Разрядная сетка: Понятие разрядной сетки. Понятие переполнения. Понятие машинного нуля.

Разрядная сетка: Понятие разрядной сетки. Понятие переполнения. Понятие машинного нуля.

Содержание

Понятие разрядной сетки. Понятие переполнения. Понятие машинного нуля.

Разрядная сетка – это кол-во двоичных разрядов, выделяемых в памяти для отображения чисел. Она напрямую зависит от разрядности процессора. Если число вышло за пределы разрядной сетки слева, то говорят о переполнении разрядной сетки. Если справа – то о возникновении машинного нуля.

  1. Сложение и вычитание в обратном и дополнительном коде. Переполнение и его устранение.

см. 13.

  1. Код со смещением: определение, назначение, правила выполнения сложения и вычитания.

смещение +3

прямой код

смещенные числа

код со смещением

4

0. 100

7

111

3

0.11

6

110

2

0.10

5

101

1

0.01

4

100

0

0.00

3

011

-1

1.01

2

010

-2

1. 10

1

001

-3

1.11

0

000

Код со смещением позволяет сдвинуть числовую шкалу, содержащию как положительные, так и отрицательные числа, полностью в область положительных чисел.

– максимальное число в смещенном коде.

1- – минимальное число в смещенном коде.

+

A

+

смещение

B

+

смещение

-

A+B

+

2* смещение

смещение

A+B

+

смещение

При вычитании аналогично прибавлять смещение.

Разрядная сетка машины - Энциклопедия по машиностроению XXL

На первый взгляд кажется, что можно неограниченно уточнять расчет, выбирая достаточно малый шаг h. И это было бы справедливо, если бы расчеты велись абсолютно точно. На самом же деле, чем меньше шаг, тем меньшие добавка Ау = /if (у, t) на каждом шаге и тем больше относительная ошибка округления, неизбежная в связи с ограниченностью разрядной сетки машины. Поэтому на практике методом Эйлера в чистом виде не пользуются, предпочитая более сложные методы, позволяющие, однако, вести интегрирование с большим шагом.  
[c.456]

Рис. 23. Разрядная сетка машины, представленная с фиксированной точкой а - для дробных чисел
Разрядная сетка машины 42, 52 Распределение памяти 67, 94,115 Регистр 60 Режим работы ЭВМ  [c. 334]

В рассматриваемой задаче плохая обусловленность связана с тем, что в решении имеются возрастающие и убывающие компоненты. Из уравнения (3.16) следует, что для определения произвольных постоянных необходимо, чтобы, по крайней мере, выполнялось неравенство е >б, где б —неизбежная погрешность, связанная с ограниченностью разрядной сетки машины. Эта погрешность при вычислениях в режиме с плавающей запятой представляется в виде  [c.68]

Таким образом, неявная схема Эйлера устойчива при любых значениях Дт, или безусловно устойчива. Явная схема устойчива лишь при выполнении ограничения на значение шага (1.42), или условно устойчива. При попытках проводить расчеты с шагами Дт, превышающими предельно допустимые из условия устойчивости значения, происходит раскачка ( разболтка ) разностного решения, приводящая к абсурдным числовым результатам или даже к машинному останову из-за переполнения разрядной сетки.  

[c.31]

Программа-загрузчик предназначена для активации в работу программ пользователя. Для этого загрузочные модули, являющиеся результатом трансляции программы пользователя с языка программирования в машинные команды, помещаются в область памяти, указываемую загрузчику управляющей программой ОС, и производится настройка адресов машинных команд на конкретное место МОЗУ. Совместно с загрузчиком работает редактор внешних связей (РВС), при помощи которого происходит объединение независимо транслированных программных блоков в единую рабочую программу. После того как все загрузочные модули будут помещены в МОЗУ, настроены по месту их расположения и между ними установлены связи, управляющая программа ОС передает управление сформированной программе пользователя и контролирует ход ее работы, не допуская аварийных ситуаций, таких как попытка произвести запись в поле программы другого пользователя или переполнение разрядной сетки ЭВМ.  

