Открыть чоп: Как открыть ЧОП – 7 ключевых шагов

Открыть чоп: Как открыть ЧОП – 7 ключевых шагов

Содержание

Регистрация частных охранных организаций (ЧОО или ЧОП)

Регистрация нового предприятия – это всегда очень ответственный вопрос, поскольку в зависимости от вида деятельности он может потребовать от исполнителя знания закона и юридических нюансов.

Так и регистрация, и перерегистрация ЧОО (ранее они назывались ЧОП) с 2009 года обладает своей спецификой, требующей профессионального юридического подхода.Если у Вас нет юридического образования или штатного юриста, то процесс регистрации ЧОО может занять много времени, сил и средств.

Но есть решение, которое позволит эффективно справиться с поставленной задачей без нервотрепки и лишних затрат времени – заказать регистрацию ЧОП (ЧОО) в центре правовой поддержки «Правовед».Наши специалисты отлично знают, что представляет собой процедура регистрации ЧОП, поэтому сделают все точно в соответствии с действующим законодательством, благодаря чему не возникнет проблем при получении лицензии в дальнейшем.

Следует отметить, что вступившие в силу поправки Федерального закона наложили на частные охранные предприятия серьезные ограничения.

Какие документы нужны для регистрации ЧОП в частную охранную организацию

Для регистрации ЧОО на базе ранее существовавшего частного охранного предприятия необходимо собрать следующие документы:

  • свидетельство о регистрации предприятия;
  • учредительные документы ЧОП;
  • свидетельство о постановке на налоговый учет;
  • выписка из ЕГРЮЛ;
  • приказы о назначении генерального директора и бухгалтера.

Единственная проблема, с которой могут столкнуться владельцы ЧОП при регистрации ЧОО – вопрос гражданства учредителей. Согласно нововведениям в законодательство, владельцем охранной организации не может быть только гражданин РФ (но не с двойным гражданством).

ПОРЯДОК РЕГИСТРАЦИИ ЧОО С НУЛЯ

Регистрация ЧОО с нуля проходит в несколько этапов:

  • Регистрация ООО, постановка на учет в налоговой службе и внебюджетных фондах, получение кодов статистики, изготовление печати, открытие расчетного счета
  • Получение лицензии на охранную деятельность
  • Получение удостоверения частного охранника

Специалисты центра правовой поддержки «Правовед» готовы оказать профессиональную помощь всем, кто желает открыть свое охранную организацию.

Мы хорошо знакомы с законодательством в этой области, поэтому гарантируем – с нами регистрация ЧОО проходит в сроки, регламентированные договором.

Доверяя нам регистрацию будущей ЧОО, наши клиенты получают массу преимуществ, среди которых:

  • уверенность, что все будет выполнено грамотно и вовремя;
  • профессиональная юридическая консультация;
  • экономия личного времени;
  • по окончании регистрации – получение пакета документов, необходимых для начала деятельности.

Как открыть частное охранное предприятие.

Частные охранные предприятия появились в России в 90-х, когда криминогенная обстановка в стране сильно ухудшилась. Сегодня охранный бизнес продолжает существовать, и предприниматели часто обращаются за услугами по защите своего имущества и интересов в ЧОПы.

Может возникнуть вопрос, а для чего кому-то платить деньги, если есть полиция? Но дело в том, что правоохранительные органы являются государственной структурой, которая служит всем гражданам, и для повседневной охраны определённых лиц или их собственности у них нет полномочий.

Если говорить про охрану предприятий, то часто предприниматели ограничиваются наймом обычных сторожей, не имеющих не средств для самообороны, ни должной квалификации.

Согласно закону № 2487-1 от 11.03.1992 года «О частной детективной и охранной деятельности» охранные предприятия могут предоставлять следующие услуги:

  • Личный телохранитель.
  • Охрана имущества и объектов, в том числе перевозимых грузов.
  • Монтаж, включая проектирование и обслуживание, технических средств охраны (камеры видеонаблюдения, системы аудио прослушки, мониторинг движущихся и стационарных объектов). Сюда входит и своевременное реагирование сотрудников ЧОПа на срабатывание сигнализации.
  • Консультирование по правильной установке специального оборудования и организации безопасности.
  • Обеспечение порядка на массовых мероприятиях (корпоративы, праздники, выставки).
  • Обеспечение контроля и порядка на предприятиях (вход, выход, недопущение  краж).

Ограничения на ведение охранной деятельности

→Открыть ЧОП в праве лишь российские граждане. У иностранцев такая возможность тоже есть, если действовать в рамках международного договора.

→Руководитель и сотрудники ЧОПа обязаны получить удостоверения частного охранника. Получить документы можно после прохождения обучения в специальных организациях.

→У руководителя должно быть высшее образование. Так же к охранной деятельности не допустят тех, у кого есть судимость и административные правонарушения.

→Охранникам ЧОП разрешается применять физическую силу и спецсредства. Что касается огнестрельного оружия, то не более одного на двух человек (регламент Пост. Прав. №587 от 14.08.1992).

Этапы открытия охранного предприятия
  1. Зарегистрировать ООО (иные формы не разрешены). Охранное предприятие не в праве заниматься какой-либо другой деятельностью, кроме основной.
  2. Необходимо внести не менее 100 тыс. руб стартового капитала, а если в планах организовать вооружённую охрану (включая спецсредства), то 250 тыс. руб
  3. Выбор конкретного вида деятельности по «ОК 029-2014 (КДЕС Ред. 2): 80.10-частная охрана, 80.20-организация систем безопасности, 80.30-детектив.
  4. Получение лицензии.

Вложения в этот бизнес будут минимальными, если охранники будут без оружия и не планируется установка охранных систем. Тогда можно ограничиться только арендой офиса, приобретением спец формы и средств связи. Другой вариант-покупка оружия и спецсредств, сейфов, автомобиля, а так же организация стрельбища.

Получение лицензии ЧОП

Регламентируется правилами:

  • «Положение о лицензировании частной … деятельности», утв. Пост. Прав. №498, 23.06.2011;
  • «Административный регламент МВД», утв. Приказом №1039, 29.09.2011.

Выдаётся лицензия в подразделениях МВД (узнать адрес ближайшего подразделения можно на сайте mvd.ru).

Документы для получения лицензии:

  • диплом и удостоверение охранника;
  • свидетельство о государственной регистрации;
  • квитанция об уплате пошлины;
  • заявление о выдаче личных карточек работников с приложением их фотографий 3*4 см, и выпиской из приказа о принятии на работу.

После того, как будет произведена выездная проверка, предпринимателю выдаётся лицензия, которая действительна 5 лет. Часто, что бы быстрее запустить бизнес, руководители не указывают в заявке вооружённую охрану, потому что будет проверяться наличие специально отведённой комнаты для хранения оружия, а так же средств защиты.

ЧОП имеет право вести свою деятельность только на территории регистрации. О начале деятельности следует информировать ОВД.

как получить, рекомендации и советы по оформлению РХИ на оружие от ЧОП «Легис»

  • Виды гражданского и служебного оружия
  • Лицензия и разрешение на оружие
  • Аннуляция документов на оружие
  • Вооруженная охрана от ЧОП ЛЕГИС

Высокая ответственность при оказании охранных услуг способствует тому, что сегодня сложно представить себе ЧОП без вооруженной охраны. В нашей статье мы рассмотрим особенности такого направления деятельности. В частности, здесь будут затронуты вопросы допустимых для использования категорий оружия и необходимых для агентства разрешительных документов.


Также в статье представлена информация об аннулировании полномочий ЧОП и ЧОО на оружие с описанием условий для восстановления таких прав. Отдельно Вы сможете ознакомиться с конкурентными преимуществами услуг вооруженной охраны от ЧОП ЛЕГИС, имеющего официальное право на покупку, хранение, ношение и использование допустимых видов гражданского и служебного оружия.

ДОПУСТИМЫЕ ВИДЫ ОРУЖИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ЧОП

На территории Российской Федерации действует целый ряд законодательных актов, указов, постановлений и других официальных документов, регулирующих деятельность охранных служб в отношении таких вопросов как приобретение, хранение, ношение и применение оружия. Одним из первых моментов, на которые следует обратить внимание ответственным сотрудникам охранной службы, являются непосредственно виды оружия, которые допустимы для использования в ЧОП.

Организация или лицо, представляющее охранное агентство, могут приобрести следующие категории оружия:

  • Газовые пистолеты и револьверы, а также огнестрельное оружие ограниченного поражения (стволы с максимальной энергией выстрела 91 Дж). Ношение и использование этих видов разрешено охранникам 5 и 6 разрядов. При этом обязательным условием здесь, как и в остальных случаях, является наличие у ЧОП РХИ (разрешение на хранение и использование) и лицензии на покупку;
  • Служебное огнестрельное оружие ограниченного поражения (стволы с максимальной энергией выстрела 150 Дж). Порядок использования этого вида оружия подразумевает только 6 (самый высокий) разряд сотрудников охранной службы.

Документ, регулирующий технические требования к используемому оружию, (Приказ МВД РФ №1020 за 2011 год, касающийся технических характеристик гражданского и служебного оружия, а также патронов к нему) дополнительно устанавливает следующие условия для приобретения:

  • используются только виды, внесенные в Государственный кадастр служебного и гражданского оружия;
  • допускается покупка исключительно оружия производства Российской Федерации;
  • максимально допустимая вместимость барабана составляет не более 10 патронов;
  • не разрешено использование оружия, позволяющего стрельбу очередями.

Обратившись к консультантам ГК ЛЕГИС, Вы сможете получить подробную информацию об используемом нашими охранниками оружии.

РАЗРЕШИТЕЛЬНЫЕ ДОКУМЕНТЫ НА ОРУЖИЕ ДЛЯ СОТРУДНИКОВ ЧОП

Для официального приобретения, хранения, ношения и применения гражданского и служебного оружия в работе сотрудников частного охранного предприятия необходимы два основных разрешительных документа. Первым из них является лицензия на оружие ЧОП. Этот документ выдается по месту регистрации охранной службы отделом лицензионно-разрешительной работы МВД. Срок действия лицензии на оружие составляет 6 месяцев, после чего возможно продление.

Для получения лицензии на оружие необходимо подготовить пакет документов, состоящий из более десятка позиций. Важно отметить, что при подготовке документации следует уделить особое внимание проверке сотрудников, которые будут задействованы в оказании услуг вооруженной охраны. Речь идет об отсутствии проблем с правоохранительными органами и здоровом психическом состоянии.

Если покупка оружия осуществляется на основании лицензии, то его хранение и использование требует отдельного разрешительного документа. Разрешение на оружие ЧОП выдается тем же лицензионно-разрешительным органом, что и лицензия на приобретение. Список документов здесь не такой объемный. Однако их общее количество гораздо больше, так как сюда входят паспорта на каждую единицу, а также медицинские заключения и персональные данные всех сотрудников ЧОП, которые будут принимать участие в вооруженной охране.

Если лицензия на оружие для ЧОП выдается на полгода, то срок действия разрешения составляет 3 года. По истечении этого времени срок продлевается уже на 5 лет, если было подано соответствующее заявление и юридический статус охранной организации не был изменен. Важно добавить, что охранником, имеющим допуск для ношения и использования оружия, может быть совершеннолетний и не имеющий судимости гражданин, прошедший обязательную государственную дактилоскопическую регистрацию.

Если Вас интересуют подробные списки документов для получения лицензии и/или разрешения на оружие в ЧОП, либо же другие вопросы, связанные с услугой вооруженной охраны, Вы можете обратиться в службу поддержки компании ЛЕГИС.

АННУЛЯЦИЯ ЛИЦЕНЗИИ И РАЗРЕШЕНИЯ НА ОРУЖИЕ

Регулирующий орган имеет право досрочно аннулировать действие лицензии и разрешения на оружие по двум причинам. Первый из них является добровольным обращением ответственного сотрудника ЧОП в связи с постоянным или временным прекращением предоставления услуг. Второй — выявление нарушений или условия судебного решения. Восстановление разрешительных документов по первому случаю, возможно в любое время. Что касается принудительного аннулирования — здесь документы восстанавливают не ранее, чем через 3 года.

УСЛУГИ ВООРУЖЕННОЙ ОХРАНЫ В ГК ЛЕГИС: НАШИ ВОЗМОЖНОСТИ

Группа компаний ЛЕГИС более четверти века предоставляет услуги вооруженной охраны в Москве, Санкт-Петербурге и Краснодаре. У нас имеются все необходимые документы. С ними можно ознакомиться на странице наград и лицензий. При этом в штате ЧОП ЛЕГИС числятся только охранники 5 и 6 разряда, имеющие официальное право на использование оружия.

За время своей деятельности мы обеспечили надежную вооруженную охрану сотням частных и корпоративных клиентов, демонстрируя максимальную надежность и ответственность. Если Вам необходима такая поддержка, закажите услугу прямо сейчас. ГК ЛЕГИС непременно станет Вашим надежным защитником, имеющим на это все официальные разрешения.

Как открыть ЧОП

Если вы печетесь о безопасности и задумываетесь, как открыть частное охранное предприятие, готовьтесь штудировать законодательство России (законы, ведомственные акты). Понятно, что иметь охрану в наше время – более чем разумное решение. Только есть ли смысл организовывать ее, или лучше обратиться в уже созданные фирмы?

Открываем ЧОП

Самое важное в деятельности частных предприятий – цивилизованный подход. Если же вы собираетесь сами предоставлять подобные услуги, то организовать это довольно трудно. Не зная нюансов, конкурировать на рынке охранных услуг практически невозможно, несмотря на его простор. Необходимо разбираться в сути деятельности, которую оказывает частное охранное предприятие, в комплектовании штата, подборе персонала, ответственности и уметь наладить работу фирмы в соответствии с правовой базой. Опыт и способность трезво оценивать ситуацию также имеют значение. Необходимо понять, что высокое материальное обеспечение ЧОП – основа безопасности фирмы, и донести это заказчику.

Чтобы открыть частное охранное предприятие в Москве, нужно готовиться к утомительному сбору документов. Учитывается образование руководителя, наличие, отсутствие судимости. Для получения лицензии охранниками требуется соответствующее образование, стаж работы в правоохранительных (схожих по деятельности) органах до трех лет; можно пройти курсы. Тщательно контролируются фирмы, где будет использоваться огнестрельное оружие. Если сотрудник не смог подтвердить свою квалификацию, он теряет право на ношение оружия.

