в течение 12 минут при 4 ° C.

8. Полностью удалите супернатант с предыдущего шага путем декантации и промокания центрифужных бутылок на стерильном бумажном полотенце.

9. Повторите шаги 1.15 и 1.16.

10. Добавьте 40 мл буфера S30A при 4 ° C в каждую центрифужную бутыль. Перенести каждую гранулу и комбинацию S30A в охлажденную пробирку Falcon из версии 1.9). Примечание. На этом этапе гранулы перемещаются в контейнер меньшего размера.

11. Центрифугируйте пробирки Falcon при 2000 g в течение 8 минут при 4 ° C. Удалите супернатант путем декантации.

12. Повторно центрифугируйте пробирки Falcon при 2000 g в течение 2 минут при 4 ° C.Полностью удалите пипеткой остаточный супернатант. Держите на льду.

13. Взвесьте четыре пробирки Falcon с гранулами и запишите массу в Table 3 . Рассчитайте массу гранул, необходимый объем буфера S30A и массу необходимых гранул на основе конкретных формул в , Таблица 3 .

14. Правильная загрузка и измельчение гранул имеет решающее значение для получения качественного экстракта и является наиболее сложным этапом. Перед попыткой рекомендуется просмотреть видео.Неспособность избежать пузырьков воздуха и равномерно распределить шарики приведет к неэффективной вытяжке.

15. Добавьте количество буфера S30A, рассчитанное в Таблице 3 , в каждую пробирку Falcon, перемешайте на вортексе до гомогенного состояния и верните в лед.

16. Держа другие пробирки Falcon на льду, периодически добавляйте шарики в одну пробирку Falcon тремя аликвотами, каждая из которых использует 1/3 всех шариков. После добавления каждой аликвоты шариков встряхивают в течение 30 секунд.Поместите трубку Falcon на лед между ступенями вихря и после последнего вихря. После добавления последней аликвоты убедитесь, что гранулы распределены равномерно. Должна образоваться густая паста.

17. Подготовьте наконечник пипетки объемом 5 мл, отрезав конец стерильной бритвой до отверстия 3-4 мм. Набрать пипеткой на 2 мл. Примечание: разные наборы пипеток и наконечники обеспечивают разную мощность всасывания, которой может быть недостаточно для вытягивания и высвобождения густого раствора клеток-шариков; вместо него можно использовать наконечник пипетки объемом 1 мл со снятым концом.

18. Поместите 20 трубок для взбивания шариков на лед.

19. Проверьте высокую вязкость раствора клеточных гранул с помощью модифицированной пипетки. Он должен быть вязким, чтобы не выходить из наконечника пипетки во время выброса. Если слишком вязкий, отрегулируйте наконечник дозатора согласно шагу 1.25. Если гранулы недостаточно вязкие, можно добавлять шарики с шагом ( массы гранул * 0,05 ) до максимальной массы ( масс гранул * 5,1 ). После каждого добавления шариков встряхивайте в течение 30 секунд и возвращайтесь в лед.См. Рисунок 3a для демонстрации вязкости.

20. Удалите раствор клеток-гранул из пробирки Falcon с помощью модифицированной пипетки и перенесите в стерильную пробирку для взбивания шариков, наполнив ее на три четверти раствором клеток-гранул. Очень быстро прокрутите (1 с) на встречной мини-центрифуге, чтобы удалить пузырьки воздуха без перераспределения шариков. См. Рисунки 3b-d для получения неподвижных изображений загрузки трубки для отбивания шариков.

21. Завершите добавление раствора бусинок для образования вогнутого мениска.

22. Добавьте очень маленькую каплю раствора ячеек для шариков на внутреннюю часть колпачка пробирки для взбивания шариков, соблюдая осторожность, чтобы не мешать внешнему выступу колпачка; в противном случае трубка для отбивания бус не закроется в достаточной мере на л. Постучите колпачком по плоской поверхности и убедитесь, что на дне колпачка нет пузырьков воздуха.

23. Закройте трубку для взбивания бус колпачком из предыдущего шага. Рука помощнику для взбивания бус. Если все сделано правильно, крышка должна быть плотно закрыта, пузырьков воздуха не должно быть видно, а небольшое количество (если таковое имеется) раствора для гранулированных ячеек должно переливаться через .Повторите процесс загрузки, если видны пузырьки воздуха или крышка не закрывается полностью.

24. Пробирка Vortex Falcon из шага 1.24 с оставшимся раствором бусинок для обеспечения равномерного распределения бусинок. Повторяйте шаги 1,28–1,31, пока пробирка Falcon не станет пустой; затем повторите шаги 1,24–1,31 для каждой дополнительной трубки Falcon.

25. Выполнить шаги 1,33–1,38 одновременно . Попросите помощника взять заполненные трубочки для взбивания шариков из емкости 1,31 и поместить на лед. После того, как две заполненные пробирки для взбивания бус были собраны и пролежали на льду не менее одной минуты, начинайте взбивание бусин.

26. Взбивайте одну трубку в течение 30 секунд при 46 об / мин. Положите на лед вверх дном на 30 секунд, взбивая другую трубку.

27. Повторите предыдущий шаг так, чтобы каждая заполненная трубка для взбивания шариков взбивалась в течение 1 мин.

28. Повторяйте шаги с 1.33 по 1.35 до тех пор, пока не будут обработаны 8 заполненных пробирок для взбивания шариков (или максимальное количество, которое может вместить центрифуга). Затем сконструируйте фильтрующий аппарат из 15 мл Falcon ( Рисунок 3e ). Добавьте новый колпачок для взбивания бус, плоской стороной вверх, на дно 15 мл Falcon.Затем снимите колпачок с обработанной пробирки для взбивания шариков и плотно прижмите колонку для микрохроматографии к концу обработанной пробирки для взбивания шариков до полного закрытия . Отломите конец элюции от колонки для микрохроматографии и поместите колонку для микрохроматографии концом вниз в пустую пробирку с шариками. Поместите этот комплекс в сок 15 мл. Повторите эти действия для всех 8 заполненных трубок для взбивания шариков; по завершении оставьте на льду.

29. Центрифуга с 8 фильтрующими устройствами, пробирка Falcon без крышки, при 6000 g в течение 5 мин при 4 ° C для отделения экстракта и осадка от шариков.

30. Убедитесь, что каждая трубка для взбивания шариков произвела жизнеспособный экстракт . Правильно взбитый экстракт не будет мутным, а гранула будет состоять из двух отдельных слоев. Выбросьте все мутные пробирки и перенесите супернатант из немутных пробирок в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,75 мл, при этом забирает как можно меньше осадка . Держите на льду, пока не будут обработаны все трубки для взбивания шариков. См. Рисунок 3f , сравнивающий правильно обработанную и неправильно обработанную трубку для взбивания шариков.

31. Центрифужные микроцентрифужные пробирки из предыдущего шага при 12000 g в течение 10 минут при 4 ° C.