[c.208]

Алгоритмические языки в основном не приспособлены для обработки информации, записанной в сжатом виде. В ряде трансляторов предусмотрены некоторые операторы, работающие с машинными кодами, что позволяет обрабатывать отдельные элементы слова. В противном случае объем информации (число перфокарт) и требуемый объем запоминающего устройства резко возрастают. Малые ЭВМ, а также некоторые управляющие вычислительные машины производят действия над числами, представленными в ячейке с весьма ограниченной разрядной сеткой (4—5 десятичных разрядов и менее), с фиксированной запятой. Это при решении ряда задач  [c.8]


В оперативной памяти вычислительной машины трехмерные скелетные матрицы записываются с использованием разрядной сетки. Каждому элементу матриц соответствует один разряд, в который Засылаются 1 или 0. Для размещения матрицы в ЭЦВМ Минск-22  
[c.261]

Оценить устойчивость динамических систем высокого порядка, не используя критерии устойчивости, можно в результате построения переходного процесса на моделирующей или цифровой ЭВМ или путем определения корней характеристического уравнения. Но и в этом случае имеют место принципиальные ошибки, которые появляются по причине неустойчивости счета, ограничения разрядной сетки цифровой машины или погрешностей моделирования.[c.14]

Ошибки выставки и ввода начальных условий задаются случайными переменными, и определяют начальное значение матрицы ко-вариаций. Вычислительные погрешности имитируются белым шумом с интенсивностью, зависяш,ей от разрядной сетки вычислительной машины.  [c.118]

В машинах, использующих плавающую запятую, также может происходить переполнение, но только разрядов, отведенных под порядок. Переполнение разрядной сетки приводит к прекращению дальнейшего решения задачи, т. е. к остановке машины.  [c.225]

Переполнение разрядной сетки можно выявить различными способами. Например, в машине Урал принят способ, основанный на применении модифицированного обратного кода (,..) р. Сущность его состоит в том, что знак числа в целой части пишется в двух разрядах (2 и 2 ). Сложим те же два числа, сумма которых больше единицы, в обратном модифицированном коде  

[c.229]

Надо иметь в виду, что когда числа представляются с фиксированной запятой, появляются определенные трудности в обеспечении правильности решения задачи и бесперебойной работы ЭЦВМ. Чтобы не допустить переполнения разрядной сетки, т. е. чтобы исходные данные, промежуточные и окончательные результаты расчетов в процессе решения всей задачи были правильными дробями (меньше единицы), необходимо использовать масштабные коэффициенты. Выбор этих множителей — задача весьма сложная. Надо следить, чтобы не было переполнения и в то же время обеспечить необходимую точность решения задачи. Поэтому приходится на различных этапах решения задачи принимать неодинаковые масштабные множители, что приводит к усложнению алгоритма решения задачи. Бывает и так, что решение задачи на машине с фиксированной запятой оказывается практически неосуществимым.  [c.230]

Таким образом, важно обращать внимание на факторы, осложняющие оба вида машинного моделирования для АВМ — ограничения по количеству и коммутации блоков, неидеальность операционных элементов АВМ — случайные погрешности (см. В.2), машинная неустойчивость (см. В.4), ограниченный динамический диапазон (см, В. 5) для ЦВМ — ограниченная разрядная сетка, масштаб времени, дискретность времени, обеспечение устойчивости и сходимости вычислительного процесса.  [c.10]

Даже для задач, которые сравнительно просты с математической точки зрения, требуется учитывать огромное количество мелких деталей, для того чтобы получить робастную, или надежную реализацию алгоритма с учетом конечной разрядной сетки ЭВМ. Эти детали могут быть настолько доминирующими, что единственным эффективным способом успешного использования алгоритма станет его воплощение в виде математического программного обеспечения. Математическое, или вычислительное программное обеспечение представляет собой не что иное как реализацию алгоритма решения некоторой математической проблемы на вычислительной машине. В идеальном случае оно должно быть надежным, мобильным и не зависеть от типа ЭВМ или используемой системы.  [c.257]

Улучшение метода Ньютона было предложено Теме-шем и Калаханом [33] применительно к анализу схем, в которых нелинейными компонентами являются транзисторы и диоды. Это улучшение заключается в переходе от экспоненциальных к обратным им логарифмическим нелинейностям в ММС, что повышает вероятность сходимости и устраняет появление в процессе итераций больших чисел, выходящих за пределы разрядной сетки машины. Задача анализа частотных характеристик малосигнальных схем машинными методами подробно рассмотрена в работе [5]. В малосигнальных схемах система дифференциальных уравнений (1.8а) линейна и принимает вид У=АУ-)-Вивх, где V — вектор приращений переменных состояния по отношению к значениям переменных состояния в статическом режиме Ывх — вектор переменных составляющих входных напряжений и токов, А и В — постоянные матрицы. Кроме того, можно выделить вектор ивых приращений тех напряжений и токов, которые рассматриваются как выходные. Очевидно, что Цвых связано с V и Ывх также линейным соотношением  [c.104]


