Открыть чоп: Как открыть ЧОП – 7 ключевых шагов

Чтобы определить, может ли Chop 5’UTR регулировать трансляцию ORF Chop , мы сконструировали ретровирусный вектор, экспрессирующий меченую ORF для CHOP, содержащую или не содержащую 5’UTR (рис.1А). После инфицирования клеток NIH-3T3 в контрольных клетках измеряли накопление белка CHOP и мРНК в ответ на агент (туникамицин), который индуцирует стресс ER. Как и ожидалось, содержание как мРНК, так и белка эндогенного гена Chop сильно индуцируется в ответ на лечение туникамицином. Конструкция [5′UTR (Δ) –9E10 – CHOP], содержащая ген Chop без 5′UTR, демонстрирует высокую экспрессию белка CHOP. Напротив, экспрессия CHOP сильно подавляется, когда 5’UTR вставляется между сайтом начала транскрипции и кодирующей последовательностью CHOP (5’UTR – 9E10-CHOP).Обработка туникамицином не влияет на экспрессию CHOP в обеих конструкциях, содержащих или не содержащих 5’UTR. В том же эксперименте на содержание мРНК не оказывает значительного влияния Chop 5’UTR. Аналогичные результаты были получены с использованием клеток HeLa (результаты не показаны). Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что трансляция Chop сильно репрессируется лидерной областью транскрипта Chop , но эта область не участвует в регуляции экспрессии Chop в ответ на стресс.

Затем мы исследовали, может ли Chop 5’UTR репрессировать нижележащую ORF в другом контексте (рис. 1B и C). Репортерный ген LUC, управляемый либо CMV, либо промотором Chop , использовали вместо Chop , и конструкции трансфицировали в клетки HeLa. AUG гена LUC находится в оптимальном контексте для инициации рибосомами. Наши результаты показывают, что уровень активности люциферазы подавляется, когда присутствует фрагмент +21-170 CHOP 5’UTR, тогда как уровень мРНК LUC не изменяется.Для этих экспериментов транскрипт LUC измеряли с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией, и мы считали, что активность LUC была пропорциональна содержанию белка LUC (31).

Чтобы лучше понять механизмы, с помощью которых область 5’UTR Chop может репрессировать трансляцию нижестоящей ORF, была проанализирована ее нуклеотидная последовательность. Выравнивание 5’UTR транскриптов Chop человека, мыши и хомяка показывает высокую гомологию последовательностей (рис.2A), а также наличие трех сайтов начала трансляции (AUG – uAUG выше) для последовательности человека и двух для последовательностей хомяка и мыши. AUG # 1 и AUG # 2 находятся в рамке считывания с одним и тем же стоп-кодоном (UGA), очерчивая ORF из 34 и 31 аминокислот, соответственно. Аминокислотные последовательности пептидов uORF у хомяка, мыши и человека также демонстрируют высокую степень гомологии (фиг. 2B). Примечательно, что последовательность 5’UTR человека также содержит третий uAUG, который очерчивает ORF, перекрывающую ORF Chop .Сохранение первого uORF между видами и его расположение в транскрипте предполагают, что он функционально важен для регуляции экспрессии CHOP. Эти uAUG, а также кодон инициации CHOP, находятся в контексте последовательности, который делает возможной инициацию трансляции рибосомы (32,33). В целом, эти наблюдения привели нас к тому, чтобы сосредоточить внимание на эффектах uAUGs на модуляцию трансляции нижестоящей кодирующей последовательности.

Мутации в вышестоящих AUG отменяют репрессорный эффект 5’UTR

Чтобы определить важность uAUG в регуляции трансляции Chop , мы сконструировали серию плазмид (происходящих из pCMV – 5’UTR – LUC), содержащих точечную мутацию для каждого uAUG.После трансфекции получали клеточный экстракт и анализировали активность LUC и содержание мРНК (фиг. 3). Уровень транскриптов очень похож во всех конструкциях, что указывает на то, что различия в активности LUC не являются результатом вариации в накоплении мРНК. Напротив, на активность LUC влияет мутация uAUG. В частности, мутация во втором или третьем uAUG (uAUG # 2 или uAUG # 3) вызывает 6- и 2-кратное увеличение активности LUC, соответственно, тогда как мутация uAUG # 1 не имеет значительного эффекта.Когда все uAUG мутированы [uAUG (-)], репрессирующий эффект 5’UTR отсутствует, поскольку активность LUC была эквивалентна активности, измеренной в отсутствие 5’UTR Chop (фиг. 3 и 1С). По сравнению с лидерной последовательностью дикого типа, мутация трех uAUG (произошла мутация A кодона AUG) приводит к ~ 10-кратному увеличению активности LUC (аналогичные результаты были получены после мутации G кодона AUG; результаты не показаны). Эти результаты показывают, что подавление активности LUC из-за присутствия Chop 5’UTR происходит на уровне трансляции.Кроме того, uAUG # 2 сильно вовлечен в этот репрессивный эффект.

Инициирование трансляции в восходящем ORF

Результаты, описанные выше, предполагают, что Chop uORF транслируется после инициации кодона uAUG # 2. Чтобы напрямую проверить возможность того, что uORF может транслироваться, мы создали конструкцию, в которой стоп-кодон uORF, а также интерцистронная область были удалены, а uORF Chop был слит в рамке считывания с ORF люциферазы (pCMV– фьюжн uORF / Luc в кадре).В этом эксперименте синтез LUC должен происходить только в том случае, если рибосомы инициируют трансляцию по кодонам uAUG uORF. Экстракты трансфицированных клеток были грубо очищены и проанализированы на экспрессию LUC вестерн-блоттингом с использованием специфических антител, распознающих белок люциферазы. Иммуноблоттинг, представленный на фиг. 4, показывает, что слитый белок ORF-LUC экспрессируется на том же уровне, что и белок LUC, экспрессируемый из вектора pCMV-LUC. Как и ожидалось, этот белок имеет молекулярную массу немного выше, чем белок LUC.Приведенные выше данные демонстрируют, что uORF эффективно транслируется.

Инициирование трансляции в нижележащем ORF

Поскольку uAUG # 2 хорошо инициируется рибосомами и поскольку uAUG # 2 не может быть удален после альтернативного сплайсинга транскрипта или использования другого сайта инициации транскрипции, мы были заинтересованы в изучении механизма, с помощью которого транслируется нижележащая ORF. Одна из возможностей заключается в том, что трансляция происходит посредством «просачивающегося сканирования», при котором некоторые субъединицы рибосом не инициируются в кодоне uAUG и не транслируют нижележащую ORF.Другая возможность состоит в том, что несколько рибосом, которые транслируют uORF, могут повторно инициировать трансляцию в нижележащем AUG (34,35). Чтобы оценить эти возможности, было проведено несколько серий экспериментов.