32. Перенесите супернатант без гранул в пустые пробирки для взбивания шариков с помощью пипетки, объединив 500 мкл в новую пробирку для взбивания шариков.

33. Инкубируйте предыдущий шаг, со снятыми колпачками для взбивания шариков , при 220 об / мин, 37 ° C в течение 80 мин. На этом этапе расщепляются оставшиеся нуклеиновые кислоты с использованием эндогенных экзонуклеаз, высвобождаемых во время процесса нарезания шариков, и его можно выполнить, поставив трубку для взбивания шариков вверх в пробирке для культуры ткани.

34. Подготовьте материалы для диализа. Завершите подготовку буфера S30B, добавив 2 мл 1 M DTT к 2 л ранее приготовленного S30B. Перемешайте и добавьте по 900 мл в каждый из двух стерильных стаканов на 1 л. Добавьте стерильную магнитную мешалку в каждый стакан; хранить при 4 ° C.

35. После шага 1.41 экстракт должен выглядеть мутным . Объедините экстракт в аликвоты по 1,5 мл в микроцентрифужные пробирки объемом 1,75 мл и центрифугируйте при 12000 g в течение 10 мин при 4 ° C.

36. С помощью пипетки объедините супернатант без гранул в 15 мл пробирки Falcon на льду и хорошо перемешайте, закрыв пробирку и перевернув. Сохраните 10 мкл надосадочной жидкости на льду для этапа 1.47 .

37. Определите общее количество полученного экстракта и гидратируйте необходимое количество диализных кассет 10k MWCO путем погружения в S30B на 2 мин, принимая 2,5 мл экстракта на кассету.

38. Загрузите кассеты с 2,5 мл экстракта. Каждый стакан вмещает до 2 кассет; диализуют при перемешивании при 4 ° C в течение 3 часов. Примечание: частичная загрузка кассет допустима. Диализ увеличивает выход протеина.

39. На предыдущем этапе охарактеризуйте концентрацию белка экстракта с помощью анализа Брэдфорда, используя экстракт, сохраненный на этапе 1.44. Подробнее см. Supplemental Material 2 .

40. После завершения диализа аликвоты экстрагируют по 1,5 мл в микроцентрифужные пробирки на 1,75 мл. Центрифуга при 12000 g в течение 10 мин при 4 ° C. На дне пробирки образуется шарик.

41. Собрать прозрачный супернатант с предыдущего шага путем пипетирования в пробирку Falcon на 15 мл на льду.Гомогенизируйте, переворачивая 5-10x.

42. На основании концентрации, определенной Брэдфордом на этапе 1.47, определите количество экстракта для аликвотирования в отдельные пробирки на 1,75 мл. Каждая отдельная пробирка должна иметь объем, содержащий 810–900 мг общего белка. Экстракт должен иметь концентрацию общего белка более 27 мг / мл. Этот шаг требует помощи для целесообразного проведения . Примечание: аликвоты экстракта ниже 30 мг / мл на аликвоты по 30 мкл и масштабирование, если концентрация выше; например, аликвоты экстракта с концентрацией 28 мг / мл на 30 мкл и аликвоты экстракта с концентрацией 32 мг / мл на 28 мкл.1 мкл.

43. Аликвотируйте экстракт после шага 1.50, стараясь не допускать появления пузырьков. Экстракт мгновенного замораживания в жидком азоте. Примечание. Аликвоты с пузырьками можно удалить центрифугированием при 10 000 x g в течение 30 секунд при 4 ° C.

44. Удалите пробирки из жидкого азота с помощью сетчатого фильтра и немедленно храните при -80 ° C. Безопасность: Носите защитные очки; колпачки экстракционных трубок могут оторваться из-за разницы температур между жидким азотом и комнатной температурой .

2. Приготовление аминокислотного раствора

Аминокислотный раствор следует готовить без упаковки. В следующем рецепте используется один полный набор RTS Amino Acid Sampler, которого достаточно для приблизительно 11000 отдельных реакций. При уменьшении рекомендуется использовать не менее половины комплекта. Каждая аминокислота в исходном растворе поставляется в количестве 1,5 мл, 168 мМ, за исключением лейцина в концентрации 140 мМ. Окончательный состав раствора аминокислот: лейцин 5 мМ, все остальные аминокислоты 6 мМ.Это 4-кратная рабочая концентрация.

1. Удалите все 20 аминокислот из -20 ° C и разморозьте при комнатной температуре. После размораживания перемешайте на вортексе до растворения аминокислот, при необходимости инкубируя при 37 ° C. После растворения аминокислот поместите все аминокислоты на лед , за исключением Asn, Phe и Cys, которые хранят при комнатной температуре. Cys не может полностью растворяться .

2. На льду добавьте 12 мл стерильной воды в стерильную пробирку Falcon на 50 мл.

3. Добавить 1.5 мл каждой аминокислоты в следующем порядке , тщательно перемешивая пробирку Falcon после каждого добавления и оставляя раствор на льду: Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys , Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Leu, Cys. Cys может быть добавлен в виде суспензии. После добавления перемешайте на вортексе, пока раствор не станет относительно прозрачным, при необходимости инкубируйте при 37 ° C. Cys не может полностью растворяться .

4. Аликвоты раствора аминокислоты в 50 пробирок по 26 мкл каждая на льду.Остальные аликвоты по 500 мкл на пробирку на льду. Аликвоты по 26 мкл будут использоваться для калибровки экстракта, а аликвоты по 500 мкл будут использоваться для приготовления буфера. При распределении аликвот часто перемешивайте основную массу, чтобы избежать неравномерного распределения суспензии .

5. Аликвоты мгновенно замораживают в жидком азоте и хранят при -80 ° C. Безопасность: Носите защитные очки; колпачки экстракционных трубок могут оторваться из-за разницы температур между жидким азотом и комнатной температурой .

6. Необязательно: Проведите анализ активности свежеприготовленного раствора аминокислот по сравнению с ранее приготовленными растворами аминокислот.

3. Приготовление энергетического раствора

Энергетический раствор используется как для калибровки неочищенного клеточного экстракта, так и для создания буфера, и его следует готовить в больших количествах. По следующему рецепту достаточно примерно для 10000 одиночных реакций. При уменьшении рекомендуется использовать не менее 1/24 приведенных здесь значений. Поскольку энергетическое решение требует значительных денежных затрат, пользователи, впервые использующие его, могут захотеть подготовиться в масштабе 1/24.Конечный состав энергетического раствора: HEPES pH 8 700 мМ, АТФ 21 мМ, GTP 21 мМ, CTP 12,6 мМ, UTP 12,6 мМ, тРНК 2,8 мг / мл, CoA 3,64 мМ, NAD 4,62 мМ, цАМФ 10,5 мМ, фолиновая кислота. 0,95 мМ, спермидин 14 мМ, 3-PGA 420 мМ. Это 14-кратная рабочая концентрация. При желании каждый отдельный элемент в Table 4 можно хранить при -80 ° C для дальнейшего использования.