Точность. Погрешности решения задачи определяются особенноетями используемых моделей, численных методов, ограниченностью разрядной сетки ЭВМ. Каждый источник погрешности должен контролироваться, с тем чтобы погрешности не превысили предельно допустимые. Обычно точность результатов, получаемых с помощью численного метода, зависит от некоторых параметров, выбираемых по умолчанию или задаваемых среди исходных данных. С помощью этих параметров можно управлять погрешностями решения, но необходимо помнить, что снижение погрешностей возможно лишь до некоторого отличного от нуля предела и, как правило, сопровождается увеличением затрат машинного времени. Целесообразно в математическом обеспечении САПР иметь не один, а несколько методов одинакового целевого назначения, но с различными возможностями компромиссного удовлетворения противоречивых требований точности и экономичности.  [c.224]

Средний уровень в структуре технического обеспечения САПР будет представлен в основном супермини-ЭВМ, имеющими 32-разрядную сетку, быстродействие в сотни тысяч — единицы миллионов операций в секунду и емкость оперативной памяти в единицы — десятки мегабайт. Машины этого уровня смогут взять на себя функции управления работой САПР, хранения и функционирования базы данных, выполнение большинства проектных процедур.  [c.382]

Примечание. Неприятности, связанные с ограниченной длиной разрядной сетки ЭВМ, на практике устраняются либо представлением вещественных чисел в особых машинных форматах ( удвоенной , учетверенной точности), либо специальным построением числовых алгоритмов (примером может служить алгоритм решения системы лниейпых алгебраических уравнений с выбором ведущего элемента ).  [c.8]

Другим источником погрешности определения производной, существенно влияющим на выбор величины шага дифференцирования, являются неточности вычислений значений функции вследствие ограниченности разрядной сетки в1>1числительной машины.  [c.70]

В оперативной памяти вычислительной машины матрицы Л = i (2ij , fi = 6ij , = i ijll могут быть записаны с использованием разрядной сетки, причем каждому элементу матриц соответствует один разряд, в который засылаются 1 или 0. Например, в ЭЦВМ Минск-22 матрица записывается в массиве, содержащем хп ячеек (ячейка оперативной памяти имеет 37  [c.256]

Самым же слабым звеном всего процесса синтезирования голограм остается выдача результатов. Цель вычислений - получение готовой цифровой голограммы, которую можно было использовать в физическом голографическом процессе, причем желательно, чтобы голограмму строила сама машина без дополнительных операций. Таких машин, пригодных для широкого пользователя, пока нет, поэтому приходится идти на различные упрощения, связанные с частичной потерей информации. Одним из них является использование серийных печатающих устройств ЭВМ, например АЦПУ - алфавитно-цифровое печатающее устройство. В этом случае разрядная сетка печатающего устройства приравнивается к строке сетки 6 и функция прозрачности голограммы Tpq воспроизводится с помощью различных символов, что, конечно, делает вопроизведение приближенным.  [c.77]

Рис. 112. Разрядная сетка памяти одноадресной машины
Номера ячеек памяти и команды записываются на бланках в восьмеричной системе счисления. Решение задач машины производят в двоичной системе счисления. Кроме того, для ввода числового ма териала и вывода результатов решения задачи используется двоичнодесятичное представление чисел в так называемой нормальной форме, Разрядная сетка памяти одноадресной машины изображена иг рис. П2. Разряды ячеек нумеруются по порядку слева направо неполной с О до 19 и полной с О до 39. В неполную ячейку можно поместить команду (рис. 112,а) или двоичное число с фиксированной запятой (рис. 112,6). Команда представляет собой восьмеричное число, состоящее из кода рперации (/—6 разряды), адресной части (7—18 разряды), признака изменения адреса (нулевой разряд) и признака полной ячейки 19 разряд).  [c.249]
Рис. 113. Разрядная сетка памяти трехадресной машины
Разрядная сетка памяти трехадресной машины изображена на рис. ПЗ. Разряды ячеек нумеруются по порядку справа налево с 1 до 45. В ячейку можно поместить команду или двоично-десятичное или двоичное число. Например, команда (рис. ПЗ, а) представляет собой восьмеричное число, состоящее из кода операции (37—42 разряды), адресной части (первый адрес Ах занимает разряды с 25 по 36, второй А2 — с /5пои третий Аз — с. 1 по 12) п признака изменения адресов первого Ах, второго А2 и третьего Аз (соответственно 45, 44 и 43 разряды). Двоично-десятичное число размещается в ячейке следующим образом с 1 по 36 разряд занимает мантисса (9 десятичных цифр), с 37 по 42 разряд занимает порядок, в 43 разряде помещается знак порядка, в 44 — знак числа пъ 45 — признак числа и т. д.  [c.250]