Во-первых, мы мутировали контекст uAUG # 2 в последовательности (gccgccaccAUGg), которая, как известно, дает максимальную частоту инициации (36,37). Рисунок 5 показывает, что размещение uAUG в оптимальном контексте не оказывает значительного влияния на экспрессию LUC. Следовательно, кодон uAUG # 2 одинаково инициируется как в контексте дикого типа, так и в контексте с оптимальной мутацией.Эти данные подтверждают вывод о том, что uAUG # 2 присутствует в контексте, способном эффективно разрешать перевод, и, таким образом, uORF эффективно транслируется.

Для дальнейшей оценки вклада «просачивающегося сканирования» в трансляцию нисходящей ORF мы мутировали стоп-кодон uORF и ввели сдвиг кадра на 1 нт, чтобы сгенерировать расширенный uORF, который не находится в кадре с Ген LUC [рис. 2)]. Этот uORF перекрывается с ORF LUC и оканчивается на следующем стоп-кодоне, расположенном на 22 нуклеотида ниже инициирующего кодона LUC.Эта мутация предотвращает трансляцию ORF LUC путем повторной инициации после трансляции uORF CHOP. Наблюдаемое снижение активности люциферазы предполагает, что повторная инициация рибосом может быть ответственна за часть трансляции нижележащей ORF (фиг. 5). Однако, поскольку рибосомы, транслирующие расширенный uORF, могут мешать событиям инициации в перекрывающемся стартовом кодоне LUC, из этого эксперимента трудно определить соответствующую роль просочившегося сканирования и повторной инициации в трансляции LUC.

Влияние межцистронного промежутка на трансляцию нижележащей ORF

В ряде генов, содержащих uORF (34,38), было показано, что на повторную инициацию рибосомы после стоп-кодона uORF влияет как последовательность нуклеотидов, следующих за вышестоящим терминирующим кодоном, так и расстояние между uORF и нижележащим стартовым кодоном. сайт. Мы ввели несколько мутаций в межцистронную область, чтобы понять ее роль в трансляции нижележащей рамки считывания (рис.6). В первой серии экспериментов последовательность дикого типа была заменена последовательностью LacZ, не содержащей AUG [фиг. 6 (3)]. Поскольку замена спейсинговой области удалила uAUG # 3, конструкция, содержащая мутировавший 5’UTR на этом uAUG # 3, представлена ​​в качестве контроля [фиг. 6 (1)]. Наши результаты показывают, что мутация межцистронной области существенно не влияет на активность LUC [рис. 6 (3)]. Более того, чтобы обнаружить неожиданные независимые от uORF эффекты мутаций, ранее использованные плазмиды были мутированы на uAUG # 1 + 2 [фиг.6 (2) и (4)]. В этом контексте мутация интерцистронной области не влияет на экспрессию нижележащего цистрона.

Во второй серии экспериментов мы изменили длину межцистронной области. Сначала мы вставляли фрагменты разной длины в межцистронную область (рис. 6 (7) — (10)]. Эти спейсеры были амплифицированы с помощью ПЦР из гена Escherichia coli LacZ и не содержали стартового кодона AUG. Расширения 47 и 140 нуклеотидов не влияют на активность LUC в конструкциях uAUG (+) [фиг.6 (7) и (9)]. Установка прокладки в противоположной ориентации дает тот же результат (результат не показан). Точно так же уменьшение межцистронной области не нарушает трансляцию LUC [рис. 6 (11)]. Во всех конструкциях, мутировавших в uAUG, изменение длины межцистронной области не приводит к значительному изменению активности LUC [рис. 6 (8), (10) и (12)].

Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что последовательность межцистронной области не участвует в контроле трансляции нижестоящей ORF.

Мутации в пептидной последовательности, кодируемой uORF, усиливают трансляцию нижележащего цистрона

Ингибирование uORFs в некоторых других эукариотических генах зависит от кодирующей пептид последовательности uORF (34,39–42). Чтобы оценить важность этого пептида в трансляции нижестоящей ORF, последовательность uORF была мутирована следующим образом. Во-первых, мы ввели стоп-кодон в последовательность uORF [фиг. 7A (3)], чтобы синтезировать пептид из трех аминокислот после инициации трансляции в uAUG # 2 (кодон UGG был мутирован в UGA; фиг.2). Во-вторых, мы выполнили мутацию сдвига рамки считывания в мРНК, которая генерирует мутированную последовательность кодируемого uORF пептида, не влияя на ее длину [Рис. 7А (5)]. На рис. 7А показано, что эти различные мутации пептидной последовательности uORF увеличивают активность LUC примерно в ∼3–4 раза, но не влияют на содержание мРНК [рис. 7A, сравните (3) и (5) с (1)].

Чтобы измерить полную дерепрессию активности LUC, мы сконструировали контрольные плазмиды, содержащие такую ​​же модификацию в последовательности uORF, но мутировавшие по кодонам uAUG # 1 и uAUG # 2 [фиг.7A (2), (4) и (6)]. Удаление стартовых кодонов uORF приводит к более высокой активности LUC, чем обнаруженная после мутации пептидной последовательности uORF, что позволяет предположить, что мутации пептидной последовательности, кодируемой uORF, не приводят к полной депрепрессии активности LUC. Из этих экспериментов мы можем заключить, что (i) инициация только uAUG частично способствует ингибированию последующей трансляции ORF независимо от пептидной последовательности и (ii) когда аминокислотная последовательность uORF мутирована, трансляция ORF ниже по потоку увеличивается.

Мутации, использованные в этих экспериментах, оказывают сильное влияние на аминокислотную последовательность, но соответствуют только незначительным изменениям в последовательности мРНК. Тем не менее, мы не можем исключить, что последовательность мРНК 5’UTR сама по себе может участвовать в контроле остаточной экспрессии нижележащего цистрона. Чтобы исследовать его роль, мы выполнили молчащие мутации в кодирующей последовательности uORF, которые модифицируют мРНК, но не последовательность белка uORF (13 нуклеотидов, расположенных в последней части последовательности uORF, были мутированы).На фигуре 7A (7) показано, что молчащие мутации последовательности uORF незначительно снижают активность LUC (примерно в 2 раза). Эти результаты демонстрируют, что последовательность мРНК uORF играет роль в инициации нижележащего AUG. Эта мутация не оказывает значительного влияния на экспрессию нижележащего цистрона при мутации uAUG # 1 + 2 + 3 [Рис. 7A, сравните (2) и (8)].