1. Удалите все химические вещества из Table 4 от -80 ° C, -20 ° C или 4 ° C до комнатной температуры в течение 30 мин.

2. Приготовьте исходные растворы, как описано в Таблице 4 .См. Рецепты в Supplemental Material 1 . После приготовления все растворы поместить на лед.

3. В 15-миллилитровую пробирку Falcon добавьте в следующем порядке , тщательно перемешивая пробирку Falcon после каждого добавления и сохраняя растворы на льду: 3,6 мл 2 M HEPES, 144 мкл воды, 1,39 мл нуклеотида. смесь, 576 мкл 50 мг / мл тРНК, 576 мкл 65 мМ CoA, 276 мкл 175 мМ NAD, 170 мкл 650 мМ цАМФ, 288 мкл 33,9 мМ фолиновой кислоты, 144 мкл 1 M спермидина и 3,09 мл 1,4 M 3-PGA.

4. Аликвотируйте энергетический раствор в 50 пробирок по 7 мкл в каждой на льду.Остальные аликвоты по 150 мкл на пробирку на льду. Аликвоты по 7 мкл будут использоваться для калибровки экстракта, а аликвоты по 150 мкл будут использоваться для приготовления буфера. Во время аликвотирования часто перемешивайте основную массу .

5. Аликвоты мгновенно замораживают в жидком азоте и хранят при -80 ° C. Безопасность: Носите защитные очки; колпачки экстракционных трубок могут оторваться из-за разницы температур между жидким азотом и комнатной температурой .

6. Необязательно: Проведите анализ активности нового энергетического раствора по сравнению с ранее созданным энергетическим раствором.

4. Приготовление буфера

Приготовление буфера требует завершения подготовки экстракта сырых клеток, приготовления раствора аминокислот и приготовления энергетического раствора. Каждый буфер уникален для партии неочищенного клеточного экстракта . В этом разделе оптимизированы Mg-глутамат, K-глутамат и DTT (в указанном порядке) для получения реакций с максимальными уровнями экспрессии. В следующем протоколе используется предварительно написанный шаблон TXTL_e (шаблон) _calibration_JoVE.xlsx ( Supplemental Material 3 ), чтобы откалибровать предварительно приготовленный неочищенный клеточный экстракт и подготовить буфер. Однако можно также откалибровать неочищенный клеточный экстракт и приготовить буфер без матрицы, оптимизировав Mg-глутамат, K-глутамат и DTT вручную и настроив буфер таким образом, чтобы вместе с экстрактом он составлял 75% от общего реакционного объема. При ручной калибровке окончательные условия реакции можно найти на шаге 5.

1. Заполните форму «Общие данные».

2. Размораживание на льду 100 мМ Mg-глутамат (4 ° C), 3 M K-глутамат (4 ° C), 6 мМ раствор аминокислот (26 мкл, -80 ° C), энергетический раствор (7 мкл, -80 ° C), 100 мМ DTT (-20 ° C), положительный контроль ДНК (-20 ° C), 40% PEG-8000 (4 ° C), неочищенный клеточный экстракт (-80 ° C) и вода ( 4 ° С). Примечание: используйте 1 нМ рабочую концентрацию pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (плазмида Addgene 40019) для положительного контроля (возбуждение 485 нм, испускание 525 нм) или другой эталон, который дает высокую интенсивность сигнала. ⁴

3. Приготовьте семь реакций по 10,5 мкл, протестировав диапазон 4–10 мМ дополнительного Mg-глутамата, путем аликвотирования заданных количеств исходного Mg-глутамата в отдельные микроцентрифужные пробирки. Примечание. Хотя изначально готовится 10,5 мкл реакционной смеси, конечная реакционная способность составляет 10 мкл.

4. Приготовьте мастер-микс, как указано в шаблоне в разделе «Калибровка Mg-глутамата», добавив дополнительно 80 мМ K-глутамата. Держите на льду и завихряйте после добавления каждого элемента . Примечание. Значения, приведенные здесь и в шаблоне, являются дополнением к количествам Mg-глутамата, K-глутамата и DTT, присутствующих в буфере S30B, используемом для приготовления неочищенного клеточного экстракта.

5. Добавьте мастер-микс к образцам, содержащим Mg-глутамат, и подготовьте реакции.См. Шаги с 5.10 по 5.13 для получения подробных инструкций.

6. Запустите реакцию при 29 ° C в инкубаторе или планшет-ридере.

7. Определите оптимальную концентрацию Mg-глутамата по уровню конечной экспрессии и максимальной скорости экспрессии белка ( Рисунок 4a ). Примечание. Время работы зависит от эксперимента, но обычно длится менее 8 часов.

8. Повторите шаги с 4.2 по 4.7 для K-глутамата в разделе «Калибровка K-глутамата», установив уровни Mg-глутамата на значения, найденные на этапе 4.7.

9. Повторите шаги с 4.2 по 4.7 для DTT в разделе «Калибровка DTT», установив уровни Mg-глутамата на значения, найденные на шаге 4.7, и уровни K-глутамата на значения, найденные на шаге 4.8. Примечание. Мы обнаружили, что добавление DTT не оказывает значительного влияния на уровни конечной экспрессии.

10. Используйте значения, полученные при калибровке в разделе «Состав буфера», чтобы определить состав буфера, который будет приготовлен. На основе количества произведенного неочищенного клеточного экстракта создается рецепт мастер-микса для заданного количества буферов.

11. Аликвоты разморозить, как указано в рецепте мастер-микса, на льду. После размораживания приготовьте мастер-микс, сохраняя его на льду и встряхивая после добавления каждого элемента .

12. Аликвота по количеству, указанному в разделе «Состав буфера». Буферные пробирки для мгновенного замораживания в жидком азоте. Во время аликвотирования часто перемешивайте основную массу .

13. Удалите пробирки из жидкого азота с помощью сетчатого фильтра и немедленно храните при -80 ° C. Безопасность: Носите защитные очки; колпачки экстракционных трубок могут оторваться из-за разницы температур между жидким азотом и комнатной температурой .