Чтобы охватить больше клиентов, рекомендуется предоставлять разные охранные услуги:

- физическая: осмотр охранником, ручной или полуавтоматический пропускной режим;

- охрана с пультом централизованного наблюдения: нужна установка технических средств;

- обеспечение личной безопасности клиента, сопровождение грузов, документов.

Как театр начинается с вешалки, так и работа охранников начинается с усвоения инструкций. Грамотный руководитель способен составить ее таким образом, чтобы при оказании ЧОПом услуг не возникали неконтролируемые ситуации. Внимание уделяется не только действиям, но и речевым модулям. Работники всегда действуют в интересах заказчика. Они способны встретить проверяющих, гостей, оперативно реагировать при задымлениях, возгораниях и оказывать медицинскую помощь. Понятно, что руководитель ЧОП должен организовать правильный учебный процесс, который направлен на повышение квалификации персонала. Специалистов необходимо ознакомить со стандартами работы.

Хороший будущий руководитель понимает, что достигнуть высот в узкой нише можно, если заниматься своим делом. Если вас интересует исключительно финансовая сторона затеи, то лучше заняться бизнесом, а не открывать частное охранное предприятие в Москве. Если же вам необходима защита детища, обратитесь в ЧОП «Феникс», где можно рассчитывать на индивидуальный план решения сложных задач.

ЧОП «Феникс»

Для обеспечения охраны государственных, частных, коммунальных объектов звоните в «Феникс» или пишите на сайт охраны. Для нас ЧОП – это сервис и очищение пути развития клиентов. Нам уже не нужно думать, как открыть частное охранное предприятие, которое станет успешных. Люди чувствуют себя комфортно под надежной охраной работников ВВ МВД России. Персонал радует заказчиков высоким уровнем физической подготовки и устойчивости, своей понятливостью, вежливостью и молниеносной реакцией в разных экстремальных ситуациях.

Услуги предоставляются по Москве и области, предприятие имеет лицензию, а работники – необходимые служебные документы. Деятельность по договору, комплексный подход ко всем типам объектов, сохранение секретной информации, полученной при сотрудничестве – частное охранное предприятие «Феникс». Наемные работники проходят квалификационные экзамены и строгий отбор, чтобы радовать клиентов профессионализмом и надежностью.

Грамотно разработанный сайт охраны – еще одно наше преимущество.

Как открыть ЧОП. Документы для организации ЧОП....

Итого – 174913. Прибыль – 66 587. Рентабельность – 40%. Порог вхождения - 215213. По материалам статьи ...

Перед тем как создать ЧОП, внимательно ознакомьтесь с тем, какие документы вам стоит ... Свой охранный бизнес: как создать ЧОП Данная инструкция: - Определяет порядок лицензирования и осуществления контроля за ...

Москва: дорогая моя столица - Суточно.ру в Москве

Как следует, раз есть один-два больших объекта на немного постов (торгашеская сеть либо большой офисный центр) и ряд не очень больших… Для постов на свежем воздухе требуется обувь и верхняя одежда.
В следствии этого управляющий обязан быть постоянно в курсе событий и смотреть за обновлением законодательной отличалась. По закону жизнь и самочувствие секьюрити в период несения службы обязаны быть застрахованы с помощью средств фирмы. РФ, о оружии, гувд С-Петербурга и ленинградской области 1. Применение орудия и специализированных средств на оберегаемых объектах, ассортимент казенной документации на их. Цели, задачки и основы работы приватных охранных фирм, служб защищенности права и прямые обязанности приватного секьюрити. Немалая часть данных средств пойдет на закупку 1 партии продукта, также на подготовку здания для соотношения всем важным для получения лицензии гувд общепризнанным меркам.

Для получения лицензии, предоставляющей право на претворение в жизнь подготовки приватных сторожей и детективов, учредитель ноу дает в министерство образования последующие документы — копию подтвержденного в установленном порядке устава образовательного учреждения, отвечающего притязаниям ст. Ее продолжение имеет своим результатом обязанность согласно с работающим законодательством. По закону работник охранного агентства должен иметь удостоверение секьюрити. Когда дополнить маркетинговую кампанию размещением в районных печатных изданиях и бегающей с троке, месячный маркетинговый бюджет фирмы сможет составить 1,5 тыс. Его местность скрашивают храмы и храмы, дворцы и башни.

Право на образовательную работа негосударственное образовательное учреждение имеет с этапа получения лицензии.
Деяния приватных секьюрити при соблюдении правопорядка в местах проведения глобальных событий договор аренды оружейной комнаты ! Данное место воспето почти всеми писателями и стихотворцами, изображено на полотнах больших дизайнеров. Актуальным фактором в данном деле считается раскрутка и реклама!
Документация приватных детективных и охранных компаний, служб защищенности. Любой работник, который будет трудиться в санкционированном вами предприятии, обязан непременно встать на учет в органах правопорядка. При непредставлении необходимых указов и списков, документы на лицензирование у выпускников не воспринимаются… Ежеквартально оформляется справка о проведении перестрелок, коя следует сообща с докладом в улрр моб гувд (прибавление 8).

Устанавливает притязании к юридическим личикам и жителям при реализации ними законных прав, связанных с лицензированием в сфере приватной детективной и охранной работы. Ревизия исполняется методом б) запросов в информационный центр при гувд о наличии судимости или же прецедента предъявления нарекания в совершении правонарушения в) запросов в отделы кадров структурах правопорядка, учреждений и организаций по месту бывшей работы (службы) заявителя г) сбора инфы оперативно-розыскного нрава.
Улрр гуооп мвд и подтвержденная начальником, в отдельности по любой квалификации.
Там сейчас несчетное количество вероятных посетителей для хоть какого торгового центра!
Причинами аннулирования лицензии считаются и еще добровольный отказ от нее приватного детектива (сторожа) и ликвидация компании (соединения)…
Причинами для внесения записей работают копии указов управляющего оп (сб), где труженик действовал по совместительству, о его способе на работу и уходе с работы… Но допустим таковой перечень пистолета для чоп травматическое и огнестрельное орудие с урезанной областью использования, а еще гладкоствольные и короткоствольные агрегаты (по 1 штуке на 2 служащих) природно, на сбережение и внедрение такового орудия непременно надо обрести разрешение. Причиной для указа о способе на работу в ноу считаются последующие документы все документы на любую категорию формируются в отдельное дело и сберегаются в архиве на протяжении 10-ти лет… Грубо говоря новичку чопу довольно арендовать маленькое здание не в центральном регионе площадью максимум 10 кв…
Он раскрывается два раза в день днем, дабы вынести орудие в торгашеский зал, и вечерком для возвращения продукта на место сбережения. Прибавлением к указу считается перечень слушателей этой категории

. Инструкция | договор аренды оружейной комнаты

Владельцами оружейных магазинов, как правило, становятся бывшие сотрудники министерства ...

Глава 1 В первый день сентября, около двух часов пополудни, к красивому трехэтажному ...

Бизнес-идея №913. Как открыть оружейный магазин? |...

Измельчите текстовый файл с помощью VI



Как я могу нарезать текстовый файл с помощью VI?
Проблема в том, что текстовый файл используется запущенным приложением, которое помещает туда протоколирование, поэтому я не могу удалить файл, но могу писать туда.
Итак, каков же самый короткий способ (привязки клавиш) очистки текстового файла?

Спасибо

vi
Поделиться Источник Mike     17 ноября 2012 в 14:00

2 ответа


  • vi генерация порядковых номеров

    Мне нужно создать файл в vi с этим шаблоном. Есть ли способ автоматически сгенерировать эти строки с помощью первой строки run 1 end run 2 end run 3 end run 4 end run 5 end run 6 end Я всегда могу сделать это в excel, а затем преобразовать его в текстовый файл, а затем переключиться на vi , но...

  • Как сохранить текстовый файл с noeol и в формате dos с помощью vi в системе linux

    Я запускаю модель IBAMR (набор кодов для решения погруженных граничных задач) на x86_64 GNU/Linux. Файл конфигурации запуска называется input2d. Когда я открываю его с помощью vi, я нахожу: input2d [noeol][dos] 251L, 11689C Если я скомпилирую модель IBAMR без сохранения input2d, она компилируется. ..



1

там нет необходимости, чтобы открыть файл для того, чтобы очистить содержимое, просто запустите echo "" > /filepath и если есть необходимость открыть файл используйте SHIFT+V в начале файла и нажмите G, чтобы перейти в конец файла и нажмите X, чтобы очистить и :WQ для сохранения

Поделиться Saddam Abu Ghaida     17 ноября 2012 в 14:03



1

Чтобы удалить все содержимое только что открытого файла, вы можете использовать d G .

Поделиться Matthew Strawbridge     17 ноября 2012 в 14:27


Похожие вопросы:


В редакторе vi откройте файл произвольного типа с помощью произвольной программы

В редакторе vi есть очень полезная команда gf , которая позволяет открыть — в новом окне vi — файл, путь к которому находится под курсором в редакторе vi . Я пытаюсь обобщить эту функцию таким...


отредактируйте файл с помощью редактора vi в java

Я пишу программу, в которой мне нужно подключиться к удаленной машине, получить доступ к файлу и отредактировать его. Я в состоянии сделать часть telnet. Это дает мне доступ к OutputStream и...


vi текстовый поиск с исключением (linux)

У меня есть огромный лог-файл (25.3 миллионов строк) с ошибками, и я не буду искать его, не удерживая кнопку вверх. Как вы можете искать это с помощью vi? Я видел подобное на уровнях каталогов, но...


vi генерация порядковых номеров

Мне нужно создать файл в vi с этим шаблоном. Есть ли способ автоматически сгенерировать эти строки с помощью первой строки run 1 end run 2 end run 3 end run 4 end run 5 end run 6 end Я всегда могу...


Как сохранить текстовый файл с noeol и в формате dos с помощью vi в системе linux

Я запускаю модель IBAMR (набор кодов для решения погруженных граничных задач) на x86_64 GNU/Linux. Файл конфигурации запуска называется input2d. Когда я открываю его с помощью vi, я нахожу: input2d...


курсор (ы) в hex редактируется с помощью vi/vim

Я знал, что мы можем hex редактировать файл с vi/vim,, используя команды %!xxd (вызов *nix hex дампа) и %!xxd -r (выход *nix hex дампа). Проблема в том, что если я делаю некоторое редактирование...


Как открыть текстовый редактор в Windows с помощью вызова какой-либо переменной типа edit или vi из командной строки

Мне нужно использовать Windows в моей текущей работе, и я в основном был пользователем Ubuntu и Mac. Как настроить ярлыки переменных для использования в командной строке? Например, Я хочу, чтобы...


Чтение зашифрованного файла vi программно

У меня есть зашифрованный текстовый файл vi для хранения регистрационных данных DB. Теперь в моем сценарии shell я хотел, чтобы содержимое говорило grep DB_NAME login_details.txt . Как передать...


Как отредактировать текстовый файл в my terminal

Я использую Linux mint и использую команду vi для создания текстовых файлов, Теперь, когда я создал текстовый файл и сохранил его. Как мне снова вернуться к редактированию текстового файла? vi...


чтобы добавить файл с помощью vi/vim, используйте скрипт shell

Я пытаюсь написать shell, который добавит файл '.txt' с некоторыми данными (хранящимися в переменной). Это я пытаюсь сделать с помощью 'vi'. Я знаю, что есть и другие инструменты, чтобы добавить...

Chop & Go

0

Перейти к содержанию Заказ Открыть меню Закрыть меню Заказ Открыть меню Закрыть меню Заказ

Подарочная карта

Свяжитесь с нами

Присоединяйтесь

chop & go 2020

UnityTechnologies / open-project-1: Unity Открытый проект №1: Chop Chop

Добро пожаловать! Это репозиторий для первого открытого проекта Unity Open Project , инициативы, в рамках которой Unity и сообщество совместно работают над созданием небольшой демонстрации игры с открытым исходным кодом .

Первая игра, которая в настоящее время находится в разработке, - это приключенческий боевик под названием Chop Chop (подробнее).

Следите за прогрессом

  • Специальный подфорум на форумах Unity - это место, где команда Unity и все сообщество обсуждают и обсуждают идеи.
  • Дорожная карта - это центральное место, где можно узнать, что будет в игре. Также отличный способ найти задачи, в которых можно внести свой вклад!
  • Команда Unity каждые две недели проводит прямые трансляции на канале Unity на YouTube (подпишитесь, чтобы получать уведомления).Найдите прошлые в этом плейлисте.
  • Канал # open-projects в официальном Discord Unity - это место, где соавторы могут встретиться для быстрого чата и обсуждения без потоков.

Внести вклад

Мы будем рады внести ваш вклад в игру! Создаете ли вы код, искусство, повествование, звуки; чувствуете ли вы себя достаточно опытным или нет; есть, наверное, что-то, что вы можете добавить к этому.

Чтобы узнать все о вкладе, у нас есть серия коротких видеороликов, которые помогут вам начать работу с Git и с этим проектом в целом.
Кроме того, обязательно ознакомьтесь с Правилами участия. Чтобы узнать о стиле кода, иерархии сцены и стандартах организации проекта, прочтите документ «Соглашения». А для художественных работ у нас есть Art Guidelines.
⚠ Пожалуйста, напишите на форумах и ознакомьтесь с дорожной картой, прежде чем начинать работу над большим вкладом!

Если вы хотите исправить ошибок , загляните на страницу «Проблемы» в этом репозитории. Фактически, еще одна вещь, с которой вы могли бы помочь, - это провести QA-тестирование : загрузить последнюю версию игры, поиграть в нее и сообщить о проблемах на соответствующей странице.Это также отличный способ стать частью этого проекта!

Этот проект построен на Unity 2019.4 LTS , вне зависимости от того, какой последний патч доступен.

Скриншот незавершенного производства

Сыграть в игру

Просто хотите попробовать игру? Перейдите на страницу выпуска и скачайте последнюю версию.