Опосредованное uORF ингибирование трансляции проявляется в

Далее мы рассмотрели возможность того, что пептид, кодируемый uORF, ингибирует трансляцию нижележащей ORF в trans .Репортерная плазмида, мутировавшая в uAUGs [pCMV – 5′UTR – LUC – uAUG (-)], была трансфицирована вместе с увеличивающимися количествами вектора экспрессии, pCMV – uORF, который содержит uORF, управляемый промотором CMV (рис. 7B). . Контрольный эксперимент проводили путем котрансфекции репортерного вектора экспрессионной плазмидой, мутированной по кодонам uAUG [pCMV – uORF – uAUG (-)]. Трансфекция увеличивающихся количеств вектора экспрессии uORF не снижает экспрессию LUC, кодируемую репортерной плазмидой. Хотя мы не можем напрямую оценить синтез кодируемого uORF пептида в клетке, высокая экспрессия конструкции слияния, показанная на фиг. 4, демонстрирует, что трансляция эффективно инициируется в uORF CHOP.Неспособность uORF репрессировать трансляцию при экспрессии из отдельного транскрипта предполагает, что uORF ингибирует экспрессию нижележащего цистрона посредством механизма действия cis .

ОБСУЖДЕНИЕ

Экспрессия CHOP сильно усиливается в ответ на различные стрессы, включая нарушение функции ER и аминокислотную депривацию. В этих ситуациях глобальный синтез белка подавляется. Мы начали это исследование CHOP 5’UTR в надежде понять, как транслируется CHOP, в то время как большинство других транскриптов нет.Мы исследовали этот вопрос, сравнивая относительные уровни трансляции мРНК CHOP, экспрессируемой сильным конститутивным ретровирусным промотором в присутствии или отсутствии стресса ER. Мы обнаружили, что присутствие этой области подавляет трансляцию как в стрессированных, так и в нестрессированных клетках. Это связано с набором из трех вышестоящих AUG (uAUG), которые присутствуют в области от нуклеотидов +1 до +170 в 5’UTR человека. Первые два кодона uAUG находятся в кадре и запускают uORF, локализованный в 5′-лидере.Наши результаты показывают, что uAUG # 2 хорошо инициируется рибосомами и сильно подавляет трансляцию нижележащей ORF. Третий кодон uAUG 5’UTR человека Chop , который не присутствует в 5’UTR хомяка и мыши, незначительно ингибирует инициацию в основном AUG. Удаление всех uAUG улучшает трансляционную активность примерно в 10 раз. Наши результаты согласуются с механизмом, в котором трансляция цистрона uORF CHOP репрессирует инициацию нижележащего кодона AUG. Описано несколько примеров генов, содержащих ингибирующие пКОРС (34).Однако пКОРС не всегда подавляют трансляцию. Например, 5’UTR мРНК орнитиндекарбоксилазы репрессирует трансляцию, но присутствующие в ее лидере uORFs мало способствуют ее репрессии (43).

Настоящее исследование показывает, что мутация двух нуклеотидов, изменяющая последовательность пептида, кодируемого uORF, сильно увеличивает трансляцию нижележащего цистрона. Эти данные подтверждают гипотезу о том, что uORF ингибирует нисходящую трансляцию с помощью механизма, который зависит от информации о кодировании аминокислот.Мы не можем полностью исключить, что мутации, используемые в этих конструкциях, могут влиять на инициацию в нижележащем кодоне. Однако маловероятно, что точечная мутация сильно изменяет структуру РНК и тем самым влияет на экспрессию LUC. Кроме того, результаты, полученные с использованием «молчащих мутаций», показывают, что последовательность мРНК, кодируемая uORF, может влиять на инициацию в нижележащем цистроне. Взятые вместе, наши результаты показывают, что при мутации только в последовательности мРНК, область uORF немного снижает экспрессию LUC, тогда как мутации в аминокислотной последовательности сильно усиливают экспрессию LUC.Следовательно, вероятно, что эффекты точечной мутации, используемой для модификации аминокислотной последовательности пКОРС (фиг. 7A), обусловлены пептидной последовательностью пКОРС, и, таким образом, ингибирующий эффект пКОРС является «управляемым белком». механизм’.

Были описаны другие транскрипты эукариотических генов, содержащие uORF, которые ингибируют нисходящую трансляцию с помощью механизма, который зависит от информации о кодировании аминокислот. Например, в S -аденозилметиониндекарбоксилазе (44), β2-адренорецепторе (45), гене CPA1 дрожжей (46) или генах цитомегаловируса gp48 (или CMV gp UL4) (47–49), пептидный продукт uORF опосредует подавление трансляции.Для большинства этих генов пептид uORF опосредует ингибирование цис. Только пептид uORF β2-адренергического рецептора ингибирует трансляцию в trans . Однако этот результат был показан только в бесклеточных экстрактах и ​​при высоких концентрациях пептидов (45). Механизмы, задействованные для объяснения ингибирующих эффектов пептида uORF на трансляцию, не изучены, однако можно предложить несколько моделей. Например, пептид uORF синтезируется и обладает способностью ингибировать трансляцию только при высоких концентрациях в локальном микроокружении (45).Кроме того, возможно, что растущий пептид, все еще прикрепленный к аппарату трансляции, ингибирует трансляцию посредством взаимодействия с рибосомой или связанным с рибосомой фактором трансляции. В гене gp48 было показано, что пептид uORF приводит к остановке рибосом во время прекращения трансляции uORF2 (39,47,49). Следовательно, uORF должен быть частью того же транскрипта, который предшествует основному цистрону. Потребуются дальнейшие исследования, чтобы определить, имеет ли место подобный механизм в расшифровке стенограммы Chop .

Наши данные показывают, что, несмотря на эффективную трансляцию uORF, основной цистрон остается немного транслируемым. Несколько механизмов могут объяснять трансляцию нижележащего цистрона: вход внутрь рибосомы, повторная инициация рибосомы и «сканирование утечки». На эффективность повторной инициации после трансляции uORF может влиять как природа последовательности, окружающей вышестоящий кодон терминации, так и расстояние между uORF и нижележащим стартовым сайтом (34,35,50). Замена интерцистронной последовательности нейтральной последовательностью LacZ или изменение длины этой последовательности не влияет на трансляцию нижележащей ORF.Следовательно, межцистронная область не содержит последовательности, участвующей в контроле повторной инициации рибосомы или внутреннего сайта входа в рибосому. Однако «молчащие мутации» последовательности uORF незначительно снижают остаточную трансляцию нижележащего цистрона, предполагая, что последовательность мРНК может играть роль в инициации нижележащего цистрона. Этот вывод подкрепляется наблюдением, что удлинение uORF (Fig. 5) частично ингибирует остаточную трансляцию LUC. Однако остаточная активность LUC, которая измеряется при расширении uORF, показывает, что «сканирование с утечкой» также может частично способствовать трансляции расположенного ниже цистрона.