5. Экспериментальное выполнение реакции TX-TL

Конечные условия реакции: 8,9-9,9 мг / мл белка (из неочищенного экстракта), 4,5-10,5 мМ Mg-глутамат, 40-160 мМ K-глутамат. , 0,33-3,33 мМ DTT, 1,5 мМ каждой аминокислоты, кроме лейцина, 1,25 мМ лейцина, 50 мМ HEPES, 1,5 мМ АТФ и GTP, 0,9 мМ CTP и UTP, 0,2 мг / мл тРНК, 0,26 мМ CoA, 0,33 мМ NAD, 0,75 мМ цАМФ, 0,068 мМ фолиновой кислоты, 1 мМ спермидин, 30 мМ 3-PGA, 2% PEG-8000. Основная реакция TX-TL состоит из 3 частей (пробирок): неочищенного клеточного экстракта, буфера и ДНК .Соотношение составляет: 75% буфера и экстракта, 25% ДНК. Реакции могут различаться по объему. , и мы условно используем 10 мкл, чтобы минимизировать объем реакции и позволить запуск в 384-луночном планшете. Большие объемы требуют перемешивания для надлежащей оксигенации. В следующем протоколе используется предварительно написанный шаблон TXTL_JoVE.xlsx ( Supplemental Material 4 ) для проведения реакции объемом 10 мкл. Пункты фиолетового цвета указывают значения, введенные пользователем, а пункты синего цвета указывают на дополнительные реагенты, которые нужно добавить в реакцию .Однако можно также провести реакцию без темплата, следуя условиям реакции, изложенным выше.

1. Заполните форму «Общие данные».

2. В разделе «Приготовление основной смеси» введите процентное значение экстракта из шага 4.1 в фиолетовое поле.

3. Спроектируйте свой эксперимент in silico , используя разделы «Подготовка основной смеси» (строки 10-17) и «Подготовка ДНК» (строки 19-50). Как правило, константы можно поместить в раздел «Подготовка основной смеси», а переменные — в раздел «Подготовка ДНК». Уменьшите количество образцов за эксперимент, чтобы избежать испарения образца и смещения времени начала эксперимента . См. Рисунок 6 для примера установки.

4. В разделе «Приготовление основной смеси» добавьте реагенты, такие как индукторы или белки, которые будут входить во все образцы в постоянной концентрации. Начиная со строки 14, заполните области, заштрихованные синим цветом, оставляя по одному реагенту в каждой строке. Единицы — относительные отношения.

5. В разделе «Подготовка ДНК» добавьте ДНК, которая будет зависеть от образца.Идентификаторы образцов №1 и №2 соответствуют положительному и отрицательному контролю соответственно. Идентификаторы образцов №3 и выше могут быть изменены пользователем для ДНК, исходной концентрации в нг / мкл, длины в парах оснований, желаемой конечной концентрации в нМ и повторов (10 мкл реакций). Количество исходной ДНК для достижения желаемой конечной концентрации рассчитывается автоматически. Сумма по строке составляет 10,5 * n, где n — количество повторов. Примечание. Хотя конечный объем реакции составляет 10 мкл, в расчетах предполагается, что общий объем составляет 10 мкл.5 мкл на реакцию, чтобы учесть потерю объема при дозировании.

6. В разделе «Подготовка ДНК» добавьте реагенты или дополнительную ДНК, которая будет использоваться в синих колонках. Исходные концентрации ДНК в нМ можно рассчитать в разделе «Подготовка ДНК», в то время как реагенты для конкретных образцов требуют ручного расчета на основе общего реакционного объема 10,5 * n. Введенные объемы вычитаются из объема воды той же строки.

7. Удалите необходимое количество пробирок с буфером, неочищенным клеточным экстрактом и положительным контролем в разделе «Пробирки для оттаивания» от -20 ° C или -80 ° C и разморозьте на льду.

8. Подготовьте образцы ДНК. Для каждого идентификатора образца выделите аликвотирование указанной ДНК, воды и предметов, поставляемых пользователем, из раздела «Подготовка ДНК» в микроцентрифужную пробирку при комнатной температуре. Примечание: во избежание потери образца рекомендуется использовать недавно откалиброванные пипетки, наконечники для пипеток с низким прилипанием и микроцентрифужные пробирки.

9. Когда пробирки из шага 5.7 оттаивают, приготовьте мастер-микс, состоящий из буфера, экстракта и любых глобальных элементов, предоставленных пользователем, на основе прямоугольников с оранжевым заштрихованием, хранения на льду и встряхивания после добавления каждого элемента. . Примечание: Экстракт очень вязкий. Аликвоты с пузырьками могут быть удалены центрифугированием при 10 000 x g в течение 30 секунд при 4 ° C.

10. Добавьте количество мастер-микса, указанное в оранжевых ячейках в разделе «Подготовка ДНК» (столбец O), к каждому образцу ДНК и храните при комнатной температуре. Считайте это временем начала реакции .

11. Вортексируйте каждый образец и центрифугируйте при 10 000 x g в течение 30 секунд при комнатной температуре, чтобы удалить остатки образца и уменьшить образование пузырьков.

12. Если реакцию проводят в микроцентрифужных пробирках, инкубируйте непосредственно при 29 ° C. В противном случае внесите пипеткой 10 мкл образца в 384-луночный планшет. Примечание: реакции в объемах более 10 мкл могут потребовать перемешивания для насыщения кислородом.

13. Центрифужный планшет при 4000 x g в течение 30 секунд при комнатной температуре, чтобы удалить остатки образца и уменьшить пузырьки. После этого закройте пластину, чтобы предотвратить испарение.

14. Запустите реакцию при 29 ° C. Примечание. Время работы зависит от эксперимента, но обычно длится менее 8 часов.

Репрезентативные результаты

Мы представили пятидневный протокол для приготовления эндогенной системы бесклеточной экспрессии TX-TL на основе Escherichia coli . Пример временной шкалы для создания реагентов — неочищенного клеточного экстракта и буфера — можно найти на Рис. 1 . После создания они могут храниться при -80 ° C до одного года. После создания реагентов установка и выполнение эксперимента могут быть выполнены менее чем за 8 часов.

Кроме того, мы оптимизировали условия экспрессии системы бесклеточной экспрессии TX-TL. Другие добавки, поставляемые пользователем, такие как буферы или растворы ДНК, должны быть предварительно откалиброваны на токсичность. Например, разные методы обработки плазмид приводят к разной экспрессии из-за содержания соли. Мы также проверили влияние буфера для элюции Tris-Cl на эффективность реакции (, рис. 5, ).

Пример калибровки неочищенного экстракта клеток, относящийся к шагу 4.1–4,9, показано на Рис. 4a . В целом, наши эксперименты показывают, что неочищенный клеточный экстракт наиболее чувствителен к уровням Mg-глутамата, за которым следуют уровни K-глутамата. Чтобы продемонстрировать бесклеточную систему экспрессии, мы сконструировали и протестировали петлю отрицательной обратной связи на основе репрессии tet . ²⁶ ( рисунок 6 ). В системе бесклеточной экспрессии та же схема, работающая с aTc и без нее, показывает 7-кратное изменение конечной точки экспрессии репортера deGFP после восьми часов экспрессии.Хотя для этого эксперимента не требуются глобальные индукторы или репрессоры, при необходимости они могут быть добавлены в разделе «Приготовление основной смеси».