Мы с нетерпением ждем того, что вы создадите.
- Unity Creator Advocacy team

Ингибирование трансляции CHOP пептидом, кодируемым открытой рамкой считывания, локализованной в chop 5'UTR | Исследование нуклеиновых кислот

Абстрактные

Chop представляет собой повсеместно экспрессируемый ген млекопитающих, кодирующий небольшой ядерный белок, связанный с семейством факторов транскрипции CCAAT / энхансер-связывающий белок (C / EBP).Белок CHOP играет важную роль в различных клеточных процессах, таких как рост, дифференцировка и запрограммированная гибель клеток. Экспрессия CHOP сильно увеличивается в ответ на большое количество стрессов, включая нарушение функции эндоплазматического ретикулума, повреждение ДНК и недостаток питательных веществ. В регуляцию экспрессии CHOP вовлечены многочисленные механизмы, включая транскрипционный и посттранскрипционный контроль. Мы показываем здесь, что 5'UTR транскрипта Chop играет важную роль в контроле синтеза белка CHOP.В частности, 5'UTR содержит консервативную uORF, которая кодирует пептид из 31 аминокислоты, который ингибирует экспрессию расположенной ниже ORF. Мутационный анализ 5'-лидерной области и последовательностей, кодирующих пептид, предполагает, что сам пептид ингибирует экспрессию нижележащей ORF. Такие результаты подтверждают роль uORF в ограничении доступа рибосом к расположенным ниже сайтам инициации. Что касается важности белка CHOP в регуляции клеточных функций, механизмы, которые регулируют его базальный уровень, представляют значительный интерес.

Получено повторно 17 июля 2001 г .; Пересмотрено и принято 30 августа 2001 г.

ВВЕДЕНИЕ

Chop представляет собой повсеместно экспрессируемый ген млекопитающих, кодирующий небольшой ядерный белок, относящийся к семейству факторов транскрипции CCAAT / энхансер-связывающий белок (C / EBP). Члены семейства C / EBP участвуют в регуляции процессов, относящихся к энергетическому метаболизму (1), клеточной пролиферации, дифференцировке и экспрессии генов, специфичных для определенного типа клеток (2-4).Чрезмерная экспрессия CHOP ослабляет процесс дифференцировки адипоцитов в клетках 3T3-L1 (5), приводит к остановке клеточного цикла (6) и может препятствовать запрограммированной гибели клеток (7,8). Дополнительным доказательством важности CHOP для роста клеток является наблюдение, что в подавляющем большинстве случаев миксоида и липосаркомы ген Chop структурно перестраивается, вызывая конститутивную экспрессию измененной онкогенной формы белок (9–14).

Ген Chop кодирует белок, который действует как активатор транскрипции, необходимый для экспрессии набора генов (15).Образуя гетеродимеры с другими членами семейства C / EBP, CHOP может влиять на экспрессию генов как доминантно-негативный регулятор C / EBP, так и перенаправляя гетеродимеры CHOP – C / EBP на другие последовательности (5,6,11,16, 17). Также недавно было показано, что CHOP может взаимодействовать с членами семейства факторов транскрипции, способствующих росту, включая jun-d, c- jun и c- fos , для активации промоторных элементов в соматостатине, jun-d и гены коллагеназы (18).

В самых разных клетках ген Chop индуцируется стрессом, вызывающим повреждение ДНК или снижение функции эндоплазматического ретикулума (ER), например, генотоксические агенты (19), окислительный или восстановительный стресс (20,21) и недостаток глюкозы (22).Кроме того, Chop реагирует на аминокислотную депривацию посредством пути, который отличается от каскада передачи сигналов стресса ER (23,24). У животных мРНК Chop увеличивается во время острой фазы ответа, инициированной лечением липополисахаридом (25) и во время ограничения калорийности (26).

В каждом протестированном типе клеток базальный уровень экспрессии CHOP очень низкий, почти не определяемый. Однако экспрессия CHOP может быстро индуцироваться в ответ на различные стимулы. Принимая во внимание важные последствия его экспрессии, можно ожидать, что уровень CHOP сильно регулируется. Ранее было показано, что индукция Chop включает как транскрипционные, так и посттранскрипционные механизмы (23,27). Эти наблюдения привели нас к исследованию потенциальной роли трансляционного контроля в определении уровня экспрессии CHOP. В этом исследовании мы сообщаем, что открытая рамка считывания (uORF), расположенная в 5'-нетранслируемой области Chop (5'UTR), ингибирует скорость трансляции CHOP.Анализ механизмов, с помощью которых uORF Chop ингибирует нисходящую трансляцию, показывает, что uORF кодирует функциональный полипептид, который ингибирует трансляцию нисходящего цистрона.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Олигонуклеотиды

Олигонуклеотидов были от Eurogentec (Бельгия). Когда требовались двухцепочечные олигонуклеотиды, равное количество молей комплементарных цепей нагревали до 90 ° C в течение 1 мин и отжигали путем медленного охлаждения до комнатной температуры.

Культура клеток и условия обработки

клеток HeLa культивировали при 37 ° C в среде Игла F12, модифицированной Дульбекко (DMEM F12; Sigma), содержащей 10% декомплементарной фетальной телячьей сыворотки (FBS).

Трансфекция ДНК

Клетки высевали на чашки диаметром 60 мм и трансфицировали методом соосаждения фосфатом кальция, как описано ранее (28). Плазмиду LUC (5 мкг) трансфицировали в клетки вместе с 0,25 мкг pCMV-β-gal, плазмиды, несущей бактериальный ген Lac-Z (кодирующий β-галактозидазу), слитый с районом раннего энхансера / промотора цитомегаловируса человека. в качестве внутреннего контроля.Клетки подвергали воздействию осадка в течение 16 ч, дважды промывали PBS, а затем инкубировали с DMEM F12, содержащей 10% FBS. Через 48 часов после трансфекции клетки обрабатывали трипсином и разводили в 1 мл PBS. Для каждого образца 500 мкл клеточной суспензии использовали для анализа люциферазы и 500 мкл использовали для выделения РНК и количественного определения транскриптов.

Анализ люциферазы

Трипсинизированные клетки осаждали коротким центрифугированием и супернатант отбрасывали. Затем клетки суспендировали в 150 мкл буфера для лизиса (Promega) и центрифугировали при 13 000 g в течение 2 минут.Двадцать микролитров супернатанта анализировали на люциферазную активность (PRODEMAT, Anduze, Франция). Активность β-галактозидазы измеряли, как описано ранее (29). Относительную активность люциферазы выражали как отношение относительная световая единица / относительная β-галльная единица. Все значения являются средними, рассчитанными по результатам как минимум трех независимых экспериментов.

Выделение РНК и количественное определение транскриптов LUC и LacZ

РНК

получали из осадка клеток с использованием набора QIAGEN RNeasy Mini Kit.После количественного определения общей РНК путем измерения OD при 260 нм 0,5 мкг РНК обрабатывали 1 ед. ДНКазы I (Gibco BRL). Обратную транскрипцию с использованием случайных праймеров (Hexanucleotides Mix; Boehringer Mannheim) выполняли с Superscript RT II (Gibco BRL) в соответствии с протоколом производителя. Полученную первую цепь количественно оценивали с использованием системы количественной ПЦР в реальном времени: анализ TaqMan на системе обнаружения последовательностей ABI PRISM 7700 (химия красителя, связывающего двухцепочечную ДНК SYBR Green I).Следующие олигонуклеотиды были использованы для амплификации фрагментов кДНК длиной 103 и 105 п.н., соответствующих LUC или LacZ, соответственно: праймеры LUC, 5'-AGG GAC AAG ACA ATT GCA CTG A-3 'и 5'-TGC GAG AAT CTC АЧГ ЦАГ Г-3 ′; Праймеры LacZ, 5'-GCT GCA TAA ACC GAC TAC ACA AA-3 'и 5'-GCC GCA CAT CTG AAC TTC AG-3'. Образцы сначала нагревали при 50 ° C в течение 10 минут, а затем при 95 ° C в течение 10 минут и амплифицировали в течение 40 циклов следующим образом: 95 ° C в течение 15 секунд, 60 ° C в течение 30 секунд, 72 ° C в течение 30 секунд. Относительный уровень мРНК LUC выражали как отношение мРНК LUC / мРНК LacZ.

Чтобы проверить методы, использованные в этих экспериментах, мы подтвердили, что содержание белка, кодируемого одним репортерным геном, пропорционально его содержанию мРНК в отсутствие регуляции трансляции (результаты не показаны). Этот эксперимент был проведен после трансфекции различных количеств плазмид pCMV-β-gal и pCMV-LUC. Мы можем заключить, что активность Luc и β-gal и содержание транскрипта точно измерены.

Экспрессия меченого белка CHOP

Идентичный белок CHOP, меченный 9E10, экспрессировали из рекомбинантных ретровирусных векторов (pBABE.puro), в которых либо отсутствовал 5'UTR Chop , либо содержался 5'UTR человеческого Chop . Конструирование ретровируса, экспрессирующего CHOP, проводили, как описано ранее (5). Клетки NIH-3T3, инфицированные рекомбинантным ретровирусом, отбирали по устойчивости к пуромицину. Уровни белка CHOP в клетках NIH-3T3, стабильно экспрессирующих равные количества ретровирусной мРНК, измеряли с помощью вестерн-иммуноблоттинга с использованием кроличьей поликлональной антисыворотки против CHOP.

Плазмидные конструкции

Все конструкции были созданы с помощью ПЦР с использованием полимеразы Pfu (Stratagene), прямого и обратного праймеров, содержащих соответствующие сайты рестрикции на их 5'-конце. Затем амплифицированные фрагменты клонировали в основную репортерную конструкцию pGL3 (Promega) с использованием соответствующих сайтов рестрикции.

Конструкция CHOP-5'UTR-LUC (рис. 1B) была создана путем вставки +6-170 ПЦР-фрагмента 5'UTR из Chop (полученного с использованием прямого праймера Afl II-конца и Hin, dIII-концевой обратный праймер) между сайтами рестрикции Afl II и Hin dIII конструкции -649 / + 91CHOP-LUC (30), плазмиды, содержащей промотор CHOP выше LUC.Конструкция CHOP – 5′UTR (21) –LUC (рис. 1B) была создана путем замены фрагмента 5′UTR с +6 на +170 удаленным фрагментом (от +6 до +21), полученным с помощью ПЦР с использованием Afl II. прямой праймер с концом и обратный праймер с концом Hin, dIII.

Конструкция CMV – LUC (рис. 1С и 4), содержащая ранний энхансер / промоторную область цитомегаловируса человека (CMV) (от –600 до +64), была получена с помощью ПЦР с использованием прямого праймера Xho, с I-концом и Hin. Обратный праймер с dIII-концом.Затем амплифицированный фрагмент клонировали в pGL3 по сайтам рестрикции Xho I и Hin dIII.

Конструкция CMV – 5'UTR – LUC [конструкция uAUG (+); Фиг. 1C, 3, 5 (1), 6 (5) и 7A (1)], содержащий промотор CMV человека (от –600 до +6) и 5'UTR Chop (от +6 до +170). путем клонирования ПЦР-фрагмента промотора CMV с использованием прямого праймера Xho, I-конца и обратного праймера Afl II-конца между сайтами Xho I и Afl II CHOP-5'UTR-LUC.

Мутированные конструкции CMV-5'UTR-LUC (фиг. 3) были получены путем клонирования мутированных фрагментов ПЦР от +6 до +170 5'UTR с использованием прямого праймера дикого типа или мутантных Afl II-конца и диких -тип или мутировавший Hin обратный праймер с dIII-концом, генерирующий мутацию первого uAUG (конструкция uAUG # 1), второго uAUG (конструкция uAUG # 2), третьего uAUG (конструкция uAUG # 3) и трех uAUG [ uAUG (-) конструкция] между сайтами Afl II и Hin dIII конструкции CMV – 5'UTR – LUC. Для каждой мутации AUG A AUG был заменен T.

Конструкция слияния CMV – uORF / LUC (рис. 4) в рамке считывания была создана путем вставки фрагмента ПЦР, амплифицированного из CMV – 5'UTR – LUC. конструкция с использованием праймеров на I-конце Nco , 5'-GCG CCA TGG TGA TGC GGT TTT GG-3 '(прямой праймер) и 5'-CGC CCA TGG CTG CAG TTG GAG CAG TCT GGA AAA GC-3' (обратный праймер, в котором стоп-кодон 5'UTR заменен сайтом Nco I), между расщепленной Nco I конструкцией CMV-5'UTR-LUC.Это клонирование приводит к слиянию стоп-кодона 5'UTR Chop и кодона ATG кодирующей последовательности LUC.

Конструкция STOPmt [Рис. 5 (3)] был получен путем вставки фрагмента Afl II / Hin dIII между сайтами Afl II и Hin dIII конструкции CMV-5'UTR-LUC. Этот фрагмент был получен путем слияния двух ПЦР-фрагментов: (i) ПЦР-фрагмент, амплифицированный из конструкции CMV-5'UTR-LUC с использованием прямого праймера Afl II-конца 5'-AGA CTT AAG TCT AAG GCA CTG AGC GTA TC-3 'и обратный праймер 5'-CAT CTG CTT TCT GGT GTG GTG ATG TAT G-3' (содержащий мутацию стоп-кодона uORF) и (ii) фрагмент ПЦР, амплифицированный из CMV-5 ' Конструкция UTR-LUC с использованием прямого праймера 5'-CAT ACA TCA CCA CAC CAG AAA GCA GAT G-3 'и обратного праймера Hin с dIII-концом 5'-GCC AAG CTT CAG TTG GAT CAG T-3'. Этот фрагмент содержит мутацию стоп-кодона uORF и введение сдвига рамки считывания на 1 нт для создания расширенной uORF, которая не находится в рамке считывания с геном LUC. Слияние двух ПЦР-фрагментов было получено путем ПЦР-амплификации с первым прямым праймером и вторым обратным праймером с использованием двух уже синтезированных фрагментов в качестве матрицы.

Конструкция CMV – 5'UTR – LUC, содержащая оптимальный контекст для инициации рибосом в AUG # 2 [Рис. 5 (2)] был получен путем клонирования мутированных фрагментов ПЦР от +6 до +170 5'UTR с использованием мутантного прямого праймера Afl II-конца (замена последовательности Козака AUG # 2 следующей последовательностью: gccgccaccAUGg) и дикой -тип Hin dIII-концевые обратные праймеры между сайтами Afl II и Hin dIII конструкции CMV – 5'UTR – LUC.