Взятые вместе эти данные согласуются с идеей, что остаточная трансляция нижележащей ORF происходит частично за счет повторной инициации рибосом и частично за счет сканирования с утечкой. Дальнейшая работа будет необходима для количественной оценки соответствующей части обоих механизмов трансляции ORF CHOP.

Наблюдение за тем, что большинство мРНК, которые инициируются ниже одного или нескольких кодонов uAUG, кодируют регуляторные белки, приводит к предположению, что uAUG могут подавлять трансляцию белков, экспрессию которых необходимо точно контролировать.Подтверждающие доказательства этой идеи получены из результатов, что (i) онкогенный потенциал c-mos (51,52) или c-lck (53) увеличивается за счет перегруппировок, удаляющих uORF, и (ii) репрессивный эффект НКО можно регулировать. Например, в хорошо изученном случае гена Saccharomyces cerevisiae GCN4 , четыре uORF регулируют трансляцию GCN4 в ответ на доступность аминокислот, контролируя, какие нижестоящие кодоны AUG используются повторно инициирующими рибосомами (54,55 ).Другой пример включает uORF S -аденозилметиониндекарбоксилазы , которая сама по себе может обеспечивать полиаминную регуляцию трансляции нижележащей ORF (56). Кроме того, на ингибирующую роль вышестоящего AUG может влиять тип клетки. Например, элементы в лидерной последовательности транскрипта c-sis ингибируют его трансляцию, но эта репрессия временно снимается при дифференцировке мегакариоцитов (57).

Учитывая важность белка CHOP в регуляции многочисленных клеточных функций, может потребоваться точный контроль его экспрессии.Мы описали новую особенность экспрессии CHOP, которая включает репрессию трансляции высококонсервативной uORF. Примером конститутивной экспрессии аномальной формы CHOP является слияние CHOP с TLS из-за хромосомной транслокации, обнаруженной в подавляющем большинстве миксоидных липосарком человека (10). Онкогенный потенциал этого гибридного белка обусловлен свойствами TLS-части белка и его конститутивной экспрессией (11). Примечательно, что конститутивная экспрессия этой онкогенной формы CHOP может быть частично объяснена отсутствием репрессии трансляции из-за делеции 5’UTR CHOP.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим C. Tassy и доктора A. Ouali (Station de Recherche sur la Viande, INRA de Theix, Франция) за ионообменную хроматографию, S. Lafarge и профессора YJ Bignon за количественное определение мРНК, докторов S. Mordier и E Пинзару за критическое прочтение рукописи и полезное обсуждение. Эта работа была поддержана грантами Национального института исследований в области агрономии и Фонда медицинских исследований. C.J. был удостоен исследовательской стипендии DANONE.F.U. является стипендиатом Мемориального фонда Уэхара.

Кому адресовать корреспонденцию. Тел .: +33 4 73 62 45 62; Факс: +33 4 73 62 45 70; Эл. Почта: [email protected]

Рисунок 1. Последовательность Chop 5’UTR репрессирует трансляцию нижестоящих кодирующих последовательностей. ( A ) Клетки NIH-3T3 инфицировали рекомбинантным ретровирусом, экспрессирующим под контролем промотора CMV меченую ORF для CHOP, содержащую 5’UTR человека Chop (5’UTR-9E10-CHOP, дорожка 3 ) или нет [5′UTR (Δ) –9E10 – CHOP; дорожка 2].Контрольный эксперимент проводили путем заражения клеток пустым вирусом (нетрансфицированный, дорожка 1). Затем клетки инкубировали в течение 4 ч с 2,5 мкг / мл туникамицина или без него. На схеме конструкции стрелка представляет сайт начала транскрипции. Белковые экстракты анализировали на присутствие белка CHOP и мРНК, как описано в разделе «Материалы и методы». ( B ) Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC, содержащими либо дикий тип (5’UTR-LUC), либо удаленный [5’UTR (21) -LUC] Chop 5’UTR ниже Chop промоутер.Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и анализировали на относительную активность люциферазы и относительный уровень мРНК LUC, как описано в разделе «Материалы и методы». ( C ) Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями, содержащими промотор CMV, управляющий конструкцией LUC, содержащей или не содержащей Chop 5’UTR. CHOP 5’UTR клонировали через +6 нуклеотидов после стартового сайта транскрипции. Относительное содержание мРНК Luc не зависело от CHOP 5’UTR ( t -тест, n > 3, ** = P <0.0001, NS = не имеет значения).

Рисунок 1. Последовательность Chop 5’UTR репрессирует трансляцию нижестоящих кодирующих последовательностей. ( A ) Клетки NIH-3T3 инфицировали рекомбинантным ретровирусом, экспрессирующим под контролем промотора CMV меченую ORF для CHOP, содержащую 5’UTR человека Chop (5’UTR-9E10-CHOP, дорожка 3 ) или нет [5′UTR (Δ) –9E10 – CHOP; дорожка 2]. Контрольный эксперимент проводили путем заражения клеток пустым вирусом (нетрансфицированный, дорожка 1).Затем клетки инкубировали в течение 4 ч с 2,5 мкг / мл туникамицина или без него. На схеме конструкции стрелка представляет сайт начала транскрипции. Белковые экстракты анализировали на присутствие белка CHOP и мРНК, как описано в разделе «Материалы и методы». ( B ) Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC, содержащими либо дикий тип (5’UTR-LUC), либо удаленный [5’UTR (21) -LUC] Chop 5’UTR ниже Chop промоутер. Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и анализировали на относительную активность люциферазы и относительный уровень мРНК LUC, как описано в разделе «Материалы и методы».( C ) Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями, содержащими промотор CMV, управляющий конструкцией LUC, содержащей или не содержащей Chop 5’UTR. CHOP 5’UTR клонировали через +6 нуклеотидов после стартового сайта транскрипции. На относительное содержание мРНК Luc не влиял CHOP 5’UTR ( t -тест, n > 3, ** = P <0,0001, NS = не значимо).

Рисунок 2. CHOP 5’UTR содержит консервативную uORF.Выравнивание последовательностей области 5’UTR транскрипта Chop человека, мыши и хомяка. ( A ) Нуклеотидная последовательность, ( B ) аминокислотная последовательность. Указаны кодоны uAUG и стоп-кодон. Показаны консервативные нуклеотиды или аминокислоты, а нуклеотидная последовательность uORF заключена в рамку.

Рис. 2. CHOP 5’UTR содержит консервативную uORF. Выравнивание последовательностей области 5’UTR транскрипта Chop человека, мыши и хомяка.( A ) Нуклеотидная последовательность, ( B ) аминокислотная последовательность. Указаны кодоны uAUG и стоп-кодон. Показаны консервативные нуклеотиды или аминокислоты, а нуклеотидная последовательность uORF заключена в рамку.