Для достаточно больших т численные значения цилиндрических (или сферических — в трехмерном случае) функций могут выходить за разрядную сетку применяемой вычислительной машины. Для устранения этого явления полезно ввести замену этих функдай другими, выделить сильно растуцце при увеличении т множители и затем сократить их в левой и правой частях системы уравнений.  [c.95]

Таким образом, имеет порядок (Мт) и ряд сходится. Заметим, однако, что этот ряд сходится медленнее, чем ряд (3.117), и при вычислении интеграла (3.123) с помощью ЭВМ возможная ситуация, при которой Jq обратится в машинный нуль, а выйдет за разрядную сетку, хотя сходимость еще не будет обеспечена. Поэтому для вычислений следует сумму (3.122) разбить на две суммы от О до jVи от JV- 1 до °°, где N находится из соотношения Af(7V+ 1) я (3 5)ка, т. е. (3 -rS)f fl/M — 1, но не менее двух. Первая сумма вычисляется непосредственно, для второй суммы используется приближенное соотношение (3.124). Кроме того, можно применить методы улучшения сходимости, используя оценку (3.125). Гораздо более простое выражение для вещественной составляющей (сопротивления излучения) можно получить другим способом. Запишем выражения для излучаемой мощности в виде  [c.182]



Разрядная сетка - Большая Энциклопедия Нефти и Газа, статья, страница 1

Разрядная сетка

Cтраница 1

Разрядная сетка при операциях с фиксированной запятой в значительно большей степени, чем при работе с плавающей запятой, влияет на точность представления чисел. Чем больше разрядов в ячейке памяти, тем с большей точностью ( с большим количеством знаков) может быть записано в ней число.  [1]

Разрядная сетка такой машины содержит определенное количество цифровых разрядов и один знаковый разряд. Некоторое число разрядов отводится под целую часть числа, остальные - под дробную. На рис. 36 представлена разрядная сетка, в которой может быть записано 15 разрядов числа, из них 7 разрядов целых, а 8 - дробных.  [3]

Разрядная сетка ЭВМ и форма представления числовой информации однозначно определяют диапазон представляемых в ЭВМ чисел и как следствие точность получаемых результатов.  [5]

Разрядные сетки памяти одноадресной и трехадресной ЭЦВМ, для которых написан порядок выполнения некоторых команд, обеспечивают требуемую точность расчетов при решении практических тяговых задач и при выполнении исследований в этой области. Размещение чисел и команд в сумматоре соответствует распределению разрядов в ячейках оперативной памяти.  [6]

Разрядная сетка ЭВМ и форма представления числовой информации однозначно определяют диапазон представляемых в ЭВМ чисел и как следствие точность получаемых результатов.  [8]

Если разрядная сетка ЭВМ не позволяет хранить обе координаты в одной ячейке, то все усложняется. Координаты х и у должны передаваться в дисплей отдельными командами, и необходимо иметь третью команду для подсвечивания точки.  [9]

Переполнение разрядной сетки той части сумматора, которая отведена для оперирования мантиссами, не мешает получению искомой суммы или разности. Переполнение разрядной сетки в целом после сложения или вычитания может произойти только при увеличении порядка п2 на 1 и заключается в переполнении той части разрядной сетки, которая отведена под порядок.  [10]

Переполнение разрядной сетки при сложении s модифицированных машинных кодах обнаруживается способом сравнения знаковых разрядов полученной суммы.  [11]

Переполнение разрядной сетки возможно при сложении операндов с одинаковыми знаками. Оно может быть определено по наличию переноса из старшей тетрады. При выполнении операции вычитания меняется знак второго операнда, после чего действия над десятичными числами производятся так же, как и при сложении.  [12]

Переполнение разрядной сетки может наступить только при сложении чисел одинакового знака.  [13]