Конструкция ICmt [Рис. 6 (3) и (4)] дикого типа или мутировавших в uAUG, был получен путем вставки фрагмента Afl II / Hin dIII между сайтами Afl II и Hin dIII CMV-5 '. Конструкция UTR – LUC. Этот фрагмент был получен путем слияния двух фрагментов ПЦР: (i) фрагмент ПЦР, амплифицированный из конструкции CMV – 5'UTR – LUC (дикого типа или мутировавший в uAUG # 1 и # 2) с использованием прямого Afl II праймер 5'-AGA CTT AAG TCT AAG GCA CTG AGC GTA TC-3 'и обратный праймер 5'-GCA GTT CAG GCC TCA GGT GTG GTG ATG TAT GAA G-3' и (ii) фрагмент ПЦР, соответствующий последовательность LacZ без AUG, амплифицированная из гена LACZ с использованием прямого праймера 5'-CAT CAC CAC ACC TGA GGC CTG AAC TGC CAG CTG GCG CAG G-3 'и обратного праймера Hin с dIII-концом 5'-CGC AAG CTT GCT CTG CTA CCT GCG CCA G-3 '.Слияние двух ПЦР-фрагментов было получено путем ПЦР-амплификации с первым прямым праймером и вторым обратным праймером с использованием двух уже синтезированных фрагментов в качестве матрицы. В этой конструкции сайт рестрикции Stu I был добавлен сразу после стоп-кодона.

Конструкции +47 [Рис. 6 (7) и (8)], дикого типа [uAUG (+)] или мутировавшие в uAUG [uAUG (-)] были получены путем вставки двухцепочечного 47-нуклеотидного фрагмента Hin с dIII концом (5 ′ -AAG CTT AAG GCA GAT CCC AGC GGT CAA AAC AGG CCA ATC CGC GCC GGA AGC TT-3 ′) между сайтом Hin dIII дефосфорилированного CMV – 5′UTR – LUC или CMV – 5′UTR – uAUG ( -) - плазмиды LUC соответственно.

+140 конструкций [Рис. 6 (9) и (10)], [uAUG (+)] дикого типа или мутированные в uAUG [uAUG (-)] были получены путем вставки фрагмента с dIII-концом Hin длиной 140 п.н. Этот фрагмент длиной 140 п.н. соответствует фрагменту ПЦР без AUG гена LacZ, полученному с использованием прямого праймера с концом Hin dIII (5'-GCG AAG CTT CCG GCG CGG ATT GGC CTG-3 ') и Hin dIII- обратный праймер с концами (5'-GCG AAG CTT AAG GCA GAT CCC AGC GGT CAA AAC AGG-3 ').

Конструкции ΔIC [Рис.6 (11) и (12)] были созданы из конструкций ICmt, мутировавших или не мутировавших на uAUG. Последовательность lacZ конструкций ICmt содержит сайт рестрикции Stu I, который расположен сразу после стоп-кодона uORF CHOP (см. Выше). Фрагмент Stu I– Hin dIII был удален из конструкций ICmt. Затем плазмиды затупляли и лигировали.

Конструкции uAUG (+) / Stop и uAUG (1 + 2) / Stop [Рис. 7 (3) и (4)] были получены путем вставки фрагмента Afl II / Hin dIII между сайтами Afl II и Hin dIII конструкции CMV-5'UTR-LUC. Этот фрагмент был получен путем слияния двух ПЦР-фрагментов: (i) ПЦР-фрагмент, амплифицированный из конструкции CMV – 5'UTR – LUC [uAUG (+) или uAUG (-)] с использованием прямого праймера Afl II-конца 5 '-AGA CTT AAG TCT AAG GCA CTG AGC GTA TC-3' и обратный праймер 5'-GGC TCT GTC GCT GTC ACC CGC TCA TC-3 '[замена кодона UGG uORF, расположенного на +50, стоп-кодоном (UGA)] и (ii) фрагмент ПЦР, амплифицированный из конструкции CMV-5'UTR-LUC с использованием прямого праймера 5'-GAT GAG CGG GTG ACA GCG ACA GAG CC-3 '[заменяя кодон UGG расположенного uORF на +50 стоп-кодоном (UGA)] и обратный праймер Hin, dIII-конец 5'-CGC AAG CTT GCA GTT GGA TCA GTC TGG A-3 '.Слияние двух ПЦР-фрагментов было получено путем ПЦР-амплификации с первым прямым праймером и вторым обратным праймером с использованием двух уже синтезированных фрагментов в качестве матрицы.

Конструкция uORFmt кодирующей последовательности (CDS) [фиг. 7 (5) и (6)] был получен путем клонирования фрагмента ПЦР от +6 до +170 5'UTR, содержащего мутированную последовательность uORF. Мутация была получена путем добавления одного основания после AUG # 2 (ATG AGg CGG), тогда как одно основание было удалено перед стоп-кодоном uORF (CCA CAC – TGA).ПЦР выполняли с использованием мутантного прямого праймера с концом Afl II (сдвиг рамки считывания +1 нуклеотид) и мутантного обратного праймера с концом Hin dIII (сдвиг рамки считывания -1 нуклеотид), затем фрагмент клонировали между рамками Afl II и Hin dIII сайтов конструкции CMV – 5'UTR – LUC. Для ПЦР pCMV-5'UTR-LUC, мутировавший или не мутировавший в AUG № 1 и AUG № 2, использовали в качестве шаблона (конструкция с мутацией или без мутации в AUG № 1 и AUG № 2).

«Тихая мутация» [Рис. 7A (7) и (8)] был получен путем клонирования фрагмента ПЦР по сайтам Bsu 36I и Hin dIII в конструкцию CMV-5'UTR-LUC, мутировавшую или не мутировавшую на AUG # 1 и # 2 [фиг. .7A (1) и (2)]. Фрагмент ПЦР амплифицировали с использованием обратного праймера Hin с dIII-концом 5'-GCC AAG CTT CAG TTG GAT CAG T-3 'и прямого праймера 5'-G AAC CTG AGG CGT GAA TGC TCT AGA CGA AAA TG C ATA TTT ATC CA C CAC CAC ACC TGA-3 ′. Мутировавшие нуклеотиды подчеркнуты, нуклеотиды, выделенные жирным шрифтом, не являются мутированными в последовательности мыши. Конструкцию CMV – 5′UTR – LUC использовали в качестве матрицы.

Экспрессионные векторы uORF и uAUG (-) (рис. 7B) были получены путем делеции области, кодирующей люциферазу конструкции CMV – 5′UTR – LUC и CMV – 5′UTR – uAUG (-) - LUC, соответственно ( Hin dIII / Xba I фрагмент).

Все конструкции люциферазной плазмиды перед использованием секвенировали с использованием набора для готовых реакций секвенирования цикла терминатора BigDye (Perkin Elmer) и генетического анализатора ABI PRISM 310 (Perkin Elmer) в соответствии с инструкциями производителя.

Вестерн-блоттинг

Трансфицированные клетки собирали в 150 мкл буфера для лизиса (Трис 20 мМ, pH 6,9, NP-40 0,5%, PMSF 0,5 мМ) и центрифугировали при 13 000 g в течение 2 минут. Пятьсот микрограммов (общий белок) каждого экстракта наносили на колонку mono Q HR 5/5 (ионообменная хроматография; Amersham Pharmacia), уравновешенную 30 мМ трис-HCl pH 8.0 буфер. После прохождения незамедлительных белков через колонку инициировали линейный градиент (всего 20 мл) от 0 до 0,5 М NaCl. Фракции, содержащие активность LUC, элюировали в градиенте ~ 0,2 М NaCl. После осаждения (5% TCA, 0,5% PTA) 20 мкг экстрактов разделяли с помощью SDS-PAGE на 10% (мас. / Об.) Полиакриламидном геле и электрофоретически переносили на мембрану hybond C в 25 мМ Трис / 190 мМ глицине. Мембраны блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре 5% -ным обезжиренным раствором сухого молока в буфере TN (50 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 150 мМ NaCl). Затем блоты инкубировали с антителом против LUC (1/500) в блокирующем растворе в течение ночи при 4 ° C, затем четыре раза промывали TN, содержащим 0,05% Triton X-100, и инкубировали с антителом против кролика, конъюгированным с щелочью. фосфатаза (1/5000) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем блоты обрабатывали реагентом для вестерн-блоттинга ECF (Amersham) и визуализировали с помощью системы обнаружения хемиофлуоресценции (Molecular Dynamics).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Последовательность 5'UTR

Chop репрессирует трансляцию нижестоящих кодирующих последовательностей

Чтобы определить, может ли Chop 5'UTR регулировать трансляцию ORF Chop , мы сконструировали ретровирусный вектор, экспрессирующий меченую ORF для CHOP, содержащую или не содержащую 5'UTR (рис.1А). После инфицирования клеток NIH-3T3 в контрольных клетках измеряли накопление белка CHOP и мРНК в ответ на агент (туникамицин), который индуцирует стресс ER. Как и ожидалось, содержание как мРНК, так и белка эндогенного гена Chop сильно индуцируется в ответ на лечение туникамицином. Конструкция [5′UTR (Δ) –9E10 – CHOP], содержащая ген Chop без 5′UTR, демонстрирует высокую экспрессию белка CHOP. Напротив, экспрессия CHOP сильно подавляется, когда 5'UTR вставляется между сайтом начала транскрипции и кодирующей последовательностью CHOP (5'UTR – 9E10-CHOP).Обработка туникамицином не влияет на экспрессию CHOP в обеих конструкциях, содержащих или не содержащих 5'UTR. В том же эксперименте на содержание мРНК не оказывает значительного влияния Chop 5'UTR. Аналогичные результаты были получены с использованием клеток HeLa (результаты не показаны). Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что трансляция Chop сильно репрессируется лидерной областью транскрипта Chop , но эта область не участвует в регуляции экспрессии Chop в ответ на стресс.

Затем мы исследовали, может ли Chop 5'UTR репрессировать нижележащую ORF в другом контексте (рис. 1B и C). Репортерный ген LUC, управляемый либо CMV, либо промотором Chop , использовали вместо Chop , и конструкции трансфицировали в клетки HeLa. AUG гена LUC находится в оптимальном контексте для инициации рибосомами. Наши результаты показывают, что уровень активности люциферазы подавляется, когда присутствует фрагмент +21-170 CHOP 5'UTR, тогда как уровень мРНК LUC не изменяется.Для этих экспериментов транскрипт LUC измеряли с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией, и мы считали, что активность LUC была пропорциональна содержанию белка LUC (31).

Chop 5'UTR содержит консервативный uORF

Чтобы лучше понять механизмы, с помощью которых область 5'UTR Chop может репрессировать трансляцию нижестоящей ORF, была проанализирована ее нуклеотидная последовательность. Выравнивание 5'UTR транскриптов Chop человека, мыши и хомяка показывает высокую гомологию последовательностей (рис.2A), а также наличие трех сайтов начала трансляции (AUG – uAUG выше) для последовательности человека и двух для последовательностей хомяка и мыши. AUG # 1 и AUG # 2 находятся в рамке считывания с одним и тем же стоп-кодоном (UGA), очерчивая ORF из 34 и 31 аминокислот, соответственно. Аминокислотные последовательности пептидов uORF у хомяка, мыши и человека также демонстрируют высокую степень гомологии (фиг. 2B). Примечательно, что последовательность 5'UTR человека также содержит третий uAUG, который очерчивает ORF, перекрывающую ORF Chop .Сохранение первого uORF между видами и его расположение в транскрипте предполагают, что он функционально важен для регуляции экспрессии CHOP. Эти uAUG, а также кодон инициации CHOP, находятся в контексте последовательности, который делает возможной инициацию трансляции рибосомы (32,33). В целом, эти наблюдения привели нас к тому, чтобы сосредоточить внимание на эффектах uAUGs на модуляцию трансляции нижестоящей кодирующей последовательности.

Мутации в вышестоящих AUG отменяют репрессорный эффект 5'UTR

Чтобы определить важность uAUG в регуляции трансляции Chop , мы сконструировали серию плазмид (происходящих из pCMV – 5'UTR – LUC), содержащих точечную мутацию для каждого uAUG.После трансфекции получали клеточный экстракт и анализировали активность LUC и содержание мРНК (фиг. 3). Уровень транскриптов очень похож во всех конструкциях, что указывает на то, что различия в активности LUC не являются результатом вариации в накоплении мРНК. Напротив, на активность LUC влияет мутация uAUG. В частности, мутация во втором или третьем uAUG (uAUG # 2 или uAUG # 3) вызывает 6- и 2-кратное увеличение активности LUC, соответственно, тогда как мутация uAUG # 1 не имеет значительного эффекта.Когда все uAUG мутированы [uAUG (-)], репрессирующий эффект 5'UTR отсутствует, поскольку активность LUC была эквивалентна активности, измеренной в отсутствие 5'UTR Chop (фиг. 3 и 1С). По сравнению с лидерной последовательностью дикого типа, мутация трех uAUG (произошла мутация A кодона AUG) приводит к ~ 10-кратному увеличению активности LUC (аналогичные результаты были получены после мутации G кодона AUG; результаты не показаны). Эти результаты показывают, что подавление активности LUC из-за присутствия Chop 5'UTR происходит на уровне трансляции.Кроме того, uAUG # 2 сильно вовлечен в этот репрессивный эффект.

Инициирование трансляции в восходящем ORF

Результаты, описанные выше, предполагают, что Chop uORF транслируется после инициации кодона uAUG # 2. Чтобы напрямую проверить возможность того, что uORF может транслироваться, мы создали конструкцию, в которой стоп-кодон uORF, а также интерцистронная область были удалены, а uORF Chop был слит в рамке считывания с ORF люциферазы (pCMV– фьюжн uORF / Luc в кадре).В этом эксперименте синтез LUC должен происходить только в том случае, если рибосомы инициируют трансляцию по кодонам uAUG uORF. Экстракты трансфицированных клеток были грубо очищены и проанализированы на экспрессию LUC вестерн-блоттингом с использованием специфических антител, распознающих белок люциферазы. Иммуноблоттинг, представленный на фиг. 4, показывает, что слитый белок ORF-LUC экспрессируется на том же уровне, что и белок LUC, экспрессируемый из вектора pCMV-LUC. Как и ожидалось, этот белок имеет молекулярную массу немного выше, чем белок LUC.Приведенные выше данные демонстрируют, что uORF эффективно транслируется.