Рис. 1. График времени для неочищенного клеточного экстракта, раствора аминокислот и приготовления энергетического раствора. Пятидневный график для типичного выполнения протокола приведен выше, оптимизированный для ночных инкубаций и дневных рабочих этапов.

Рис. 2. Анализ стоимости и экспрессии конкурирующих неочищенных клеточных экстрактов. a) Структура затрат на рабочую силу и материалы для бесклеточной экспрессионной системы TX-TL.На основе стоимости реагентов по состоянию на декабрь 2012 г. и затрат на рабочую силу в размере 14 долларов США в час. b) Сравнение стоимости бесклеточной экспрессионной системы TX-TL и других коммерческих систем. Стоимость указана в расчете на мкл, хотя объемы реакции могут варьироваться в зависимости от набора. c) Сравнение выхода бесклеточной экспрессионной системы TX-TL с другими коммерческими системами. Выход экспрессии белка определяется стандартами производителя. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.

Рис. 3. Загрузка и обработка бисерной трубки.а) Демонстрация правильной вязкости раствора ячеек-бус. Раствор клеточных гранул будет иметь вязкость, зависящую от многих факторов, включая количество добавленного буфера S30A, количество добавленных гранул и время, проведенное на льду. b) Загрузка пробирки для взбивания шариков перед быстрым настольным центрифугированием. Центрифугирование удаляет пузырьки, скопившиеся во время загрузки. c) Всплытие пузырьков после настольного центрифугирования. Размер пузырей может быть разным; их можно вытащить или удалить с помощью наконечника пипетки. d) Полностью заполненная трубка для взбивания шариков перед укупоркой. В трубке для взбивания шариков образуется мениск, и колпачок имеет достаточно, чтобы покрыть и вызвать переполнение небольших количеств. д) Правильно загруженный фильтрующий аппарат. Их можно использовать повторно. f) Сравнение правильно обработанной и неправильно обработанной трубки для взбивания шариков. Пробирка слева — это пробирка с хорошим биением — она ​​имеет небольшой и хорошо очерченный верхний слой и очень прозрачный супернатант. Пробирка справа неоптимальна, исходя из более крупного мутного второго слоя и мутного супернатанта.Неоптимальные трубки не должны подвергаться дополнительной обработке.

Рисунок 4. Свойства препаратов сырого экстракта. а) Типичные калибровочные графики для неочищенного клеточного экстракта. Неочищенный экстракт калибруется для дополнительных уровней Mg-глутамата, K-глутамата и DTT в указанном порядке. Показана конечная флуоресценция через 8 часов, а также максимальная скорость продукции белка на основе 12-минутного скользящего среднего. На основании этих графиков приемлемый диапазон дополнительного количества Mg-глутамата составляет 4 мМ, K-глутамата составляет 60-80 мМ, а DTT составляет 0-3 мМ.Обратите внимание, что каждый неочищенный экстракт необходимо калибровать независимо по этим трем переменным. б) Варианты приготовления экстрактов. Показана конечная флуоресценция двух сырых экстрактов, приготовленных в разные даты; планки погрешностей — это 1 стандартное отклонение от трех независимых прогонов в разные дни. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.

Рис. 5. Влияние раствора ДНК на эффективность экспрессии. а) Сравнение двух различных методов очистки плазмид.1 нМ pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 получают с использованием только набора QiaPrep Spin Miniprep (метод очистки 1) или после обработки с помощью набора для очистки QiaQuick PCR (метод очистки 2). Показана конечная флуоресценция через 8 часов, а также максимальная скорость продукции белка на основе 12-минутного скользящего среднего. Планки погрешностей — это 1 стандартное отклонение от четырех независимых прогонов в разные дни. b) Эффект элюирующего буфера (Трис-Cl). Различные концентрации Трис-Cl сравнивают в реакции внеклеточной экспрессии на основе экспрессии 1 нМ pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500.Приведенные концентрации представляют собой конечные концентрации Трис-Cl в реакции; Используемый буфер для элюции представляет собой 10 мМ Tris-Cl. Планки погрешностей — это 1 стандартное отклонение от трех независимых прогонов в разные дни. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.

Рис. 6. Пример выполнения TX-TL контура отрицательной обратной связи. а) Пример настройки бесклеточной реакции исполнения. Проверяет состояние «включено» и «выключено» цепи отрицательной обратной связи с положительным и отрицательным контролями. б) Плазмидная карта петли отрицательной обратной связи. c) Репрезентативные результаты. Данные отражают эксперимент в а) и б) с отрицательным контролем, вычтенным из сигнала. Генетическая схема показана на вставке. Планки погрешностей — это 1 стандартное отклонение от трех независимых прогонов в разные дни. Щелкните здесь, чтобы увидеть увеличенное изображение.

Таблица 1.Реагенты для 1 дня протокола сырого экстракта клеток.

Таблица 2. Реагенты для 2-го дня протокола сырого экстракта клеток.

Таблица 3. Буфер S30A и калькулятор массы шариков для 3-го дня протокола экстракции сырых клеток.

Таблица 4. Реагенты для подготовки к протоколу Energy Solution.

Дополнительные материалы 1. Рецепты предметов.

Хлорамфеникол, 34 мг / мл: Приготовьте 0,51 г хлорамфеникола и добавьте этанол до 15 мл. Стерилизовать фильтрованием (0,22 мкМ), аликвотировать в пробирки по 1 мл, хранить при -20 ° C для дальнейшего использования.

Планшет с агаром 2xYT + P + Cm: Приготовьте 1,24 г 2xYT, 1,6 мл раствора двухосновного фосфата калия @ 1 M, 0,88 мл одноосновного раствора фосфата калия @ 1 M, 0,6 г агара и воды до 40 мл. Автоклав. Дать остыть до 50 ° C и добавить 40 мкл Cm. Разлить по 25 мл в чашку Петри размером 100 x 15 мм и дать остыть в течение часа.

Среда 2xYT + P: Приготовьте 124 г 2xYT, 160 мл раствора двухосновного фосфата калия @ 1 M, 88 мл одноосновного раствора фосфата калия @ 1 M и воду до 4 л.Разложите аликвоты в 2 автоклава по 1,88 л и 0,24 л.

Трис-основа, 2 M: Приготовьте 60,57 г Трис-основы и воды до 250 мл. Стерилизовать, хранить при комнатной температуре для дальнейшего использования.

DTT, 1 M: Приготовьте 2,31 г DTT и воды до 15 мл. Стерилизовать фильтрованием (0,22 мкМ), аликвотировать в пробирки по 1 мл, хранить при -20 ° C для дальнейшего использования.

Буфер S30A: Приготовить 10,88 г Mg-глутамата и 24,39 г K-глутамата, 50 мл 2M триса, уксусной кислоты (до pH 7,7) и воды до 2 л. Автоклав, хранить при 4 ° C, добавить 4 мл 1 M DTT перед использованием.