Переполнение разрядной сетки той части сумматора, которая отведена для оперирования мантиссами, не мешает получению искомой суммы или разности. Переполнение разрядной сетки в целом после сложения или вычитания может произойти только при увеличении порядка я2 на 1 и заключается в переполнении той части разрядной сетки, которая отведена под порядок.  [14]

Длина разрядной сетки - термин, используемый для определения длины числа. В разных системах счисления длина разрядной сетки при записи одного и того же числа неодинаковая. Из примера видно, что одно и то же число, записанное в разных системах счисления, имеет разную длину разрядной сетки.  [15]

Страницы:      1    2    3    4

Информатика и ИКТ - Представление информации

Представление числовой информации

Целые числа

Для представления целых чисел в компьютере существуют два представления: беззнаковое (для неотрицательных чисел) и знаковое.

В беззнаковом целом все разряды используются для двоичной записи числа. Соответственно, в n-разрядной сетке можно представить числа от 0 до 2n-1. (Для 1-байтного беззнакового целого диапазон значений будет от 0 до 255; для 2-байтного — от 0 до 65535).

Если нужно представлять не только положительные, но и отрицательные значения, обычно используют дополнительный код. Он имеет следующие особенности:

  • старший («знаковый») разряд отрицательного числа имеет значение 1, а положительного — 0;
  • число 0 (ноль) имеет единственное представление, в котором все разряды равны нулю;
  • сложение чисел со знаком в дополнительном коде выполняется так же, как сложение чисел без знака, включая знаковый разряд, который при сложении ничем не отличается от других разрядов.

Для положительных чисел дополнительный код совпадает с прямым (т.е. фактически его двоичной записью).

Для отрицательных — 2n-|m|, где m — кодируемое число, n — количество разрядов в сетке.

Фактически, дополнительный код — это число, которое нужно добавить к модулю исходного, чтобы достичь переполнения разрядной сетки. От этого и происходит название «дополнительный».

Для получения дополнительного кода отрицательного числа следует сделать следующее:

  1. Записать модуль числа в прямом коде.
  2. Инвертировать каждый разряд получившейся записи (заменить нули на единицы, а единицы — на нули). Получится так называемый «обратный код».
  3. Прибавить к результату единицу.

Пример работы с числами в дополнительном коде

Запишем в дополнительном 8-разрядном коде числа 72 и -46. Затем найдем их сумму и преобразуем результат в десятичную запись.

1 число.

7210 = 10010002. Запись в восьмиразрядной сетке: 01001000.

2 число.

-4610 = -1011102.

  1. Записываем модуль числа в 8-разрядной сетке: 00101110.
  2. Инвертируем разряды полученной записи: 11010001.
  3. Прибавляем к результату единицу:

Таким образом получаем запись в дополнительном коде: 11010010.

Сложим полученные числа:

Перенос из старшего разряда выходит за разрядную сетку и просто отбрасывается: 00011010.

Полученное число переведем в десятичную систему счисления:

110102 = 2610.

Действительно, 72 - 46 = 26.

Числа с плавающей точкой

Для представления вещественных (действительных) чисел в современных компьютерах принят способ представления с плавающей точкой (запятой). Этот способ представления опирается на нормализованную (ее еще называют экспоненциальной) запись действительных чисел.

Нормализованная запись отличного от нуля действительного числа — это запись вида a = m * Pq, где q — целое число, а m — правильная P-ичная дробь, у которой первая цифра после запятой не равна нулю, то есть

1/P ≤ m < 1.

При этом m называют мантиссой, а q — порядком числа.

Примеры:

3,1415926 = 0, 31415926 ⋅ 101;

1250000=0,125 ⋅ 107;

0,123456789 = 0,123456789 ⋅ 100;

0,000076 = 0,76 ⋅ 10-4;

1000,00012 = 0,100000012 ⋅ 24. (порядок записан в десятичной системе)

Для хранения чисел с плавающей точкой в компьютерах обычно отводится 4, 8 или 10 байт.

Чем больше разрядов отводится под запись мантиссы, тем выше точность представления числа.

Чем больше разрядов занимает порядок, тем шире диапазон от наименьшего до наибольшего представимого числа.

Найти в Интернет более подробную информацию о кодировании чисел

Кодирование текстовой информации

Текст — это последовательность символов (букв, цифр, знаков препинания, математических знаков и т.д.). Как и любая другая информация, в компьютере текст представляется двоичным кодом. Для этого каждому символу ставится в соответствие некоторое положительное число, двоичная запись которого и будет записана в память компьютера. Соответствие между символом и его кодом определяется кодовой таблицей.