Инициирование трансляции в нижележащем ORF

Поскольку uAUG # 2 хорошо инициируется рибосомами и поскольку uAUG # 2 не может быть удален после альтернативного сплайсинга транскрипта или использования другого сайта инициации транскрипции, мы были заинтересованы в изучении механизма, с помощью которого транслируется нижележащая ORF. Одна из возможностей заключается в том, что трансляция происходит посредством «просачивающегося сканирования», при котором некоторые субъединицы рибосом не инициируются в кодоне uAUG и не транслируют нижележащую ORF.Другая возможность состоит в том, что несколько рибосом, которые транслируют uORF, могут повторно инициировать трансляцию в нижележащем AUG (34,35). Чтобы оценить эти возможности, было проведено несколько серий экспериментов.

Во-первых, мы мутировали контекст uAUG # 2 в последовательности (gccgccaccAUGg), которая, как известно, дает максимальную частоту инициации (36,37). Рисунок 5 показывает, что размещение uAUG в оптимальном контексте не оказывает значительного влияния на экспрессию LUC. Следовательно, кодон uAUG # 2 одинаково инициируется как в контексте дикого типа, так и в контексте с оптимальной мутацией.Эти данные подтверждают вывод о том, что uAUG # 2 присутствует в контексте, способном эффективно разрешать перевод, и, таким образом, uORF эффективно транслируется.

Для дальнейшей оценки вклада «просачивающегося сканирования» в трансляцию нисходящей ORF мы мутировали стоп-кодон uORF и ввели сдвиг кадра на 1 нт, чтобы сгенерировать расширенный uORF, который не находится в кадре с Ген LUC [рис. 2)]. Этот uORF перекрывается с ORF LUC и оканчивается на следующем стоп-кодоне, расположенном на 22 нуклеотида ниже инициирующего кодона LUC.Эта мутация предотвращает трансляцию ORF LUC путем повторной инициации после трансляции uORF CHOP. Наблюдаемое снижение активности люциферазы предполагает, что повторная инициация рибосом может быть ответственна за часть трансляции нижележащей ORF (фиг. 5). Однако, поскольку рибосомы, транслирующие расширенный uORF, могут мешать событиям инициации в перекрывающемся стартовом кодоне LUC, из этого эксперимента трудно определить соответствующую роль просочившегося сканирования и повторной инициации в трансляции LUC.

Влияние межцистронного промежутка на трансляцию нижележащей ORF

В ряде генов, содержащих uORF (34,38), было показано, что на повторную инициацию рибосомы после стоп-кодона uORF влияет как последовательность нуклеотидов, следующих за вышестоящим терминирующим кодоном, так и расстояние между uORF и нижележащим стартовым кодоном. сайт. Мы ввели несколько мутаций в межцистронную область, чтобы понять ее роль в трансляции нижележащей рамки считывания (рис.6). В первой серии экспериментов последовательность дикого типа была заменена последовательностью LacZ, не содержащей AUG [фиг. 6 (3)]. Поскольку замена спейсинговой области удалила uAUG # 3, конструкция, содержащая мутировавший 5'UTR на этом uAUG # 3, представлена ​​в качестве контроля [фиг. 6 (1)]. Наши результаты показывают, что мутация межцистронной области существенно не влияет на активность LUC [рис. 6 (3)]. Более того, чтобы обнаружить неожиданные независимые от uORF эффекты мутаций, ранее использованные плазмиды были мутированы на uAUG # 1 + 2 [фиг.6 (2) и (4)]. В этом контексте мутация интерцистронной области не влияет на экспрессию нижележащего цистрона.

Во второй серии экспериментов мы изменили длину межцистронной области. Сначала мы вставляли фрагменты разной длины в межцистронную область (рис. 6 (7) - (10)]. Эти спейсеры были амплифицированы с помощью ПЦР из гена Escherichia coli LacZ и не содержали стартового кодона AUG. Расширения 47 и 140 нуклеотидов не влияют на активность LUC в конструкциях uAUG (+) [фиг.6 (7) и (9)]. Установка прокладки в противоположной ориентации дает тот же результат (результат не показан). Точно так же уменьшение межцистронной области не нарушает трансляцию LUC [рис. 6 (11)]. Во всех конструкциях, мутировавших в uAUG, изменение длины межцистронной области не приводит к значительному изменению активности LUC [рис. 6 (8), (10) и (12)].

Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что последовательность межцистронной области не участвует в контроле трансляции нижестоящей ORF.

Мутации в пептидной последовательности, кодируемой uORF, усиливают трансляцию нижележащего цистрона

Ингибирование uORFs в некоторых других эукариотических генах зависит от кодирующей пептид последовательности uORF (34,39–42). Чтобы оценить важность этого пептида в трансляции нижестоящей ORF, последовательность uORF была мутирована следующим образом. Во-первых, мы ввели стоп-кодон в последовательность uORF [фиг. 7A (3)], чтобы синтезировать пептид из трех аминокислот после инициации трансляции в uAUG # 2 (кодон UGG был мутирован в UGA; фиг.2). Во-вторых, мы выполнили мутацию сдвига рамки считывания в мРНК, которая генерирует мутированную последовательность кодируемого uORF пептида, не влияя на ее длину [Рис. 7А (5)]. На рис. 7А показано, что эти различные мутации пептидной последовательности uORF увеличивают активность LUC примерно в ∼3–4 раза, но не влияют на содержание мРНК [рис. 7A, сравните (3) и (5) с (1)].

Чтобы измерить полную дерепрессию активности LUC, мы сконструировали контрольные плазмиды, содержащие такую ​​же модификацию в последовательности uORF, но мутировавшие по кодонам uAUG # 1 и uAUG # 2 [фиг.7A (2), (4) и (6)]. Удаление стартовых кодонов uORF приводит к более высокой активности LUC, чем обнаруженная после мутации пептидной последовательности uORF, что позволяет предположить, что мутации пептидной последовательности, кодируемой uORF, не приводят к полной депрепрессии активности LUC. Из этих экспериментов мы можем заключить, что (i) инициация только uAUG частично способствует ингибированию последующей трансляции ORF независимо от пептидной последовательности и (ii) когда аминокислотная последовательность uORF мутирована, трансляция ORF ниже по потоку увеличивается.

Мутации, использованные в этих экспериментах, оказывают сильное влияние на аминокислотную последовательность, но соответствуют только незначительным изменениям в последовательности мРНК. Тем не менее, мы не можем исключить, что последовательность мРНК 5'UTR сама по себе может участвовать в контроле остаточной экспрессии нижележащего цистрона. Чтобы исследовать его роль, мы выполнили молчащие мутации в кодирующей последовательности uORF, которые модифицируют мРНК, но не последовательность белка uORF (13 нуклеотидов, расположенных в последней части последовательности uORF, были мутированы).На фигуре 7A (7) показано, что молчащие мутации последовательности uORF незначительно снижают активность LUC (примерно в 2 раза). Эти результаты демонстрируют, что последовательность мРНК uORF играет роль в инициации нижележащего AUG. Эта мутация не оказывает значительного влияния на экспрессию нижележащего цистрона при мутации uAUG # 1 + 2 + 3 [Рис. 7A, сравните (2) и (8)].

Опосредованное uORF ингибирование трансляции проявляется в

цис

Далее мы рассмотрели возможность того, что пептид, кодируемый uORF, ингибирует трансляцию нижележащей ORF в trans .Репортерная плазмида, мутировавшая в uAUGs [pCMV – 5′UTR – LUC – uAUG (-)], была трансфицирована вместе с увеличивающимися количествами вектора экспрессии, pCMV – uORF, который содержит uORF, управляемый промотором CMV (рис. 7B). . Контрольный эксперимент проводили путем котрансфекции репортерного вектора экспрессионной плазмидой, мутированной по кодонам uAUG [pCMV – uORF – uAUG (-)]. Трансфекция увеличивающихся количеств вектора экспрессии uORF не снижает экспрессию LUC, кодируемую репортерной плазмидой. Хотя мы не можем напрямую оценить синтез кодируемого uORF пептида в клетке, высокая экспрессия конструкции слияния, показанная на фиг. 4, демонстрирует, что трансляция эффективно инициируется в uORF CHOP.Неспособность uORF репрессировать трансляцию при экспрессии из отдельного транскрипта предполагает, что uORF ингибирует экспрессию нижележащего цистрона посредством механизма действия cis .

ОБСУЖДЕНИЕ

Экспрессия CHOP сильно усиливается в ответ на различные стрессы, включая нарушение функции ER и аминокислотную депривацию. В этих ситуациях глобальный синтез белка подавляется. Мы начали это исследование CHOP 5'UTR в надежде понять, как транслируется CHOP, в то время как большинство других транскриптов нет.Мы исследовали этот вопрос, сравнивая относительные уровни трансляции мРНК CHOP, экспрессируемой сильным конститутивным ретровирусным промотором в присутствии или отсутствии стресса ER. Мы обнаружили, что присутствие этой области подавляет трансляцию как в стрессированных, так и в нестрессированных клетках. Это связано с набором из трех вышестоящих AUG (uAUG), которые присутствуют в области от нуклеотидов +1 до +170 в 5'UTR человека. Первые два кодона uAUG находятся в кадре и запускают uORF, локализованный в 5'-лидере.Наши результаты показывают, что uAUG # 2 хорошо инициируется рибосомами и сильно подавляет трансляцию нижележащей ORF. Третий кодон uAUG 5'UTR человека Chop , который не присутствует в 5'UTR хомяка и мыши, незначительно ингибирует инициацию в основном AUG. Удаление всех uAUG улучшает трансляционную активность примерно в 10 раз. Наши результаты согласуются с механизмом, в котором трансляция цистрона uORF CHOP репрессирует инициацию нижележащего кодона AUG. Описано несколько примеров генов, содержащих ингибирующие пКОРС (34).Однако пКОРС не всегда подавляют трансляцию. Например, 5'UTR мРНК орнитиндекарбоксилазы репрессирует трансляцию, но присутствующие в ее лидере uORFs мало способствуют ее репрессии (43).

Настоящее исследование показывает, что мутация двух нуклеотидов, изменяющая последовательность пептида, кодируемого uORF, сильно увеличивает трансляцию нижележащего цистрона. Эти данные подтверждают гипотезу о том, что uORF ингибирует нисходящую трансляцию с помощью механизма, который зависит от информации о кодировании аминокислот.Мы не можем полностью исключить, что мутации, используемые в этих конструкциях, могут влиять на инициацию в нижележащем кодоне. Однако маловероятно, что точечная мутация сильно изменяет структуру РНК и тем самым влияет на экспрессию LUC. Кроме того, результаты, полученные с использованием «молчащих мутаций», показывают, что последовательность мРНК, кодируемая uORF, может влиять на инициацию в нижележащем цистроне. Взятые вместе, наши результаты показывают, что при мутации только в последовательности мРНК, область uORF немного снижает экспрессию LUC, тогда как мутации в аминокислотной последовательности сильно усиливают экспрессию LUC.Следовательно, вероятно, что эффекты точечной мутации, используемой для модификации аминокислотной последовательности пКОРС (фиг. 7A), обусловлены пептидной последовательностью пКОРС, и, таким образом, ингибирующий эффект пКОРС является «управляемым белком». механизм'.

Были описаны другие транскрипты эукариотических генов, содержащие uORF, которые ингибируют нисходящую трансляцию с помощью механизма, который зависит от информации о кодировании аминокислот. Например, в S -аденозилметиониндекарбоксилазе (44), β2-адренорецепторе (45), гене CPA1 дрожжей (46) или генах цитомегаловируса gp48 (или CMV gp UL4) (47–49), пептидный продукт uORF опосредует подавление трансляции.Для большинства этих генов пептид uORF опосредует ингибирование цис. Только пептид uORF β2-адренергического рецептора ингибирует трансляцию в trans . Однако этот результат был показан только в бесклеточных экстрактах и ​​при высоких концентрациях пептидов (45). Механизмы, задействованные для объяснения ингибирующих эффектов пептида uORF на трансляцию, не изучены, однако можно предложить несколько моделей. Например, пептид uORF синтезируется и обладает способностью ингибировать трансляцию только при высоких концентрациях в локальном микроокружении (45).Кроме того, возможно, что растущий пептид, все еще прикрепленный к аппарату трансляции, ингибирует трансляцию посредством взаимодействия с рибосомой или связанным с рибосомой фактором трансляции. В гене gp48 было показано, что пептид uORF приводит к остановке рибосом во время прекращения трансляции uORF2 (39,47,49). Следовательно, uORF должен быть частью того же транскрипта, который предшествует основному цистрону. Потребуются дальнейшие исследования, чтобы определить, имеет ли место подобный механизм в расшифровке стенограммы Chop .

Наши данные показывают, что, несмотря на эффективную трансляцию uORF, основной цистрон остается немного транслируемым. Несколько механизмов могут объяснять трансляцию нижележащего цистрона: вход внутрь рибосомы, повторная инициация рибосомы и «сканирование утечки». На эффективность повторной инициации после трансляции uORF может влиять как природа последовательности, окружающей вышестоящий кодон терминации, так и расстояние между uORF и нижележащим стартовым сайтом (34,35,50). Замена интерцистронной последовательности нейтральной последовательностью LacZ или изменение длины этой последовательности не влияет на трансляцию нижележащей ORF.Следовательно, межцистронная область не содержит последовательности, участвующей в контроле повторной инициации рибосомы или внутреннего сайта входа в рибосому. Однако «молчащие мутации» последовательности uORF незначительно снижают остаточную трансляцию нижележащего цистрона, предполагая, что последовательность мРНК может играть роль в инициации нижележащего цистрона. Этот вывод подкрепляется наблюдением, что удлинение uORF (Fig. 5) частично ингибирует остаточную трансляцию LUC. Однако остаточная активность LUC, которая измеряется при расширении uORF, показывает, что «сканирование с утечкой» также может частично способствовать трансляции расположенного ниже цистрона.

Взятые вместе эти данные согласуются с идеей, что остаточная трансляция нижележащей ORF происходит частично за счет повторной инициации рибосом и частично за счет сканирования с утечкой. Дальнейшая работа будет необходима для количественной оценки соответствующей части обоих механизмов трансляции ORF CHOP.