Рисунок 3. Мутации в uAUG отменяют репрессорный эффект 5’UTR. Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC, содержащими [uAUG (+)] дикого типа или мутантный Chop 5’UTR ниже промотора CMV.AUG, показанные на рисунке 2, были мутированы индивидуально (uAUG # 1, uAUG2, uAUG # 3) или все вместе [uAUG (-)]. На схеме конструкции стрелка представляет сайт начала транскрипции, а открытая рамка показывает uORF. Через 48 часов после трансфекции клетки обрабатывали трипсином, затем половину использовали для анализа активности люциферазы и β-галактозидазы, а вторую половину использовали для экстракции РНК и количественного определения транскриптов. Относительные активности LUC и уровни мРНК определяли как отношение LUC / βGAL, как описано в разделе «Материалы и методы».(Активность LUC: t -тест, n > 5, ** = P <0,0001, NS = несущественно; LUC мРНК: t -test, n = 3, NS = несущественно) .

Рисунок 3. Мутации в uAUG отменяют репрессорный эффект 5’UTR. Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC, содержащими [uAUG (+)] дикого типа или мутантный Chop 5’UTR ниже промотора CMV. AUG, показанные на рисунке 2, были мутированы индивидуально (uAUG # 1, uAUG2, uAUG # 3) или все вместе [uAUG (-)].На схеме конструкции стрелка представляет сайт начала транскрипции, а открытая рамка показывает uORF. Через 48 часов после трансфекции клетки обрабатывали трипсином, затем половину использовали для анализа активности люциферазы и β-галактозидазы, а вторую половину использовали для экстракции РНК и количественного определения транскриптов. Относительные активности LUC и уровни мРНК определяли как отношение LUC / βGAL, как описано в разделе «Материалы и методы». (Активность LUC: t -тест, n > 5, ** = P <0.0001, NS = не имеет значения; МРНК LUC: t -тест, n = 3, NS = не значимо).

Рисунок 4. Трансляция начинается с кодона uORF AUG. Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC, содержащими либо (1) LUC ниже промотора CMV, либо (2) конструкцию, содержащую слияние CHOP-uORF / LUC в рамке считывания ниже промотора CMV. Через семьдесят два часа после трансфекции готовили лизаты цельных клеток и анализировали на содержание белка люциферазы вестерн-блоттингом, как описано в разделе «Материалы и методы».

Рис. 4. Трансляция начинается с кодона uORF AUG. Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC, содержащими либо (1) LUC ниже промотора CMV, либо (2) конструкцию, содержащую слияние CHOP-uORF / LUC в рамке считывания ниже промотора CMV. Через семьдесят два часа после трансфекции готовили лизаты цельных клеток и анализировали на содержание белка люциферазы вестерн-блоттингом, как описано в разделе «Материалы и методы».

Рисунок 5. Репрессия трансляции с помощью Chop uORF нарушается удлиненной uORF. Конструкции, показанные на этом рисунке, являются производными CMV – 5′UTR – LUC (1). (2) uAUG # 2 был мутирован в оптимальном консенсусном стартовом сайте (gccgccaccAUGg). В следующей конструкции конструкция STOPmt (3) была сгенерирована мутацией стоп-кодона uORF и введением сдвига рамки на 1 нт для создания расширенной uORF, которая не находится в рамке с ORF LUC. CHOP 5’UTR и кодирующая последовательность LUC представлены для каждой конструкции, а uORF заключен в рамку.Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и анализировали на относительную активность LUC и уровень мРНК, как описано в разделе «Материалы и методы».

Рис. 5. Трансляционная репрессия Chop uORF нарушается удлиненной uORF. Конструкции, показанные на этом рисунке, являются производными CMV – 5′UTR – LUC (1). (2) uAUG # 2 был мутирован в оптимальном консенсусном стартовом сайте (gccgccaccAUGg). В следующей конструкции конструкция STOPmt (3) была сгенерирована мутацией стоп-кодона uORF и введением сдвига рамки на 1 нт для создания расширенной uORF, которая не находится в рамке с ORF LUC.CHOP 5’UTR и кодирующая последовательность LUC представлены для каждой конструкции, а uORF заключен в рамку. Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и анализировали на относительную активность LUC и уровень мРНК, как описано в разделе «Материалы и методы».

Рисунок 6. Трансляционная репрессия с помощью Chop uORF не зависит от межцистронной области. Конструкции экспрессии, содержащие 5’UTR либо в форме дикого типа (5), либо мутировавшие в uAUG (6), использовали для мутации интерцистронной области.Стрелки представляют точечную мутацию uAUG. Когда присутствует uORF, заключен в рамку. Эти конструкции трансфицировали в клетки HeLa, затем через 48 часов после трансфекции клетки собирали. Относительные активности LUC и уровни мРНК анализировали, как описано выше. В плазмиде ICmt межцистронная область CHOP была заменена последовательностью LacZ, не содержащей AUG [(3) и (4)]. Контекст инициации LUC AUG не был изменен. Плазмиды, мутировавшие в AUG # 3, приведены в качестве контроля (1) (2).Спейсер длиной 47 п.н. [(7) и (8)] или 140 п.н. [(9) и (10)], не содержащий кодона AUG, был введен в межцистронную область мутировавшей плазмиды pCMV – 5’UTR – LUC или не на uAUG. В конструкциях ΔIC межцистронная область была удалена [(11) и (12)]. Мутации не влияют на консенсусную последовательность Козака LUC AUG.

Рис. 6. Трансляционная репрессия с помощью Chop uORF не зависит от межцистронной области. Конструкции экспрессии, содержащие 5’UTR либо в форме дикого типа (5), либо мутировавшие в uAUG (6), использовали для мутации интерцистронной области.Стрелки представляют точечную мутацию uAUG. Когда присутствует uORF, заключен в рамку. Эти конструкции трансфицировали в клетки HeLa, затем через 48 часов после трансфекции клетки собирали. Относительные активности LUC и уровни мРНК анализировали, как описано выше. В плазмиде ICmt межцистронная область CHOP была заменена последовательностью LacZ, не содержащей AUG [(3) и (4)]. Контекст инициации LUC AUG не был изменен. Плазмиды, мутировавшие в AUG # 3, приведены в качестве контроля (1) (2).Спейсер длиной 47 п.н. [(7) и (8)] или 140 п.н. [(9) и (10)], не содержащий кодона AUG, был введен в межцистронную область мутировавшей плазмиды pCMV – 5’UTR – LUC или не на uAUG. В конструкциях ΔIC межцистронная область была удалена [(11) и (12)]. Мутации не влияют на консенсусную последовательность Козака LUC AUG.