Буфер S30B: Приготовьте 10,88 г Mg-глутамата и 24,39 г K-глутамата, трис при 2 M (до pH 8,2) и воду до 2 л. Автоклав, храните при 4 ° C, добавьте 2 мл 1 M DTT. перед использованием.

HEPES: Приготовьте 1,91 г HEPES (MW 238,21), КОН (до pH 8) и воду до 4 мл.

тРНК: Подготовьте 30 мг тРНК и воду до 600 мкл.

КоА: Приготовьте 30 мг КоА (молекулярная масса 767,53) и воду до 600 мкл.

NAD: Добавить 34,83 ​​мг NAD (молекулярная масса 663.43), Трис в 2 М (до pH 7,5-8) и воду до 300 мкл. (Добавьте 27 мкл триса в концентрации 2 M, чтобы довести pH раствора до 7,5-8).

цАМФ: Добавить 42,80 мг цАМФ (молекулярная масса 329,22), трис 2 М (до рН 8) и воду до 200 мкл. (Добавьте 73 мкл триса в концентрации 2 M, чтобы довести раствор до pH 8).

Фолиновая кислота (33,9 мМ): К 20 мг твердой кальциевой соли фолиновой кислоты (MW 511.5) добавьте 1,15 мл воды.

Спермидин: Приготовьте 23,55 мкл спермидина (молекулярная масса 145,25) и воды до 150 мкл.Приготовьте при комнатной температуре после кратковременного плавления при 37 ° C. 3-PGA: Добавить 1,03 г 3-PGA (MW 230,02), 2 M трис (до pH 7,5) и воду до 3,2 мл. (Добавьте 1,73 мл 2 M триса, чтобы довести pH раствора до 7,5).

Смесь нуклеотидов: Добавьте 145 мг дигидрата дикалиевой соли АТФ (молекулярная масса 619.4), 133 мг динатриевой соли GTP (молекулярная масса 567,14), 79,4 мг дигидрата динатриевой соли CTP (молекулярная масса 563,16), 82,6 мг дигидрата тринатриевой соли UTP. (MW 586,12), КОН при 15% разбавлении (до pH 7,5) и вода до 1.5 мл. (Добавьте 353 мкл КОН при 15% разбавлении, чтобы довести раствор до pH 7,5).

Дополнительные материалы 2. Анализ Брэдфорда.

1. Удалите средство Брэдфорда с 4 ° C и поставьте на комнатную температуру.

2. Приготовьте 50 мкл стандарта BSA в концентрации 1 мг / мл и 0,1 мг / мл.

3. Приготовьте 40 мкл 20-кратного разведения экстракта из шага 1.47.

4. Добавьте 800 мкл воды в 7 кювет.

5. Приготовьте стандартные кюветы для 0 мг / мл, 1 мг / мл (10 мкл 0.1 мг / мл BSA), 2 мг / мл (20 мкл 0,1 мг / мл BSA), 4 мг / мл (4 мкл 1 мг / мл BSA), 6 мг / мл (6 мкл 1 мг / мл BSA).

6. Приготовьте экспериментальные кюветы для 2 мкл образца и 4 мкл образца.

7. Добавьте 200 мкл агента Брэдфорда в каждую кювету и хорошо перемешайте пипеткой. Инкубируйте при комнатной температуре не менее 10 мин.

8. Получите стандартную кривую при OD 595 нм, используя кюветы из шага 6.5. Отклонить стандартную кривую, если r ² <0,95.

9. Определите концентрацию экстракта при OD 595 нм, используя кюветы из шага 6.6.

Обсуждение

Эндогенная бесклеточная экспрессионная система TX-TL на основе Escherichia coli , описанная здесь, представляет собой простую в использовании трехпробирную реакцию, которая может занять менее восьми часов от настройки до сбора данных. Процесс создания всех реагентов занимает в общей сложности пять дней (со значительными трудозатратами всего за один день), но производит неочищенный экстракт для 3000 реакций и реагенты для создания буфера для 10 000 реакций ( Рисунок 1 ).Кроме того, неочищенный экстракт и реагенты для создания буфера стабильны не менее 1 года при -80 ° C, что позволяет использовать один препарат несколько раз. ⁴ При цене 0,11 доллара США за 10 мкл реакции (0,26 доллара США, включая труд) затраты на 98% ниже, чем у сопоставимых коммерческих систем (, рисунок 2, ).

Однако в системе есть некоторые нерешенные ограничения. Конечная эффективность приготовления каждого неочищенного клеточного экстракта может варьироваться в зависимости от квалификации пользователя и условий окружающей среды, хотя типичное изменение выхода составляет от 5 до 10% (, рис. 4b, ).В результате следует ожидать вариабельности от партии к партии как в конечной точке экспрессии, так и в динамике экспрессии. Эти вариации, вероятно, сохранятся до тех пор, пока экстракт не будет полностью охарактеризован или пока создание экстракта не будет полностью автоматизировано. Если бесклеточная экспрессионная система используется для проведения чувствительных количественных экспериментов, рекомендуется проводить все эксперименты с одной и той же партией неочищенного клеточного экстракта. Выход из одной партии неочищенного клеточного экстракта, около 3000 реакций, должен быть достаточным для типичных экспериментальных курсов.Хотя мы подозреваем, что вариации можно устранить, увеличив масштаб и автоматизируя процедуру, такие попытки потребуют значительных вложений ресурсов.

Кроме того, хотя конечные уровни экспрессии достаточно легко определить, необходимо проделать большую работу для понимания динамики, присущей бесклеточной системе. Известно, что как конкуренция за ресурсы, так и ограничение ресурсов могут влиять на динамику экспрессии. Например, ограниченная эндогенная сигма 70 может привести к режиму насыщения с увеличенной ДНК-матрицей, производящей профиль экспрессии, аналогичный профилю истощения нуклеотидов или аминокислот. ^9,27 Однако не обязательно полностью понимать динамику, чтобы использовать систему. Для чистого увеличения урожайности оптимизацию можно выполнить с помощью подходов машинного обучения. ²⁸ Вопросы конкуренции и ограничения ресурсов могут быть решены с помощью математических моделей, проверенных с использованием экспериментальных данных.

Протокол, представленный здесь, оптимизирован для штамма BL21-Rosetta2, но может быть распространен на другие штаммы E. coli . Модификации BL21-Rosetta2, такие как удаление гена, кодирующего протеазу lon, и добавление генов, кодирующих редкие тРНК, позволяют максимально продуцировать белок.Мы попытались использовать протокол с двумя другими штаммами экстрактов — только BL21 и нокаутом BL21 trxA — и обнаружили на 50% меньший выход белка. Мы предполагаем, что урожайность снижается аналогичным образом при использовании других штаммов. Другие изменения в параметрах, такие как замена ростовой среды 2xYT на LB и другие богатые бульоны, привели к снижению выхода белка.