Наблюдение за тем, что большинство мРНК, которые инициируются ниже одного или нескольких кодонов uAUG, кодируют регуляторные белки, приводит к предположению, что uAUG могут подавлять трансляцию белков, экспрессию которых необходимо точно контролировать.Подтверждающие доказательства этой идеи получены из результатов, что (i) онкогенный потенциал c-mos (51,52) или c-lck (53) увеличивается за счет перегруппировок, удаляющих uORF, и (ii) репрессивный эффект НКО можно регулировать. Например, в хорошо изученном случае гена Saccharomyces cerevisiae GCN4 , четыре uORF регулируют трансляцию GCN4 в ответ на доступность аминокислот, контролируя, какие нижестоящие кодоны AUG используются повторно инициирующими рибосомами (54,55 ).Другой пример включает uORF S -аденозилметиониндекарбоксилазы , которая сама по себе может обеспечивать полиаминную регуляцию трансляции нижележащей ORF (56). Кроме того, на ингибирующую роль вышестоящего AUG может влиять тип клетки. Например, элементы в лидерной последовательности транскрипта c-sis ингибируют его трансляцию, но эта репрессия временно снимается при дифференцировке мегакариоцитов (57).

Учитывая важность белка CHOP в регуляции многочисленных клеточных функций, может потребоваться точный контроль его экспрессии.Мы описали новую особенность экспрессии CHOP, которая включает репрессию трансляции высококонсервативной uORF. Примером конститутивной экспрессии аномальной формы CHOP является слияние CHOP с TLS из-за хромосомной транслокации, обнаруженной в подавляющем большинстве миксоидных липосарком человека (10). Онкогенный потенциал этого гибридного белка обусловлен свойствами TLS-части белка и его конститутивной экспрессией (11). Примечательно, что конститутивная экспрессия этой онкогенной формы CHOP может быть частично объяснена отсутствием репрессии трансляции из-за делеции 5'UTR CHOP.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим C. Tassy и доктора A. Ouali (Station de Recherche sur la Viande, INRA de Theix, Франция) за ионообменную хроматографию, S. Lafarge и профессора YJ Bignon за количественное определение мРНК, докторов S. Mordier и E Пинзару за критическое прочтение рукописи и полезное обсуждение. Эта работа была поддержана грантами Национального института исследований в области агрономии и Фонда медицинских исследований. C.J. был удостоен исследовательской стипендии DANONE.F.U. является стипендиатом Мемориального фонда Уэхара.

*

Кому адресовать корреспонденцию. Тел .: +33 4 73 62 45 62; Факс: +33 4 73 62 45 70; Эл. Почта: [email protected]

Рисунок 1. Последовательность Chop 5'UTR репрессирует трансляцию нижестоящих кодирующих последовательностей. ( A ) Клетки NIH-3T3 инфицировали рекомбинантным ретровирусом, экспрессирующим под контролем промотора CMV меченую ORF для CHOP, содержащую 5'UTR человека Chop (5'UTR-9E10-CHOP, дорожка 3 ) или нет [5′UTR (Δ) –9E10 – CHOP; дорожка 2].Контрольный эксперимент проводили путем заражения клеток пустым вирусом (нетрансфицированный, дорожка 1). Затем клетки инкубировали в течение 4 ч с 2,5 мкг / мл туникамицина или без него. На схеме конструкции стрелка представляет сайт начала транскрипции. Белковые экстракты анализировали на присутствие белка CHOP и мРНК, как описано в разделе «Материалы и методы». ( B ) Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC, содержащими либо дикий тип (5'UTR-LUC), либо удаленный [5'UTR (21) -LUC] Chop 5'UTR ниже Chop промоутер.Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и анализировали на относительную активность люциферазы и относительный уровень мРНК LUC, как описано в разделе «Материалы и методы». ( C ) Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями, содержащими промотор CMV, управляющий конструкцией LUC, содержащей или не содержащей Chop 5'UTR. CHOP 5'UTR клонировали через +6 нуклеотидов после стартового сайта транскрипции. Относительное содержание мРНК Luc не зависело от CHOP 5'UTR ( t -тест, n > 3, ** = P <0.0001, NS = не имеет значения).

Рисунок 1. Последовательность Chop 5'UTR репрессирует трансляцию нижестоящих кодирующих последовательностей. ( A ) Клетки NIH-3T3 инфицировали рекомбинантным ретровирусом, экспрессирующим под контролем промотора CMV меченую ORF для CHOP, содержащую 5'UTR человека Chop (5'UTR-9E10-CHOP, дорожка 3 ) или нет [5′UTR (Δ) –9E10 – CHOP; дорожка 2]. Контрольный эксперимент проводили путем заражения клеток пустым вирусом (нетрансфицированный, дорожка 1).Затем клетки инкубировали в течение 4 ч с 2,5 мкг / мл туникамицина или без него. На схеме конструкции стрелка представляет сайт начала транскрипции. Белковые экстракты анализировали на присутствие белка CHOP и мРНК, как описано в разделе «Материалы и методы». ( B ) Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC, содержащими либо дикий тип (5'UTR-LUC), либо удаленный [5'UTR (21) -LUC] Chop 5'UTR ниже Chop промоутер. Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и анализировали на относительную активность люциферазы и относительный уровень мРНК LUC, как описано в разделе «Материалы и методы».( C ) Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями, содержащими промотор CMV, управляющий конструкцией LUC, содержащей или не содержащей Chop 5'UTR. CHOP 5'UTR клонировали через +6 нуклеотидов после стартового сайта транскрипции. На относительное содержание мРНК Luc не влиял CHOP 5'UTR ( t -тест, n > 3, ** = P <0,0001, NS = не значимо).

Рисунок 2. CHOP 5'UTR содержит консервативную uORF.Выравнивание последовательностей области 5'UTR транскрипта Chop человека, мыши и хомяка. ( A ) Нуклеотидная последовательность, ( B ) аминокислотная последовательность. Указаны кодоны uAUG и стоп-кодон. Показаны консервативные нуклеотиды или аминокислоты, а нуклеотидная последовательность uORF заключена в рамку.

Рис. 2. CHOP 5'UTR содержит консервативную uORF. Выравнивание последовательностей области 5'UTR транскрипта Chop человека, мыши и хомяка.( A ) Нуклеотидная последовательность, ( B ) аминокислотная последовательность. Указаны кодоны uAUG и стоп-кодон. Показаны консервативные нуклеотиды или аминокислоты, а нуклеотидная последовательность uORF заключена в рамку.

Рисунок 3. Мутации в uAUG отменяют репрессорный эффект 5'UTR. Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC, содержащими [uAUG (+)] дикого типа или мутантный Chop 5'UTR ниже промотора CMV.AUG, показанные на рисунке 2, были мутированы индивидуально (uAUG # 1, uAUG2, uAUG # 3) или все вместе [uAUG (-)]. На схеме конструкции стрелка представляет сайт начала транскрипции, а открытая рамка показывает uORF. Через 48 часов после трансфекции клетки обрабатывали трипсином, затем половину использовали для анализа активности люциферазы и β-галактозидазы, а вторую половину использовали для экстракции РНК и количественного определения транскриптов. Относительные активности LUC и уровни мРНК определяли как отношение LUC / βGAL, как описано в разделе «Материалы и методы».(Активность LUC: t -тест, n > 5, ** = P <0,0001, NS = несущественно; LUC мРНК: t -test, n = 3, NS = несущественно) .

Рисунок 3. Мутации в uAUG отменяют репрессорный эффект 5'UTR. Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC, содержащими [uAUG (+)] дикого типа или мутантный Chop 5'UTR ниже промотора CMV. AUG, показанные на рисунке 2, были мутированы индивидуально (uAUG # 1, uAUG2, uAUG # 3) или все вместе [uAUG (-)].На схеме конструкции стрелка представляет сайт начала транскрипции, а открытая рамка показывает uORF. Через 48 часов после трансфекции клетки обрабатывали трипсином, затем половину использовали для анализа активности люциферазы и β-галактозидазы, а вторую половину использовали для экстракции РНК и количественного определения транскриптов. Относительные активности LUC и уровни мРНК определяли как отношение LUC / βGAL, как описано в разделе «Материалы и методы». (Активность LUC: t -тест, n > 5, ** = P <0.0001, NS = не имеет значения; МРНК LUC: t -тест, n = 3, NS = не значимо).

Рисунок 4. Трансляция начинается с кодона uORF AUG. Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC, содержащими либо (1) LUC ниже промотора CMV, либо (2) конструкцию, содержащую слияние CHOP-uORF / LUC в рамке считывания ниже промотора CMV. Через семьдесят два часа после трансфекции готовили лизаты цельных клеток и анализировали на содержание белка люциферазы вестерн-блоттингом, как описано в разделе «Материалы и методы».

Рис. 4. Трансляция начинается с кодона uORF AUG. Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC, содержащими либо (1) LUC ниже промотора CMV, либо (2) конструкцию, содержащую слияние CHOP-uORF / LUC в рамке считывания ниже промотора CMV. Через семьдесят два часа после трансфекции готовили лизаты цельных клеток и анализировали на содержание белка люциферазы вестерн-блоттингом, как описано в разделе «Материалы и методы».

Рисунок 5. Репрессия трансляции с помощью Chop uORF нарушается удлиненной uORF. Конструкции, показанные на этом рисунке, являются производными CMV – 5′UTR – LUC (1). (2) uAUG # 2 был мутирован в оптимальном консенсусном стартовом сайте (gccgccaccAUGg). В следующей конструкции конструкция STOPmt (3) была сгенерирована мутацией стоп-кодона uORF и введением сдвига рамки на 1 нт для создания расширенной uORF, которая не находится в рамке с ORF LUC. CHOP 5'UTR и кодирующая последовательность LUC представлены для каждой конструкции, а uORF заключен в рамку.Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и анализировали на относительную активность LUC и уровень мРНК, как описано в разделе «Материалы и методы».

Рис. 5. Трансляционная репрессия Chop uORF нарушается удлиненной uORF. Конструкции, показанные на этом рисунке, являются производными CMV – 5′UTR – LUC (1). (2) uAUG # 2 был мутирован в оптимальном консенсусном стартовом сайте (gccgccaccAUGg). В следующей конструкции конструкция STOPmt (3) была сгенерирована мутацией стоп-кодона uORF и введением сдвига рамки на 1 нт для создания расширенной uORF, которая не находится в рамке с ORF LUC.CHOP 5'UTR и кодирующая последовательность LUC представлены для каждой конструкции, а uORF заключен в рамку. Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и анализировали на относительную активность LUC и уровень мРНК, как описано в разделе «Материалы и методы».

Рисунок 6. Трансляционная репрессия с помощью Chop uORF не зависит от межцистронной области. Конструкции экспрессии, содержащие 5'UTR либо в форме дикого типа (5), либо мутировавшие в uAUG (6), использовали для мутации интерцистронной области.Стрелки представляют точечную мутацию uAUG. Когда присутствует uORF, заключен в рамку. Эти конструкции трансфицировали в клетки HeLa, затем через 48 часов после трансфекции клетки собирали. Относительные активности LUC и уровни мРНК анализировали, как описано выше. В плазмиде ICmt межцистронная область CHOP была заменена последовательностью LacZ, не содержащей AUG [(3) и (4)]. Контекст инициации LUC AUG не был изменен. Плазмиды, мутировавшие в AUG # 3, приведены в качестве контроля (1) (2).Спейсер длиной 47 п.н. [(7) и (8)] или 140 п.н. [(9) и (10)], не содержащий кодона AUG, был введен в межцистронную область мутировавшей плазмиды pCMV – 5'UTR – LUC или не на uAUG. В конструкциях ΔIC межцистронная область была удалена [(11) и (12)]. Мутации не влияют на консенсусную последовательность Козака LUC AUG.

Рис. 6. Трансляционная репрессия с помощью Chop uORF не зависит от межцистронной области. Конструкции экспрессии, содержащие 5'UTR либо в форме дикого типа (5), либо мутировавшие в uAUG (6), использовали для мутации интерцистронной области.Стрелки представляют точечную мутацию uAUG. Когда присутствует uORF, заключен в рамку. Эти конструкции трансфицировали в клетки HeLa, затем через 48 часов после трансфекции клетки собирали. Относительные активности LUC и уровни мРНК анализировали, как описано выше. В плазмиде ICmt межцистронная область CHOP была заменена последовательностью LacZ, не содержащей AUG [(3) и (4)]. Контекст инициации LUC AUG не был изменен. Плазмиды, мутировавшие в AUG # 3, приведены в качестве контроля (1) (2).Спейсер длиной 47 п.н. [(7) и (8)] или 140 п.н. [(9) и (10)], не содержащий кодона AUG, был введен в межцистронную область мутировавшей плазмиды pCMV – 5'UTR – LUC или не на uAUG. В конструкциях ΔIC межцистронная область была удалена [(11) и (12)]. Мутации не влияют на консенсусную последовательность Козака LUC AUG.

Рисунок 7. Ингибирование трансляции uORF зависит от его пептидной последовательности. ( A ) Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC [происходящими из CMV-5'UTR-LUC (1) (2)], мутантными в последовательности uORF.Через 48 часов после трансфекции клетки собирали, затем анализировали относительную активность LUC и уровни мРНК. Плазмиды содержат 5'UTR либо в форме дикого типа, либо с мутациями по uAUG # 1 и AUG # 2. Стрелки представляют точечную мутацию uAUG. Когда он присутствует, uORF заключен в рамку. Точечные мутации кодирующей последовательности uORF обозначены звездочками. В первом наборе конструкций стоп-кодон был введен в нуклеотид +52, кодон UGG заменен кодоном UGA (3) и (4), образуя пептид из трех аминокислот.Во втором наборе конструкций последовательность синтезированного пептида мутировали путем введения сдвига рамки считывания в нуклеотидную последовательность (5) и (6). Одно основание было введено после AUG # 2, а одно основание было удалено непосредственно перед стоп-кодоном. Мутация не влияет на консенсусную последовательность Козака AUG # 2. Мутировавший uORF отмечен рамкой и заштрихован. В последнем наборе конструкций мы создали «молчащую мутацию» в кодирующей последовательности uORF, которая модифицирует последовательность мРНК, но не аминокислотную последовательность [мы мутировали 13 нуклеотидов, расположенных в последней части последовательности uORF; (7) и (8)].( B ) Клетки HeLa временно котрансфицировали 0,5 мкг репортерной плазмиды [CMV – 5′UTR – uAUG (-) - LUC] и увеличивающимися количествами (0, 0,5, 1, 2, 3 и 4 мкг) вектора экспрессии uORF CHOP, кодирующего пептид uORF (pCMV – uORF). В контрольном эксперименте этот вектор экспрессии был мутирован в AUG # 1 и AUG # 2 [pCMV – uORF – AUG (-)]. Общее количество экспрессионного вектора поддерживали постоянным путем добавления пустого вектора (pCMV). Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и анализировали относительную активность LUC.