Рисунок 7. Ингибирование трансляции uORF зависит от его пептидной последовательности. ( A ) Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC [происходящими из CMV-5’UTR-LUC (1) (2)], мутантными в последовательности uORF.Через 48 часов после трансфекции клетки собирали, затем анализировали относительную активность LUC и уровни мРНК. Плазмиды содержат 5’UTR либо в форме дикого типа, либо с мутациями по uAUG # 1 и AUG # 2. Стрелки представляют точечную мутацию uAUG. Когда он присутствует, uORF заключен в рамку. Точечные мутации кодирующей последовательности uORF обозначены звездочками. В первом наборе конструкций стоп-кодон был введен в нуклеотид +52, кодон UGG заменен кодоном UGA (3) и (4), образуя пептид из трех аминокислот.Во втором наборе конструкций последовательность синтезированного пептида мутировали путем введения сдвига рамки считывания в нуклеотидную последовательность (5) и (6). Одно основание было введено после AUG # 2, а одно основание было удалено непосредственно перед стоп-кодоном. Мутация не влияет на консенсусную последовательность Козака AUG # 2. Мутировавший uORF отмечен рамкой и заштрихован. В последнем наборе конструкций мы создали «молчащую мутацию» в кодирующей последовательности uORF, которая модифицирует последовательность мРНК, но не аминокислотную последовательность [мы мутировали 13 нуклеотидов, расположенных в последней части последовательности uORF; (7) и (8)].( B ) Клетки HeLa временно котрансфицировали 0,5 мкг репортерной плазмиды [CMV – 5′UTR – uAUG (-) — LUC] и увеличивающимися количествами (0, 0,5, 1, 2, 3 и 4 мкг) вектора экспрессии uORF CHOP, кодирующего пептид uORF (pCMV – uORF). В контрольном эксперименте этот вектор экспрессии был мутирован в AUG # 1 и AUG # 2 [pCMV – uORF – AUG (-)]. Общее количество экспрессионного вектора поддерживали постоянным путем добавления пустого вектора (pCMV). Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и анализировали относительную активность LUC.

Рисунок 7. Ингибирование трансляции uORF зависит от его пептидной последовательности. ( A ) Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC [происходящими из CMV-5’UTR-LUC (1) (2)], мутантными в последовательности uORF. Через 48 часов после трансфекции клетки собирали, затем анализировали относительную активность LUC и уровни мРНК. Плазмиды содержат 5’UTR либо в форме дикого типа, либо с мутациями по uAUG # 1 и AUG # 2. Стрелки представляют точечную мутацию uAUG.Когда он присутствует, uORF заключен в рамку. Точечные мутации кодирующей последовательности uORF обозначены звездочками. В первом наборе конструкций стоп-кодон был введен в нуклеотид +52, кодон UGG заменен кодоном UGA (3) и (4), образуя пептид из трех аминокислот. Во втором наборе конструкций последовательность синтезированного пептида мутировали путем введения сдвига рамки считывания в нуклеотидную последовательность (5) и (6). Одно основание было введено после AUG # 2, а одно основание было удалено непосредственно перед стоп-кодоном.Мутация не влияет на консенсусную последовательность Козака AUG # 2. Мутировавший uORF отмечен рамкой и заштрихован. В последнем наборе конструкций мы создали «молчащую мутацию» в кодирующей последовательности uORF, которая модифицирует последовательность мРНК, но не аминокислотную последовательность [мы мутировали 13 нуклеотидов, расположенных в последней части последовательности uORF; (7) и (8)]. ( B ) Клетки HeLa временно котрансфицировали 0,5 мкг репортерной плазмиды [CMV – 5′UTR – uAUG (-) — LUC] и увеличивающимися количествами (0, 0,5, 1, 2, 3 и 4 мкг) вектора экспрессии uORF CHOP, кодирующего пептид uORF (pCMV – uORF).В контрольном эксперименте этот вектор экспрессии был мутирован в AUG # 1 и AUG # 2 [pCMV – uORF – AUG (-)]. Общее количество экспрессионного вектора поддерживали постоянным путем добавления пустого вектора (pCMV). Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и анализировали относительную активность LUC.

Список литературы

1 McKnight, S.L., Lane, M.D. и Gluecksohn-Waelsch, S. (

1989

Genes Dev.

3

2021

2 Умек Р.М., Фридман А.Д. и Макнайт, С. (

1991

Science

251

288

3 Цао, З., Умек, Р.М. и Макнайт, С. (

1991

Genes Dev.

5

1538

4 Биркенмайер, Э. Х., Гвинн, Б., Ховард, С., Джерри, Дж., Гордон, Дж. И., Ландшульц, В. и Макнайт, С. (

1989

Genes Dev.

3

1146

5 Батчварова Н., Ван Х.З. и Рон, Д. (

1995

EMBO J.

14

4654

6 Бароне, М.В., Крозат, А., Табаи, А., Филипсон, Л. и Рон, Д. (

1994

Genes Dev.

8

453

7 Фридман, AD. (

1996

Cancer Res.

56

3250

8 Зинзнер Х., Курода М., Ван Х., Батчварова Н., Лайтфут Р.Т., Ремотти Х., Стивенс Дж.Л. и Рон, Д. (

1998

Genes Dev.

12

982

9 Аман, П., Рон, Д., Мандал, Н., Фиоретос, Т., Хайм, С., Археден, К., Виллен, Х., Ридхольм, А. и Мительман Ф.(

1992

Genes Chromosom. Рак

5

278

10 Crozat, A., Aman, P., Mandahl, N. и Рон, Д. (

1993

Nature

363

640

11 Zinszner, H., Albalat, R. и Рон, Д. (

1994

Genes Dev.

8

2513

12 Rabbitts, T.H., Forster, A., Larson, R. и Натан, П. (

1993

Nature Genet.

4

175

13 Панагопулос, И., Хоглунд, М., Мертенс, Ф., Мандаль, Н., Мительман, Ф. и Аман, П. (

1996

Онкоген

12

489

14 Панагопулос, И., Аман, П., Мертенс, Ф., Мандал, Н., Ридхольм, А., Бауэр, Х.Ф. и Мительман Ф. (

1996

Genes Chromosom. Рак

17

102

15 Ван, X.З., Курода, М., Сок, Дж., Батчварова, Н., Киммел, Р., Чанг, П., Зинзнер, Х. и Рон, Д. (

1998

EMBO J.

17

3619

16 Рон, Д. и Хабенер, Дж. Ф. (

1992

Genes Dev.

6

439

17 Fawcett, T.W., Eastman, H.B., Martindale, J.L. и Холбрук, штат Нью-Джерси. (

1996

J. Biol. Chem.

271

14285

18 Убеда, м., Вальехо, м. и Хабенер, Дж. Ф. (

1999

Мол. Клетка. Биол.