Современные кодовые таблицы ведут начало от американского стандартного кода обмена информацией ASCII (American Standard Code for Information Interchange). Он был семибитным и, соответственно, позволял представить 27=128 различных символов. Таблица включала буквы латинского алфавита, цифры, основные знаки и управляющие символы (перевод строки, возврат каретки, табуляция и др.).

В дальнейшем широкое распространение получили восьмибитные кодировки, в которых каждый символ текста был представлен полным байтом. В большинстве из них первые 128 кодов повторяли таблицу ASCII, а следующие («верхняя половина кодовой таблицы») использовались для представления символов национальных алфавитов и полиграфических знаков.

Во многих случаях для одного и того же языка было создано несколько кодировок. Например, для кодирования русскоязычных текстов достаточно широко использовалось (и до сих пор в некоторых случаях используются) пять кодировок:

  • KOI8-r (Код Обмена Информацией 8-битный Русский). Основные сферы использования — компьютеры с операционными системами Unix/Linux, электронная почта, редко — сайты.
  • CP-866 (Code Page 866). Тексты, созданные на компьютерах, работавших под MS-DOS (и совместимыми операционными системами), сеть FidoNet.
  • CP-1251 (также Windows-1251). Документы, созданные под MS Windows. Сайты.
  • MacCyrillic (Кириллическая кодировка Mac OS). Документы, созданные под классической Mac OS.
  • ISO-8859-5 (5 таблица стандарта 8859 International Organization for Standardization). Единственная 8-битная кириллическая кодировка, имеющая статус международного стандарта. На практике в России почти не встречается. Используется в Болгарии и Сербии на Unix, а также для русскоязычных текстов в западных странах.

Основные недостатки восьмибитных кодировок:

  • Множественные варианты кодировок для одного и того же языка и, как следствие, проблемы с переносом текстов между компьютерами, использующими разные варианты.
  • Невозможность использования в одном тексте (без дополнительных программных ухищрений) разных систем письма (за исключением сочетаний базового латинского алфавита с каким-либо иным алфавитным письмом).
  • Невозможность использования для языков с иероглифической системой письма.

Для устранения этих недостатков в 1991 году был предложен стандарт Unicode («Юникод»). Он включает универсальный набор символов (UCS, Universal Character Set) и форматы машинного представления их кодов (UTF, Unicode Transformation Format).

Первая версия Юникода представляла собой кодировку с фиксированным размером символа в 16 бит, то есть общее число кодов было 216 (65 536). Отсюда происходит практика обозначения символов четырьмя шестнадцатеричными цифрами (например, U+0410). При этом в Юникоде планировалось кодировать не все существующие символы, а только те, которые необходимы в повседневном обиходе.

В дальнейшем было принято решение расширить набор символов за счет различных способов кодирования. Поскольку в ряде систем уже началось использование 16-битной версии Unicode, за основными символами сохранили принятые в ней коды (образовавшие «основную многоязычную плоскость»), а для более редко применяемых назначили «суррогатные пары» — четырехбайтные коды. Эта система кодирования получила обозначение UTF-16. В UTF-16 можно отобразить только 220+216−2048 (1112064) символов, это число и было выбрано в качестве окончательной величины кодового пространства Юникода. Но и этого более чем достаточно — сейчас используется немногим более 100000 кодовых позиций. Unicode включает символы практически всех современных, а также многих древних систем письма.

Для обеспечения совместимости со старыми системами, использовавшими 8-битное кодирование, была разработана система кодирования UTF-8. Она использует коды переменной длины: для символов, входящих в ASCII, применяются коды длиной 1 байт, полностью совпадающие с кодами ASCII. Для остальных символов — коды длиной от 2 до 4 байт (теоретически, до 6).

Существует также UTF-32, в которой для записи любого символа используется 4 байта. Из-за очень неэкономного расхода памяти (в 2-4 раза больше, чем UTF-8, и почти вдвое больше, чем UTF-16) на практике она используется достаточно редко.

В Интернет наибольшее распространение получила система кодирования UTF-8, в MS Windows преимущественно используют UTF-16, в Unix-подобных ОС (включая Linux и Mac OS X) — в основном UTF-8.

Кодирование графической и звуковой информации

В отличие от чисел и текста, графическая и звуковая информация по своей природе — аналоговая (т.е. представляется непрерывным изменением некоторой величины). Компьютер же может работать только с дискретной («разрывной», представляемой скачкообразными изменениями). Поэтому непосредственно закодировать изображение или звук невозможно.