Рисунок 7. Ингибирование трансляции uORF зависит от его пептидной последовательности. ( A ) Клетки HeLa временно трансфицировали конструкциями LUC [происходящими из CMV-5'UTR-LUC (1) (2)], мутантными в последовательности uORF. Через 48 часов после трансфекции клетки собирали, затем анализировали относительную активность LUC и уровни мРНК. Плазмиды содержат 5'UTR либо в форме дикого типа, либо с мутациями по uAUG # 1 и AUG # 2. Стрелки представляют точечную мутацию uAUG.Когда он присутствует, uORF заключен в рамку. Точечные мутации кодирующей последовательности uORF обозначены звездочками. В первом наборе конструкций стоп-кодон был введен в нуклеотид +52, кодон UGG заменен кодоном UGA (3) и (4), образуя пептид из трех аминокислот. Во втором наборе конструкций последовательность синтезированного пептида мутировали путем введения сдвига рамки считывания в нуклеотидную последовательность (5) и (6). Одно основание было введено после AUG # 2, а одно основание было удалено непосредственно перед стоп-кодоном.Мутация не влияет на консенсусную последовательность Козака AUG # 2. Мутировавший uORF отмечен рамкой и заштрихован. В последнем наборе конструкций мы создали «молчащую мутацию» в кодирующей последовательности uORF, которая модифицирует последовательность мРНК, но не аминокислотную последовательность [мы мутировали 13 нуклеотидов, расположенных в последней части последовательности uORF; (7) и (8)]. ( B ) Клетки HeLa временно котрансфицировали 0,5 мкг репортерной плазмиды [CMV – 5′UTR – uAUG (-) - LUC] и увеличивающимися количествами (0, 0,5, 1, 2, 3 и 4 мкг) вектора экспрессии uORF CHOP, кодирующего пептид uORF (pCMV – uORF).В контрольном эксперименте этот вектор экспрессии был мутирован в AUG # 1 и AUG # 2 [pCMV – uORF – AUG (-)]. Общее количество экспрессионного вектора поддерживали постоянным путем добавления пустого вектора (pCMV). Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и анализировали относительную активность LUC.

Список литературы

1 McKnight, S.L., Lane, M.D. и Gluecksohn-Waelsch, S. (

1989

) Является ли CCAAT / связывающий энхансер белком центральным регулятором энергетического метаболизма?

Genes Dev.

,

3

,

2021

–2024.

2 Умек Р.М., Фридман А.Д. и Макнайт, С. (

1991

) CCAAT-энхансер-связывающий белок: компонент переключателя дифференцировки.

Science

,

251

,

288

–292.

3 Цао, З., Умек, Р.М. и Макнайт, С. (

1991

) Регулируемая экспрессия трех изоформ C / EBP во время жировой конверсии клеток 3T3-L1.

Genes Dev.

,

5

,

1538

–1552.

4 Биркенмайер, Э. Х., Гвинн, Б., Ховард, С., Джерри, Дж., Гордон, Дж. И., Ландшульц, В. и Макнайт, С. (

1989

) Тканеспецифическая экспрессия, регуляция развития и генетическое картирование гена, кодирующего CCAAT / связывающий белок энхансер.

Genes Dev.

,

3

,

1146

–1156.

5 Батчварова Н., Ван Х.З. и Рон, Д. (

1995

) Ингибирование адипогенеза стресс-индуцированным белком CHOP (Gadd153).

EMBO J.

,

14

,

4654

–4661.

6 Бароне, М.В., Крозат, А., Табаи, А., Филипсон, Л. и Рон, Д. (

1994

) CHOP (GADD153) и его онкогенный вариант, TLS-CHOP, оказывают противоположное действие на индукцию остановки G1 / S.

Genes Dev.

,

8

,

453

–464.

7 Фридман, AD. (

1996

) GADD153 / CHOP, белок, индуцирующий повреждение ДНК, снижает активность CAAT / связывающего белка энхансера и увеличивает апоптоз в миелоидных клетках 32D c13.

Cancer Res.

,

56

,

3250

–3256.

8 Зинзнер Х., Курода М., Ван Х., Батчварова Н., Лайтфут Р.Т., Ремотти Х., Стивенс Дж.Л. и Рон, Д. (

1998

) CHOP участвует в запрограммированной гибели клеток в ответ на нарушение функции эндоплазматического ретикулума.

Genes Dev.

,

12

,

982

–995.

9 Аман, П., Рон, Д., Мандал, Н., Фиоретос, Т., Хайм, С., Археден, К., Виллен, Х., Ридхольм, А. и Мительман Ф.(

1992

) Перестройка гена фактора транскрипции CHOP в миксоидных липосаркомах с t (12; 16) (q13; p11).

Genes Chromosom. Рак

,

5

,

278

–285.

10 Crozat, A., Aman, P., Mandahl, N. и Рон, Д. (

1993

) Слияние CHOP с новым РНК-связывающим белком при миксоидной липосаркоме человека.

Nature

,

363

,

640

–644.

11 Zinszner, H., Albalat, R. и Рон, Д. (

1994

) Новый эффекторный домен из РНК-связывающего белка TLS или EWS необходим для онкогенной трансформации с помощью CHOP.

Genes Dev.

,

8

,

2513

–2526.

12 Rabbitts, T.H., Forster, A., Larson, R. и Натан, П. (

1993

) Слияние доминирующего негативного регулятора транскрипции CHOP с новым геном FUS путем транслокации t (12; 16) в злокачественную липосаркому.

Nature Genet.

,

4

,

175

–180.

13 Панагопулос, И., Хоглунд, М., Мертенс, Ф., Мандаль, Н., Мительман, Ф. и Аман, П. (

1996

) Слияние генов EWS и CHOP при миксоидной липосаркоме.

Онкоген

,

12

,

489

–494.

14 Панагопулос, И., Аман, П., Мертенс, Ф., Мандал, Н., Ридхольм, А., Бауэр, Х.Ф. и Мительман Ф. (

1996

) Геномная ПЦР обнаруживает опухолевые клетки в периферической крови пациентов с миксоидной липосаркомой.

Genes Chromosom. Рак

,

17

,

102

–107.

15 Ван, X.З., Курода, М., Сок, Дж., Батчварова, Н., Киммел, Р., Чанг, П., Зинзнер, Х. и Рон, Д. (

1998

) Идентификация новых индуцированных стрессом генов ниже по ходу цепи chop.

EMBO J.

,

17

,

3619

–3630.

16 Рон, Д. и Хабенер, Дж. Ф. (

1992

) CHOP, новый регулируемый в процессе развития ядерный белок, который димеризуется с факторами транскрипции C / EBP и LAP и функционирует как доминантно-отрицательный ингибитор транскрипции гена.

Genes Dev.

,

6

,

439

–453.

17 Fawcett, T.W., Eastman, H.B., Martindale, J.L. и Холбрук, штат Нью-Джерси. (

1996

) Физическая и функциональная связь между GADD153 и CCAAT / связывающим энхансером белком бета во время клеточного стресса.

J. Biol. Chem.

,

271

,

14285

–14289.

18 Убеда, м., Вальехо, м. и Хабенер, Дж. Ф. (

1999

) CHOP-усиление транскрипции гена за счет взаимодействия с комплексными белками Jun / Fos AP-1.

Мол. Клетка. Биол.

,

19

,

7589

–7599.

19 Люти, J.D. и Холбрук, штат Нью-Джерси. (

1992

) Активация промотора gadd153 генотоксическими агентами: быстрый и специфический ответ на повреждение ДНК.

Cancer Res.

,

52

,

5

–10.

20 Гайтон, К.З., Сюй, К. и Холбрук, штат Нью-Джерси. (

1996

) Индукция гена ответа на стресс у млекопитающих GADD153 окислительным стрессом: роль элемента AP-1.

Biochem. J.

,

314

,

547

–554.

21 Халлек, М.М., Холбрук, штат Нью-Джерси, Скиннер, Дж., Лю, Х. и Стивенс, Дж. (

1997

) Молекулярный ответ на восстановительный стресс в эпителиальных клетках почек LLC-PK1: координирует регуляцию транскрипции генов gadd153 и grp78 тиолами.

Шапероны клеточного стресса

,

2

,

31

–40.

22 Карлсон, С.Г., Фосетт, Т.В., Бартлетт, Д.Д., Бернье, М. и Холбрук, штат Нью-Джерси. (

1993

) Регулирование гена gadd153, связанного с C / EBP, путем депривации глюкозы.

Мол. Клетка. Биол.

,

13

,

4736

–4744.

23 Брюа, А., Жусс, К., Ван, Х.З., Рон, Д., Феррара, М. and Fafournoux, P. (

1997

) Ограничение аминокислот индуцирует экспрессию CHOP, гена, связанного с CCAAT / связывающим энхансером белком, как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях.

J. Biol. Chem.

,

272

,

17588

–17593.

24 Jousse, C., Bruhat, A., Harding, H.P., Ferrara, M., Ron, D. and Fafournoux, P. (

1999

) Ограничение аминокислот регулирует экспрессию CHOP посредством специфического пути, независимого от ответа развернутого белка.

FEBS Lett.

,

448

,

211

–216.

25 Сильвестр, S.L., Ap Rhys, C.M., Luethy-Martindale, J.D. и Холбрук, штат Нью-Джерси. (

1994

) Индукция GADD153, гена, связанного с CCAAT / энхансер-связывающим белком (C / EBP), во время острой фазы ответа у крыс.Доказательства участия C / EBPs в регуляции его экспрессии.

J. Biol. Chem.

,

269

,

20119

–20125.

26 Ли, К. К., Клопп, Р. Г., Вайндрух, Р. и Prolla, T.A. (

1999

) Профиль экспрессии генов старения и его замедление за счет ограничения калорийности.

Science

,

285

,

1390

–1393.

27 Bartlett, J.D., Luethy, J.D., Carlson, S.G., Sollott, S.J. и Холбрук, штат Нью-Джерси. (

1992

) Ионофор кальция A23187 индуцирует экспрессию гена gadd153, индуцируемого задержкой роста и повреждением ДНК, индуцируемого CCAAT / энхансер-связывающим белком (C / EBP).Ca 2+ увеличивает транскрипционную активность и стабильность мРНК.

J. Biol. Chem.

,

267

,

20465

–20470.

28 Дэвис, Л.Г., Дибнер, доктор медицины. и Бэтти Дж. (

1986

) Основные методы молекулярной биологии. Elsevier Science Publishing Co., Inc., Нью-Йорк, штат Нью-Йорк.

29 Холл, К.В., Джейкоб, П.Е., Рингольд, Г.М. и Ли, Ф. (

1983

) Экспрессия и регуляция слияний гена Escherichia coli lacZ в клетках млекопитающих.

J. Mol. Прил. Genet.

,

2

,

101

–109.

30 Брюа, А., Жусс, К., Карраро, В., Реймольд, А.М., Феррара, М. and Fafournoux, P. (

2000

) Аминокислоты контролируют транскрипцию генов млекопитающих: активация фактора транскрипции 2 необходима для аминокислотной чувствительности промотора CHOP.

Мол. Клетка. Биол.

,

20

,

7192

–7204.

31 де Вет, Дж. Р., Вуд, К. В., ДеЛука, М., Хелински, Д. и Subramani, S.(

1987

) Ген люциферазы светлячка: структура и экспрессия в клетках млекопитающих.

Мол. Клетка. Биол.

,

7

,

725

–737.

Козак, 32, м. (

1986

) Точечные мутации определяют последовательность, фланкирующую кодон инициатора AUG, который модулирует трансляцию эукариотическими рибосомами.

Ячейка

,

44

,

283

–292.

33 Козак, м. (

1987

) По крайней мере шесть нуклеотидов, предшествующих кодону инициатора AUG, усиливают трансляцию в клетках млекопитающих.

J. Mol. Биол.

,

196

,

947

–950.

34 Гебалле, А.П. (

1996

) Контроль трансляции, опосредованный вышестоящими кодонами AUG. В Hershey, I.W.B., Mathews, MB. и Зоненберг, Н. (под ред.) Управление трансляцией. Лабораторная пресса Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк, стр.

173

–197.

35 Моррис, Д. и Гебалле А. (

2000

) Открытые рамки считывания как регуляторы трансляции мРНК.

Мол. Клетка. Биол.

,

20

,

8635

–8642.

36 Козак, м. (

1995

) Соблюдение правила first-AUG, когда второй кодон AUG следует за первым.

Proc. Natl Acad. Sci. США

,

92

,

7134

.

37 Козак, м. (

1989

) Контекстные эффекты и неэффективная инициация в кодонах, отличных от AUG, в бесклеточных системах трансляции эукариот.

Мол. Клетка. Биол.

,

9

,

5073

–5080.

38 Линкольн А.Дж., Мончак Ю., Уильямс С.С. и Джонсон П.Ф. (

1998

) Ингибирование трансляции альфа- и бета-трансляции CCAAT / энхансер-связывающего белка открытыми рамками считывания, расположенными выше по течению.

J. Biol. Chem.

,

273

,

9552

–9560.

39 Цао, Дж. и Гебалле А. (

1996

) Кодирующая последовательность-зависимая рибосомная остановка при прекращении трансляции.

Мол. Клетка. Биол.

,

16

,

603

–608.

40 Ван, З. и Sachs, M.S. (

1997

) Аргинин-специфическая регуляция, опосредованная открытой рамкой считывания Neurospora crassa arg-2, расположенной выше по течению в гомологичной бесклеточной системе трансляции in vitro .

J. Biol. Chem.

,

272

,

255

–261.

41 Reynolds, K., Zimmer, A.M. и Циммер А. (

1996

) Регулирование экспрессии мРНК RAR бета 2: данные о наличии ингибирующего пептида, кодируемого в 5'-нетранслируемой области.

J. Cell Biol.

,

134

,

827

–835.

42 Луо, З. и Sachs, M.S. (

1996

) Роль вышележащей открытой рамки считывания в обеспечении аргинин-специфичного контроля трансляции в Neurospora crassa .

Дж. Бактериол

. ,

178

,

2172

–2177.

43 Manzella, J.M. и Блэкшир, П.Дж. (

1990

) Регулирование трансляции мРНК орнитиндекарбоксилазы крысы ее 5'-нетранслируемой областью.

J. Biol. Chem.

,

265

,

11817

–11822.