Бесклеточные системы экспрессии, использующие как эндогенные, так и экзогенные механизмы транскрипции-трансляции и механизмы регуляции, имеют широкое применение как в экспрессии белков и метаболитов, так и в синтетической биологии. ^3,29 Вместо того, чтобы ограничиваться контурами, регулируемыми Т7, можно представить себе получение сложных биомолекул в контролируемых пользователем условиях с использованием смеси природных промоторов E.coli и экзогенно поставляемых механизмов транскрипции и регуляции. Без ограничений клеточного деления и метаболизма вариабельность синтетических цепей, таких как репрессилатор, или метаболических путей, таких как продуцирующие артемизинин, можно уменьшить или лучше понять. ^30,31 Мы использовали эти преимущества для реализации генетических переключателей, а также для понимания секвестрации сигма-фактора. ^9,32 Такая технология может также стать основой «минимальных» или «искусственных» ячеек — небольших, хорошо охарактеризованных и самодостаточных воплощенных единиц экстракта. ^33,34

В конечном итоге мы ожидаем немедленного использования этой эндогенной бесклеточной системы экспрессии в качестве прототипа среды для синтетической биологии. Система бесклеточной экспрессии, получившая прозвище «биомолекулярный макет TX-TL», обеспечивает контролируемую среду, в которой синтетические цепи, в конечном итоге предназначенные для экспрессии in vivo , могут проходить этапы прототипирования — циклы тестирования базовой плазмиды, линейной или химически синтезированной ДНК. с последующим анализом и быстрой модификацией.Раунды прототипирования могут быть поддержаны прогнозирующими математическими моделями, разрабатываемыми в настоящее время. Отказавшись от клонирования и манипуляции in vivo с для незавершенных цепей, мы ожидаем, что время инженерного цикла сократится до 1–3 дней вместо стандартных недель.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Чонмина Кима, Дэна Сигал-Гаскинса, Ану Тубагере и Эноха Йенга за помощь в оптимизации протокола, а также Клэр Чен и Барклай Ли за помощь на ранних этапах проекта.Этот материал основан на работе, частично поддерживаемой программой Living Foundries Агентства перспективных исследовательских проектов Министерства обороны США (DARPA / MTO), номер контракта HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS также поддерживается ученым-медиком UCLA / Caltech. Стипендия по программе обучения и стипендия Министерства обороны, Управления научных исследований ВВС, Национальной оборонной науки и инженерии (NDSEG), 32 CFR 168a. Взгляды и выводы, содержащиеся в этом документе, принадлежат авторам и не должны толковаться как представляющие официально политика, явно или подразумеваемая, Агентства перспективных оборонных исследовательских проектов или U.С. Правительство.

Ссылки

• Нуаро В., Бар-Зив Р., Либхабер А. Принципы бесклеточной сборки генетической цепи. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2003; 100: 12672–12677. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• He MY, He YZ, Luo Q, Wang MR. От ДНК к белку: живые клетки не требуются. Process Biochem. 2011; 46: 615–620. [Google Scholar]
• Forster AC, Church GM. Проекты синтетической биологии in vitro.Genome Res. 1101; 17: 1–6. [PubMed] [Google Scholar]
• Шин Дж., Нуаро В. Эффективная бесклеточная экспрессия с помощью эндогенной РНК-полимеразы E. Coli и сигма-фактора 70. Журнал биологической инженерии. 2010; 4: 8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Shimizu Y, et al. Бесклеточная трансляция, восстановленная очищенными компонентами. Nat Biotechnol. 2001; 19: 751–755. [PubMed] [Google Scholar]
• Шин Дж., Нуаро В. Набор инструментов для внеклеточной экспрессии E. coli: применение в синтетических генных цепях и искусственных клетках.Acs Synth Biol. 2012; 1: 29–41. [PubMed] [Google Scholar]
• Шин Дж., Нуаро В. Изучение инактивации информационной РНК и деградации белка в бесклеточной системе экспрессии Escherichia coli. Журнал биологической инженерии. 2010; 4: 9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Шин Дж., Джардин П., Нуаро В. Репликация, синтез и сборка бактериофага Т7 в бесклеточной реакции. Acs Synth Biol. 2012; 1: 408–413. [PubMed] [Google Scholar]
• Сигал-Гаскинс Д., Нуаро В., Мюррей Р.М.Использование биомолекулярных ресурсов в элементарных бесклеточных генных цепях. В: Пао Л., Абрамович Д., редакторы. Американская конференция по контролю; 17-19 июня; Вашингтон. AACC; 2013. С. 1531–1536. [Google Scholar]
• Карцбрун Э., Шин Дж., Бар-Зив Р. Х., Нуаро В. Крупнозернистая динамика синтеза белка в бесклеточной системе. Письма с физическим обзором. 2011; 106: 048104. [PubMed] [Google Scholar]
• Хоагланд М.Б., Стивенсон М.Л., Скотт Дж. Ф., Хехт Л. И., Замечник ПК. Растворимый промежуточный продукт рибонуклеиновой кислоты в синтезе белка.J Biol Chem. 1958; 231: 241–257. [PubMed] [Google Scholar]
• Wood WB, Берг П. Влияние ферментативно синтезированной рибонуклеиновой кислоты на включение аминокислот с помощью системы растворимый белок-рибосома из Escherichia Coli. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 1962; 48: 94. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Зубай Г. Синтез белка в микробных системах in vitro. Анну Рев Жене. 1973; 7: 267–287. [PubMed] [Google Scholar]
• Пратт Дж.В кн .: Транскрипция и перевод: практический подход. Хеймс Б.Д., Хиггинс С.Дж., редакторы. IRL Press; 1984. С. 179–209. [Google Scholar]
• Ким Х.С., Ким Д.М. Способы активизации внеклеточного синтеза белка. Журнал бионауки и биоинженерии. 2009; 108: 1–4. [PubMed] [Google Scholar]
• Мишель-Рейделле Н., Калхун К., Шварц Дж. Стабилизация аминокислот для внеклеточного синтеза белка путем модификации генома Escherichia coli. Метаболическая инженерия. 2004. 6: 197–203. [PubMed] [Google Scholar]
• Лю Д.В., Завада Дж. Ф., Шварц Дж. Р.Оптимизация приготовления экстракта Escherichia coli S30 для экономичного бесклеточного синтеза белка. Прогресс биотехнологии. 2005. 21: 460–465. [PubMed] [Google Scholar]
• Андриантоандро Э., Басу С., Кариг Д. К., Вайс Р. Синтетическая биология: новые инженерные правила для развивающейся дисциплины. Молекулярная системная биология. 2006; 2: 2006.0028. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Квок Р. Пять твердых истин для синтетической биологии. Природа. 2010; 463: 288–290. [PubMed] [Google Scholar]
• Tabor S, Richardson CC.Система РНК-полимераза / промотор бактериофага Т7 для контролируемой эксклюзивной экспрессии определенных генов. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 1985; 82: 1074–1078. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Левицки Б.Т., Маргус Т., Ремме Дж., Нирхаус К.Х. Сцепление транскрипции рРНК и сборки рибосом in vivo. Формирование активных рибосомных субъединиц в Escherichia coli требует транскрипции генов рРНК с помощью РНК-полимеразы хозяина, которая не может быть заменена РНК-полимеразой бактериофага Т7.Журнал молекулярной биологии. 1993; 231: 581–593. [PubMed] [Google Scholar]
• Искакова М.Б., Шафларски В., Дрейфус М., Ремме Дж., Нирхаус К.Х. Устранение неполадок в сопряженной системе транскрипции-трансляции in vitro, полученной из клеток Escherichia coli: синтез полностью активных белков с высоким выходом. Исследование нуклеиновых кислот. 2006; 34: e135. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Кигава Т. и др. Приготовление экстракта клеток Escherichia coli для высокопродуктивной бесклеточной экспрессии белка.Журнал структурных и. 2004. 5: 63–68. [PubMed] [Google Scholar]
• Мацуда Т. и др. Улучшение внеклеточного синтеза белка для мечения стабильных изотопов. Журнал биомолекулярный. ЯМР. 2007. 37: 225–229. [PubMed] [Google Scholar]
• Ситараман К. и др. Новая система бесклеточного синтеза белка. Журнал биотехнологии. 2004. 110: 257–263. [PubMed] [Google Scholar]
• Беккей А., Серрано Л. Разработка стабильности в генных сетях с помощью ауторегуляции. Природа. 2000; 405: 590–593.[PubMed] [Google Scholar]
• Маеда Х., Фуджита Н., Исихама А. Конкуренция между семью сигма-субъединицами Escherichia coli: относительное сродство связывания с основной РНК-полимеразой. Исследование нуклеиновых кислот. 2000; 28: 3497–3503. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Caschera F, et al. Справиться со сложностями: оптимизация внеклеточного синтеза белка с помощью машинного обучения. Биотехнология и биоинженерия. 2011; 108: 2218–2228. [PubMed] [Google Scholar]
• Hodgman CE, Jewett MC.Бесклеточная синтетическая биология: мышление вне клетки. Метаболическая инженерия. 2012; 14: 261–269. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Эловиц М.Б., Лейблер С. Синтетическая осцилляторная сеть регуляторов транскрипции. Природа. 2000. 403: 335–338. [PubMed] [Google Scholar]
• Цурута Х. и др. Высокий уровень продукции аморфо-4,11-диена, предшественника противомалярийного агента артемизинина, в Escherichia coli. Plos One. 2009; 4: e4489. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gardner TS, Cantor CR, Collins JJ.Конструирование генетического переключателя на Escherichia coli. Природа. 2000; 403: 339–342. [PubMed] [Google Scholar]
• Jewett MC, Forster AC. Обновленная информация о проектировании и строительстве минимальных ячеек. Современное мнение в области биотехнологии. 2010; 21: 697–703. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Нуаро В., Либхабер А. Биореактор везикул как шаг к сборке искусственных клеток. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2004; 101: 17669–17674.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Подготовка проб путем простого извлечения и разложения (SPEED)