И для одного, и для другого вида информации существуют два способа представления: либо искусственно разбить на малые элементы, либо описать правила формирования.

Изображение

Представление целых положительных чисел в компьютере. Разрядная сетка с фиксированной точкой

Обычно для представления
положительных и отрицательных целых
чисел используется 1, 2 или 4 байта.
Старший бит выделяется под знак
числа: 0-плюс, 1- минус.

2. Представление целых положительных чисел в компьютере Разрядная сетка с фиксированной точкой

2n-1
2n
22
. . .
21
20
Для получения компьютерного представления целого положительного числа в n
– разрядной ячейке памяти необходимо перевести его в двоичную систему
счисления и дополнить полученный результат слева нулями до n разрядов.
Пример 1. Число 5310=1101012 в 8 - разрядном представлении имеет вид:
0
0
1
1
0
1
0
1
Это же число 5310 в 16 - разрядах будет записано следующим образом:
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
1
0
1

3. Представление целых чисел со знаком в компьютере

Знак
0
+
2n
2n-1
. . .
21
20
1
В компьютере для представления чисел со знаком используются
специальные коды: ПРЯМОЙ, ОБРАТНЫЙ и ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ.
Прямой код двоичного числа – это само двоичное число, причем
значение знакового разряда для положительных чисел равно 0, для
отрицательных 1.
Обратный код для положительного числа совпадает с прямым
кодом, а для отрицательного числа все цифры числа заменяются
противоположными значениями. Знак числа остается прежним.
Дополнительный код положительного числа совпадает с прямым
кодом, а для отрицательного числа образуется как результат
суммирования обратного кода с 1 младшего разряда.
Коды десятичных чисел +13 и -13 приведены в таблице:
Число в 10 c/c
Число в 2 c/c
Прямой
код
Обратный
код
Дополнительный
код
+ 13
+1101
00001101
00001101
00001101
- 13
-1101
10001101
11110010
11110011
Пример 1: Запишите двоичное целое число А = -1110 в прямом, обратном и
дополнительном кодах для 8-разрядной сетки.
Решение:
А = -1110
А пк = 10001110
А ок = 11110001
А дк = 11110010
Пример 2: Запишите двоичное целое число В = 1101 в прямом, обратном и
дополнительном кодах для 16-разрядной сетки.
Решение:
В = 1101
В пк = 0000000000001101
В ок = 0000000000001101
В дк = 0000000000001101

Разряды етс \ Акты, образцы, формы, договоры \ Консультант Плюс

]]>

Подборка наиболее важных документов по запросу Разряды етс (нормативно–правовые акты, формы, статьи, консультации экспертов и многое другое).

Статьи, комментарии, ответы на вопросы: Разряды етс Открыть документ в вашей системе КонсультантПлюс:
"Профессиональные стандарты: Учебно-практическое пособие"
(Митрофанова О.И.)
(отв. ред. Д.Л. Кузнецов)
("КОНТРАКТ", 2017)В соответствии со ст. 143 ТК РФ тарифная система дифференциации заработной платы работников различных категорий включает в себя тарифные ставки, оклады (должностные оклады), тарифную сетку и тарифные коэффициенты . Указанные элементы были увязаны в единую межотраслевую систему в 1992 г. Приложением 1 к Постановлению Правительства РФ от 14.10.1992 N 785 была введена единая 18-разрядная тарифная сетка по оплате труда работников бюджетной сферы, в соответствии с которой были определены разряды оплаты труда и соответствующие им тарифные коэффициенты. Профессии рабочих по указанной сетке тарифицировались в соответствии с ЕТКС с первого по восьмой разряд. Высококвалифицированным рабочим, занятым на важных и ответственных работах и на особо важных и особо ответственных работах, была предусмотрена возможность устанавливать тарифные ставки и оклады исходя из 9 - 12 разрядов Единой тарифной сетки . Служащих по тарифной сетке можно условно распределить следующим образом: технические исполнители: 2 - 5 разряды; специалисты: 4 - 13 разряды; младший руководящий состав (мастер участка, начальник участка (смены), производитель работ (прораб)): 6 - 12 разряды; средний руководящий состав (руководители структурных подразделений: отделов, цехов, лабораторий, секторов, служб и т.п.): 11 - 14 разряды; главные специалисты (главный инженер, главный технолог и т.п.): 13 - 17 разряды; руководители учреждения, организации, предприятия: 10 - 18 разряды.