44 Ruan, H., Hill, J.R., Fatemie-Nainie, S. и Моррис, Д. (

1994

) Клеточно-специфическая регуляция трансляции мРНК S-аденозилметиониндекарбоксилазы. Влияние структуры лидера 5'-транскрипта на регуляцию вышестоящей открытой рамкой считывания.

J. Biol. Chem.

,

269

,

17905

–17910.

45 Parola, A.L. и Кобылка Б. (

1994

) Пептидный продукт 5'-лидерного цистрона в мРНК бета 2 -адренергического рецептора ингибирует синтез рецептора.

J. Biol. Chem.

,

269

,

4497 ​​

–4505.

46 Delbecq, P., Werner, M., Feller, A., Filipkowski, R.K., Messenguy, F. и Пиерард, А. (

1994

) Сегмент мРНК, кодирующий лидерный пептид гена CPA1, вызывает репрессию аргинином на транскрипт гетерологичного дрожжевого гена.

Мол. Клетка. Биол.

,

14

,

2378

–2390.

47 Schleiss, M.R., Degnin, C.R. и Гебалле А. (

1991

) Трансляционный контроль экспрессии человеческого цитомегаловируса gp48.

J. Virol.

,

65

,

6782

–6789.

48 Дегнин К.Р., Шлейсс М.Р., Цао Дж. и Гебалле А. (

1993

) Ингибирование трансляции, опосредованное короткой открытой рамкой считывания в транскрипте человеческого цитомегаловируса gpUL4 (gp48).

J. Virol.

,

67

,

5514

–5521.

49 Цао, Дж. и Гебалле А. (

1995

) Ингибирование трансляции цитомегаловирусом человека выше открытой рамки считывания, несмотря на неэффективное использование его кодона AUG.

J. Virol.

,

69

,

1030

–1036.

Козак, 50, м. (

1987

) Влияние интерцистронной длины на эффективность повторной инициации эукариотическими рибосомами.

Мол. Клетка. Биол.

,

7

,

3438

–3445.

51 Речави, Г., Гивол, Д. и Ханаани, Э. (

1982

) Активация клеточного онкогена путем перестройки ДНК: возможное участие IS-подобного элемента.

Nature

,

300

,

607

–611.

52 Сталь, Л.Ф., Телли, Д.Л., Леонард, Дж., Райс, Б.А., Монахи, Б. и Sawicki, J.A. (

1996

) Элементы в 5'-нетранслируемой области мессенджера c-mos мыши репрессируют трансляцию нижестоящих кодирующих последовательностей.

Различия в росте клеток.

,

7

,

1415

–1424.

53 Март, Дж. Д., Оверелл, Р. У., Мейер, К. Э., Кребс, Э. Дж. и Перлмуттер Р. (

1988

) Трансляционная активация протоонкогена lck.

Природа

,

332

, 171–

173.

54 Hinnebusch, A.G. (

1997

) Трансляционная регуляция дрожжевого GCN4. Окно о факторах, которые контролируют связывание инициатора-trna с рибосомой.

J. Biol. Chem.

,

272

,

21661

–21664.

55 Hinnebusch, A.G. (

1994

) Трансляционный контроль GCN4: барометр in vivo активности фактора инициации.

Trends Biochem. Sci.

,

19

,

409

–414.

56 Ruan, H., Шанц, Л.М., Пегг, А. и Моррис, Д. (

1996

) Открытая рамка считывания вышеупомянутой мРНК, кодирующей S-аденозилметионинкарбоксилазу, представляет собой реагирующий на полиамин элемент управления трансляцией.

J. Biol. Chem.

,

271

,

29576

–29582.

57 Бернштейн Дж., Шефлер И. и Элрой-Стейн, О. (

1995

) Репрессия трансляции, опосредованная лидером мРНК тромбоцитарного фактора роста 2 / c-sis, снимается во время мегакариоцитарной дифференцировки.

J. Biol. Chem.

,

270

,

10559

–10565.

Saddle Ranch Chop House | Стейки - Bulls

We Care at Saddle Ranch…

ДОБРО ПОЖАЛОВАТЬ, ГОСТИ С СЕДЛОВОГО РАНЧА

Мы внедряем следующие протоколы безопасности. Здоровье и безопасность наших гостей и членов команды всегда являются нашим главным приоритетом, и мы продолжим принимать все необходимые меры для обеспечения этого.

ЧТО ВЫ МОЖЕТЕ ЖДАТЬ ОТ НАС:

Здоровые члены команды
Постоянные проверки здоровья всех членов команды перед каждой сменой, включая проверку температуры с помощью термометра.

Чистые рестораны
Столы, стулья, стойки для напитков, столешницы, туалеты, подъезды и все часто используемые поверхности регулярно очищаются и дезинфицируются.

Социальное дистанцирование
Изменена планировка гостиной и столовой.

Защитное снаряжение
Надлежащие защитные маски и перчатки для каждого члена команды.

Меню
Одноразовые бумажные меню.

Частое мытье рук
Все члены команды часто моют руки во время смены.

Дезинфицирующее средство для рук
Множество диспенсеров в ресторанах и на рабочих местах.

Уведомление о посадке
Отправка текстового сообщения на персональные устройства наших гостей, чтобы наши гости могли ждать за пределами ресторана.

ЧТО МЫ ЦЕНИМ ОТ ВАС (НАШИ ГОСТИ):

Здоровые гости
Если вы испытываете симптомы респираторного заболевания, включая жар или кашель, или если в течение последних четырнадцати (14) дней у вас был тесный контакт с кем-то с диагнозом COVID-19, просим вас пообедать с нами в другое время.Вы также можете позвонить нам по телефону (Sunset 323-656-2007) или (Orange 657-221-3136), чтобы вам доставили ваш заказ на вынос, или вы можете посетить наш веб-сайт, чтобы узнать о других вариантах доставки.

Планируйте вперед
Если возможно, сделайте предварительный заказ. Войдите на сайт thesaddleranch.com

Не собирайтесь
В главном входе / вестибюле, в баре, в столовой или во внутреннем дворике.

Дайте товарищам-гостям их пространство
Сохраняйте физическое расстояние не менее шести футов (6 футов) от всех гостей, которые не входят в вашу группу.

Ношение маски
Пожалуйста, надевайте маску при входе, сидении или прогулке по помещению ресторана. Мы просим не снимать маску, если вы не едите или не пьете.

Еда должна быть заказана
Все гости должны есть

Барная стойка закрыта
Не сидеть и не стоять в баре. все блюда и напитки должны быть за столом. (Только для округа Лос-Анджелес)

… Вместе мы можем сохранить здоровье и безопасность друг друга.

Хорошо, парк Кэла Андерсона ** технически ** закрыт, в то время как очистка CHOP продолжается - но кому-то нужно полить протестные сады

Cal Anderson Park открыт - в зависимости от того, какой вход вы используете, и от вашей готовности быть вытесненными рабочей бригадой Seattle Parks или сотрудником полиции Сиэтла . Ведь кому-то нужно поливать садовые участки ЧОП.

CHS сообщал ранее на этой неделе о проводимых ремонтных и очистных работах по восстановлению E Pine и Cal Anderson, а также о некоторых непредвиденных последствиях благих намерений, которые оставили у организаторов Black Life Matters плохое предчувствие по поводу приверженности города достижению целей Движение.

Seattle Parks ответил, чтобы прояснить, что Кэл Андерсон все еще технически закрыт для публики.

«Парк пока остается закрытым», - сказал пресс-секретарь CHS. «У наших бригад есть как минимум еще одна неделя (может быть, две) работы - устранить повреждения убежища и туалета, отремонтировать ирригационную систему, а также провести дальнейший ремонт и профессиональную очистку газонного поля, а также дополнительное удаление граффити». Городские власти заявляют, что они также работают над сохранением некоторых произведений искусства ЧОП и «увековечивают аспекты общественных протестов в парке Кэла Андерсона, такие как сад, искусство и / или уголок оратора».”

CHS обнаружил, что парк используется соседями и посетителями, гуляющими или берущими собак для возни. Мы также слышали, как несколько человек попросили полицию покинуть парк - некоторые, ах, во время пикника.

Некоторым жильцам потребуется доступ в пространство. Сиэтл Паркс сообщает соседям, что общественные садовые участки, заложенные городским фермером Маркусом Хендерсоном в парке в течение нескольких недель пребывания в ЧОПе и кемпинга, не будут обслуживаться городским персоналом.

«Текущий план состоит в том, чтобы оставить сад на месте до позднего летнего / осеннего сбора урожая, а затем поработать с Маркусом и заинтересованным сообществом над долгосрочным планом», - сказал CHS представитель парков.

Сообщается, что город поливает некоторые участки - и мы видели несколько волонтерских усилий городских служащих - но жителей поощряют помогать ухаживать за участками.

Между тем, более существенная - но, возможно, менее неприятная - работа будет проходить в среду в здании муниципалитета Сиэтла , где бюджетный комитет городского совета займется основным элементом требований CHOP - борьбой за отказ от финансирования СДПГ и сокращение бюджет полиции Сиэтла на 50%.


ПОМОГИТЕ CHS «ПЛАТИТЬ ЧТО ВЫ МОЖЕТЕ» ДЛЯ КАЖДОГО - ПОДПИШИТЕСЬ СЕГОДНЯ! Поддержите местную журналистику, посвященную вашему району. ПОДПИСАТЬСЯ ЗДЕСЬ. Присоединяйтесь, чтобы стать подписчиком за 1 доллар / 5 долларов / 10 долларов в месяц, чтобы помочь CHS предоставлять новости сообщества с помощью NO PAYWALL . Вы также можете оформить единовременный ежегодный платеж.


LPL улучшает ClientWorks, позволяя сократить время открытия счета на пять минут

Поскольку LPL Financial пытается сэкономить консультантам один час в день за счет усовершенствования технологий, он начинается с пяти минут.

Новый инструмент для открытия счета, который будет запущен в понедельник на ClientWorks, цифровой рабочей станции LPL для консультантов, имеет на 30% меньше полей и может использовать существующие данные клиентов для предварительного заполнения 90% информации, необходимой для открытия нового счета.

[Подробнее: Эндрю Салски из Чарльза Шваба: Расширенные возможности цифровой адаптации консультантов в 2020 году]

LPL утверждает, что новый процесс упрощает навигацию, повышает точность данных и сокращает среднее время, необходимое консультанту для открытия счета, с девяти минут до четырех.Хотя это может показаться не очень большим, Берт Уайт, управляющий директор LPL по инвестиционным решениям и инвестиционным решениям, сказал, что это может означать экономию 6000 часов каждый месяц для всех советников LPL.

«Это впечатляет. Мы ускоряем стандарты финансовых услуг и меняем то, что консультанты должны ожидать от технологий, потому что это то, что нужно консультантам и их клиентам », - сказал г-н Уайт в своем заявлении.

Новый инструмент для открытия счета также будет интегрирован с eSignature и AdvisoryWorld, программным обеспечением для создания предложений, которое LPL приобрела в прошлом году за 28 миллионов долларов для «сквозного» процесса открытия счета.

По словам г-на Уайта,

LPL изучает рабочие процессы консультантов и принимает отзывы о том, как можно упростить, оптимизировать и интегрировать другие части своей технологии, чтобы помочь консультантам тратить меньше времени на административные и офисные задачи.

LPL утверждает, что новый инструмент для открытия счета обеспечивает большую прозрачность при мониторинге операций по открытию новых счетов, но не уточняет, что именно это влечет за собой. Фирма не смогла ответить на запросы о дополнительных комментариях.

На ежегодной конференции LPL Focus в августе президент и главный исполнительный директор Дэн Арнольд сказал, что такая напряженная работа занимает 40% рабочих дней консультантов - времени, которое можно было бы лучше потратить на высокоприоритетную работу, которая привлекает клиентов и дифференцирует практику.Г-н Арнольд сказал, что компания считает, что различные улучшения ClientWorks могут создать дополнительный час в день для консультантов LPL.

Несколько институциональных фирм пытаются улучшить процесс открытия счетов для консультантов. Например, в ноябре 2018 года Advisor Group представила безбумажный ввод в сеть своих независимых брокеров-дилеров.

Когда в 2018 году Эндрю Салски принял на себя руководство технологией консультантов Чарльза Шваба, он сделал цифровую адаптацию своим приоритетом; фирма работает с Envestnet Tamarac, чтобы сделать открытие счетов полностью безбумажным.Fidelity использует интеграцию с Orion Advisor Services для автоматизации открытия счета.

Открытие дома Rib & Chop House в Каспере, Вайоминг

После 18 лет работы на рынке Вайоминга отель Rib & Chop House в штате Вайоминг обрел новый дом в историческом центре города Каспер. Семейный стейк-хаус откроется в декабре этого года по адресу: 256 S. Center Street.

Wyoming’s Rib & Chop House начнет переезжать в недавно отремонтированное помещение в ноябре, в результате чего ресторан станет 10-м рестораном Rib & Chop House и 5-м местом в Вайоминге.Рестораном будут владеть и управлять Рори Сандовал, давний главный операционный директор Rib & Chop House и владелец пивоваренной компании «Соучастник», а также Крис О’Брайан, вице-президент по операциям Rib & Chop House.

«Мы не можем сказать достаточно о расположении, исторической природе здания и о проведенном необычном ремонте. Для нас это прекрасная возможность, наконец, донести концепцию Rib & Chop House до сообщества Casper и поделиться нашим гостеприимством Rocky Mountain с центральным Вайомингом.- сказал Сандовал.

С момента своего открытия в 2001 году в Ливингстоне, штат Монтана, ресторан Rib & Chop House был известен в Скалистых горах благодаря своим свежим морепродуктам, отмеченным наградами ребрышкам и сертифицированным стейкам из говядины Ангус. Сандовал сказал: «Долгосрочный успех компании обусловлен нашим стремлением подавать отличную еду и страстью к тому, чтобы доставить особые впечатления каждому гостю».

О'Брайан и его семья имеют особую связь с Каспером: «Я очень взволнован, привезя дом Rib & Chop House в Каспер.Это прекрасное сообщество, которым моя семья и я наслаждались на протяжении многих лет, и мы рады снова стать его частью. Я с нетерпением жду возможности предоставить жителям Каспера исключительный гастрономический опыт ».

Меню будет таким же, как в других заведениях Wyoming Rib и Chop House, предлагая классические стейк-хаусы в сочетании с более уникальными закусками, отличные варианты для детей и семей, а также полный бар с разливным региональным пивом.

Об авторе

alexxlab administrator

Оставить ответ