% PDF-1.4 % 1 0 obj > эндобдж 3 0 obj > поток GPL Ghostscript 9.222021-03-27T00: 18: 58-07: 002018-08-16T08: 37: 11 + 02: 00PDF24 Creator2021-03-27T00: 18: 58-07: 00uuid: 4dd8c18e-a37a-11e8-0000-e4e4c76eeb7cuuid : d289163f-1dd1-11b2-0a00-8100983a8bffapplication / pdf

HTTP / 1.1 500 Внутренняя ошибка сервера
 

{
   "вина":{
      "деталь": {
         "errorcode": "steps.servicecallout.ExecutionFailed"
      },
      "faultstring": "Выполнение ServiceCallout callWCSAuthServiceCallout завершилось неудачно. Причина: ResponseCode 400 рассматривается как ошибка"
   }
}
 

     менеджер данных 
     по умолчанию 

 

     http://example.com/{request.myResourcePath} 

 

     Встроенное сообщение запроса 
    <Переменная запроса = "authenticationRequest">
      <Установить>
        
           {запрос.queryparam.postalcode} 
           {request.queryparam.country} 
           false 
        
      
    
     GeocodingResponse 
     30000 
    
       http://maps.googleapis.com/maps/api/geocode/json 
    

 

    
     GeocodingResponse 
     30000 
    
       http://maps.googleapis.com/maps/api/geocode/json 
    

 

     выноска службы 
    <Свойства />
    
         false 
    
     myResponse 
    
        <Балансировщик нагрузки>
             RoundRobin 
            <Имя сервера = "httpbin" />
            <Имя сервера = "yahoo" />
        
         / получить 
    

 

     Пользовательская метка, используемая в пользовательском интерфейсе 
    
         false 
        <Удалить>
            
            
            <Путь />
            <Версия />
            <Глагол />
         
         <Копировать>
            
            
            <Путь />
            <Версия />
            <Глагол />
        
        <Добавить>
            <Заголовки />
            
            
        
        <Установить>
            <Заголовки />
            
            
            <Полезная нагрузка />
            
            
            <Путь />
            <Версия />
            <Глагол />
        
    
     calloutResponse 
     30000 
    
         http: // пример.ru 
        
        
        <Свойства />
    
    
        
        
        <Путь />
    

 

  Отображаемое имя политики  

     false 
    <Удалить>
        
        
        <Путь />
        <Версия />
        <Глагол />
    
    <Копировать>
        
        
        <Путь />
        <Версия />
        <Глагол />
    
    <Добавить>
        <Заголовки />
        
        
    
    <Установить>
        <Заголовки />
        
        
        <Полезная нагрузка />
        
        
        <Путь />
        <Версия />
        <Глагол />
    

 

<Запрос>
  <Установить>
    <Заголовки>
      
 application / json 
    
     POST 
     {"message": "мое тестовое сообщение"} 
  
   false 

 

     false 

 

  calloutResponse 
 

 30000 
 

     http://example.com 
    
    
    <Свойства />

 

     http://example.com 

 

 http://example.com/forecastrss?w=${request.header.woeid} 
 

 http: // пример.ru / {request.resourcePath}? w = $ {request.header.woeid} 
 

 http: // {request.dom_port} / {request.resourcePath} 
 

     https://example.com 
    
         true 
         true 
         myKeystore 
         myKey 
         myTruststore 
        <Шифры />
        <Протоколы />
    

 

     http://example.com 
    <Свойства>
         true 
        <Имя свойства = "request.retain.headers">
          User-Agent, Referer, Accept-Language
        
    

 

   RoundRobin      / get  
 

   
   
   <Путь />

 

    менеджер данных 
    по умолчанию 

 

    менеджер данных 
    по умолчанию 

 

    / data-manager