19

7589

19 Люти, J.D. и Холбрук, штат Нью-Джерси. (

1992

Cancer Res.

52

5

20 Гайтон, К.З., Сюй, К. и Холбрук, штат Нью-Джерси. (

1996

Biochem. J.

314

547

21 Халлек, М.М., Холбрук, штат Нью-Джерси, Скиннер, Дж., Лю, Х. и Стивенс, Дж. (

1997

Шапероны клеточного стресса

2

31

22 Карлсон, С.Г., Фосетт, Т.В., Бартлетт, Д.Д., Бернье, М. и Холбрук, штат Нью-Джерси. (

1993

Мол. Клетка. Биол.

13

4736

23 Брюа, А., Жусс, К., Ван, Х.З., Рон, Д., Феррара, М. and Fafournoux, P. (

1997

J. Biol. Chem.

272

17588

24 Jousse, C., Bruhat, A., Harding, H.P., Ferrara, M., Ron, D. and Fafournoux, P. (

1999

FEBS Lett.

448

211

25 Сильвестр, S.L., Ap Rhys, C.M., Luethy-Martindale, J.D. и Холбрук, штат Нью-Джерси. (

1994

J. Biol. Chem.

269

20119

26 Ли, К. К., Клопп, Р. Г., Вайндрух, Р. и Prolla, T.A. (

1999

Science

285

1390

27 Bartlett, J.D., Luethy, J.D., Carlson, S.G., Sollott, S.J. и Холбрук, штат Нью-Джерси. (

1992

J. Biol. Chem.

267

20465

28 Дэвис, Л.Г., Дибнер, доктор медицины. и Бэтти Дж. (

1986

29 Холл, К.В., Джейкоб, П.Е., Рингольд, Г.М. и Ли, Ф. (

1983

J. Mol. Прил. Genet.

2

101

30 Брюа, А., Жусс, К., Карраро, В., Реймольд, А.М., Феррара, М. and Fafournoux, P. (

2000

Мол. Клетка. Биол.

20

7192

31 де Вет, Дж. Р., Вуд, К. В., ДеЛука, М., Хелински, Д. и Subramani, S.(

1987

Мол. Клетка. Биол.

7

725

Козак, 32, м. (

1986

Ячейка

44

283

33 Козак, м. (

1987

J. Mol. Биол.

196

947

34 Гебалле, А.П. (

1996

173

35 Моррис, Д. и Гебалле А. (

2000

Мол. Клетка. Биол.

20

8635

36 Козак, м. (

1995

Proc. Natl Acad. Sci. США

92

7134

37 Козак, м. (

1989

Мол. Клетка. Биол.

9

5073

38 Линкольн А.Дж., Мончак Ю., Уильямс С.С. и Джонсон П.Ф. (

1998

J. Biol. Chem.

273

9552

39 Цао, Дж. и Гебалле А. (

1996

Мол. Клетка. Биол.

16

603

40 Ван, З. и Sachs, M.S. (

1997

J. Biol. Chem.

272

255

41 Reynolds, K., Zimmer, A.M. и Циммер А. (

1996

J. Cell Biol.

134

827

42 Луо, З. и Sachs, M.S. (

1996

Дж. Бактериол

178

2172

43 Manzella, J.M. и Блэкшир, П.Дж. (

1990

J. Biol. Chem.

265

11817

44 Ruan, H., Hill, J.R., Fatemie-Nainie, S. и Моррис, Д. (

1994

J. Biol. Chem.

269

17905

45 Parola, A.L. и Кобылка Б. (

1994

J. Biol. Chem.

269

4497 ​​

46 Delbecq, P., Werner, M., Feller, A., Filipkowski, R.K., Messenguy, F. и Пиерард, А. (

1994

Мол. Клетка. Биол.

14

2378

47 Schleiss, M.R., Degnin, C.R. и Гебалле А. (

1991

J. Virol.

65

6782

48 Дегнин К.Р., Шлейсс М.Р., Цао Дж. и Гебалле А. (

1993

J. Virol.

67

5514

49 Цао, Дж. и Гебалле А. (

1995

J. Virol.

69

1030

Козак, 50, м. (

1987

Мол. Клетка. Биол.

7

3438

51 Речави, Г., Гивол, Д. и Ханаани, Э. (

1982

Nature

300

607

52 Сталь, Л.Ф., Телли, Д.Л., Леонард, Дж., Райс, Б.А., Монахи, Б. и Sawicki, J.A. (

1996

Различия в росте клеток.

7

1415

53 Март, Дж. Д., Оверелл, Р. У., Мейер, К. Э., Кребс, Э. Дж. и Перлмуттер Р. (

1988

Природа

332

, 171–

54 Hinnebusch, A.G. (

1997

J. Biol. Chem.

272

21661

55 Hinnebusch, A.G. (

1994

Trends Biochem. Sci.

19

409

56 Ruan, H., Шанц, Л.М., Пегг, А. и Моррис, Д. (

1996

J. Biol. Chem.

271

29576

57 Бернштейн Дж., Шефлер И. и Элрой-Стейн, О. (

1995

J. Biol. Chem.

270

10559

Saddle Ranch Chop House | Стейки — Bulls

We Care at Saddle Ranch…

ДОБРО ПОЖАЛОВАТЬ, ГОСТИ С СЕДЛОВОГО РАНЧА

Мы внедряем следующие протоколы безопасности. Здоровье и безопасность наших гостей и членов команды всегда являются нашим главным приоритетом, и мы продолжим принимать все необходимые меры для обеспечения этого.

ЧТО ВЫ МОЖЕТЕ ЖДАТЬ ОТ НАС:

Здоровые члены команды
Постоянные проверки здоровья всех членов команды перед каждой сменой, включая проверку температуры с помощью термометра.

Чистые рестораны
Столы, стулья, стойки для напитков, столешницы, туалеты, подъезды и все часто используемые поверхности регулярно очищаются и дезинфицируются.

Социальное дистанцирование
Изменена планировка гостиной и столовой.

Защитное снаряжение
Надлежащие защитные маски и перчатки для каждого члена команды.

Меню
Одноразовые бумажные меню.

Частое мытье рук
Все члены команды часто моют руки во время смены.

Дезинфицирующее средство для рук
Множество диспенсеров в ресторанах и на рабочих местах.

Уведомление о посадке
Отправка текстового сообщения на персональные устройства наших гостей, чтобы наши гости могли ждать за пределами ресторана.

ЧТО МЫ ЦЕНИМ ОТ ВАС (НАШИ ГОСТИ):

Здоровые гости
Если вы испытываете симптомы респираторного заболевания, включая жар или кашель, или если в течение последних четырнадцати (14) дней у вас был тесный контакт с кем-то с диагнозом COVID-19, просим вас пообедать с нами в другое время.Вы также можете позвонить нам по телефону (Sunset 323-656-2007) или (Orange 657-221-3136), чтобы вам доставили ваш заказ на вынос, или вы можете посетить наш веб-сайт, чтобы узнать о других вариантах доставки.

Планируйте вперед
Если возможно, сделайте предварительный заказ. Войдите на сайт thesaddleranch.com

Не собирайтесь
В главном входе / вестибюле, в баре, в столовой или во внутреннем дворике.

Дайте товарищам-гостям их пространство
Сохраняйте физическое расстояние не менее шести футов (6 футов) от всех гостей, которые не входят в вашу группу.

Ношение маски
Пожалуйста, надевайте маску при входе, сидении или прогулке по помещению ресторана. Мы просим не снимать маску, если вы не едите или не пьете.

Еда должна быть заказана
Все гости должны есть

Барная стойка закрыта
Не сидеть и не стоять в баре. все блюда и напитки должны быть за столом. (Только для округа Лос-Анджелес)

… Вместе мы можем сохранить здоровье и безопасность друг друга.

Хорошо, парк Кэла Андерсона ** технически ** закрыт, в то время как очистка CHOP продолжается — но кому-то нужно полить протестные сады

Cal Anderson Park открыт — в зависимости от того, какой вход вы используете, и от вашей готовности быть вытесненными рабочей бригадой Seattle Parks или сотрудником полиции Сиэтла . Ведь кому-то нужно поливать садовые участки ЧОП.

CHS сообщал ранее на этой неделе о проводимых ремонтных и очистных работах по восстановлению E Pine и Cal Anderson, а также о некоторых непредвиденных последствиях благих намерений, которые оставили у организаторов Black Life Matters плохое предчувствие по поводу приверженности города достижению целей Движение.

Seattle Parks ответил, чтобы прояснить, что Кэл Андерсон все еще технически закрыт для публики.

«Парк пока остается закрытым», — сказал пресс-секретарь CHS. «У наших бригад есть как минимум еще одна неделя (может быть, две) работы — устранить повреждения убежища и туалета, отремонтировать ирригационную систему, а также провести дальнейший ремонт и профессиональную очистку газонного поля, а также дополнительное удаление граффити». Городские власти заявляют, что они также работают над сохранением некоторых произведений искусства ЧОП и «увековечивают аспекты общественных протестов в парке Кэла Андерсона, такие как сад, искусство и / или уголок оратора».”

CHS обнаружил, что парк используется соседями и посетителями, гуляющими или берущими собак для возни. Мы также слышали, как несколько человек попросили полицию покинуть парк — некоторые, ах, во время пикника.

Некоторым жильцам потребуется доступ в пространство. Сиэтл Паркс сообщает соседям, что общественные садовые участки, заложенные городским фермером Маркусом Хендерсоном в парке в течение нескольких недель пребывания в ЧОПе и кемпинга, не будут обслуживаться городским персоналом.

«Текущий план состоит в том, чтобы оставить сад на месте до позднего летнего / осеннего сбора урожая, а затем поработать с Маркусом и заинтересованным сообществом над долгосрочным планом», — сказал CHS представитель парков.

Сообщается, что город поливает некоторые участки — и мы видели несколько волонтерских усилий городских служащих — но жителей поощряют помогать ухаживать за участками.

LPL изучает рабочие процессы консультантов и принимает отзывы о том, как можно упростить, оптимизировать и интегрировать другие части своей технологии, чтобы помочь консультантам тратить меньше времени на административные и офисные задачи.

LPL утверждает, что новый инструмент для открытия счета обеспечивает большую прозрачность при мониторинге операций по открытию новых счетов, но не уточняет, что именно это влечет за собой. Фирма не смогла ответить на запросы о дополнительных комментариях.

На ежегодной конференции LPL Focus в августе президент и главный исполнительный директор Дэн Арнольд сказал, что такая напряженная работа занимает 40% рабочих дней консультантов — времени, которое можно было бы лучше потратить на высокоприоритетную работу, которая привлекает клиентов и дифференцирует практику.Г-н Арнольд сказал, что компания считает, что различные улучшения ClientWorks могут создать дополнительный час в день для консультантов LPL.

Несколько институциональных фирм пытаются улучшить процесс открытия счетов для консультантов. Например, в ноябре 2018 года Advisor Group представила безбумажный ввод в сеть своих независимых брокеров-дилеров.

Когда в 2018 году Эндрю Салски принял на себя руководство технологией консультантов Чарльза Шваба, он сделал цифровую адаптацию своим приоритетом; фирма работает с Envestnet Tamarac, чтобы сделать открытие счетов полностью безбумажным.Fidelity использует интеграцию с Orion Advisor Services для автоматизации открытия счета.

Открытие дома Rib & Chop House в Каспере, Вайоминг

После 18 лет работы на рынке Вайоминга отель Rib & Chop House в штате Вайоминг обрел новый дом в историческом центре города Каспер. Семейный стейк-хаус откроется в декабре этого года по адресу: 256 S. Center Street.

Wyoming’s Rib & Chop House начнет переезжать в недавно отремонтированное помещение в ноябре, в результате чего ресторан станет 10-м рестораном Rib & Chop House и 5-м местом в Вайоминге.Рестораном будут владеть и управлять Рори Сандовал, давний главный операционный директор Rib & Chop House и владелец пивоваренной компании «Соучастник», а также Крис О’Брайан, вице-президент по операциям Rib & Chop House.

«Мы не можем сказать достаточно о расположении, исторической природе здания и о проведенном необычном ремонте. Для нас это прекрасная возможность, наконец, донести концепцию Rib & Chop House до сообщества Casper и поделиться нашим гостеприимством Rocky Mountain с центральным Вайомингом.- сказал Сандовал.

С момента своего открытия в 2001 году в Ливингстоне, штат Монтана, ресторан Rib & Chop House был известен в Скалистых горах благодаря своим свежим морепродуктам, отмеченным наградами ребрышкам и сертифицированным стейкам из говядины Ангус. Сандовал сказал: «Долгосрочный успех компании обусловлен нашим стремлением подавать отличную еду и страстью к тому, чтобы доставить особые впечатления каждому гостю».

О’Брайан и его семья имеют особую связь с Каспером: «Я очень взволнован, привезя дом Rib & Chop House в Каспер.Это прекрасное сообщество, которым моя семья и я наслаждались на протяжении многих лет, и мы рады снова стать его частью. Я с нетерпением жду возможности предоставить жителям Каспера исключительный гастрономический опыт ».

Меню будет таким же, как в других заведениях Wyoming Rib и Chop House, предлагая классические стейк-хаусы в сочетании с более уникальными закусками, отличные варианты для детей и семей, а также полный бар с разливным региональным пивом.