Нормативные акты: Разряды етс

Переполнение разрядной сетки - Справочник химика 21

    Возможность переполнения разрядной сетки необходимо предусматривать при подготовке исходных данных, а также в процессе вычислений. Для этого исходные данные умножаются на соответствующие масштабные коэффициенты, обеспечивающие сохранение значений этих чисел, а также промежуточных результатов в заданном диапазоне. [c.28]

    Максимальное по абсолютной величине число, которое может быть записано в ячейке, будет содержать цифру 9 во всех разрядах и равно 0,99999-10 . Если в результате выполнения операции получится результат, превосходящий это число, то вырабатывается аварийный останов машины (переполнение разрядной сетки). [c.423]


    При выполнении арифметических операций с двоичными числами возникает переполнение разрядной сетки машины, если результат превышает единицу, и число воспринимается как машинный нуль, если оно меньше 1-2 . [c.467]

    Использование плавающей запятой значительно расширяет диапазон представляемых чисел в машине. Например, для машины с 36-разрядной сеткой ( Минск-22 ) максимальное число по модулю, представляемое в машине, равно величине порядка 10 , а минимальное — 10 . Числа, выходящие за эти пределы, приводят либо к переполнению разрядной сетки, либо воспринимаются машиной как нуль. [c.29]

    Команды для выполнения арифметических операций подразделяются на два типа команды для выполнения действий с плавающей и фиксированной запятой. При выполнении операций с плавающей запятой результат обязательно нормализуется, причем при выравнивании порядков в операциях сложения и вычитания меньшее число округляется. Если результат не может быть нормализован из-за переполнения разрядной сетки машины, то вырабатывается сигнал аварийного останова. Это возможно, если результат больше, чем 10 , или при делении на нуль. Арифметические операции, выполняемые машиной Проминь , приведены в табл. 27. [c.428]

    В программе предусмотрен ввод масштабного множителя, который предотвращает переполнение разрядной сетки машины в процессе вычисления коэффициентов системы. Точность вычислений — три знака. [c.444]

    Если при выполнении арифметических операций порядок результата больше 63, то происходит переполнение разрядной сетки если порядок меньше —63, то число воспринимается как машинный нуль. [c.468]

    При выполнении некоторых операций в арифметическом устройстве вырабатываются признак нуля и признак переполнения разрядной сетки , которые могут использоваться для передачи управления но признаку результата. [c.470]

    Теперь при вычислении порознь сумм, стоящих в фигурных скобках, мы имеем дело лишь с числами, меньшими единицы, причем ни при одном из промежуточных действий не может возникнуть переполнения разрядной сетки однако сумма, стоящая справа, может оказаться равной единице, а, следовательно, при сложении ее со второй из сумм возможно переполнение. Умножив обе суммы на 0,5, мы избежим этой опасности, и, таким образом, получим окончательно [c.38]

    Если двоичные числа х к у, представленные каждое п целыми и V дробными разрядами, удовлетворяют условию (2.10), то для их дополнительных кодов справедливы при т=п- - - -к формулы (2.6) и (2.8), в чем можно убедиться непосредственной проверкой [30]. Таким образом, сумматор без переноса из старшего разряда позволяет производить сложение чисел, представленных в дополнительном коде. При 1л + у 10" (10—двоичная запись числа два) условие (2.8) оказывается невыполненным и происходит переполнение разрядной сетки сумматора ). [c.75]

    Перед решением задачи на машине вручную просчитывается один из ее вариантов, называемый контрольным, или отладочным. Отладочный вариант нужно просчитывать при тех значениях исходных данных, которые позволяют выявить по возможности большее число ошибок. Результаты, полученные при ручном счете, сравниваются с результатами машинного счета. Однако результаты машинного счета не всегда удается получить сразу, т. е. в программе могут содержаться ошибки в записи команд. Это в особенности относится к программам, составленным в коде машины. Наличие таких ошибок может привести к останову машины, переполнению разрядной сетки машины (аварийный останов), зацикливанию программы. [c.44]


    Недостатком описанного метода, как и всех подобных методов расчета от концов колонны к тарелке питания, является необходимость учета чрезмерно малых концентраций, появляющихся в ходе расчета при наличии в смеси практически нераспределяющих-ся компонентов, почти полностью отсутствующих в одном из конечных продуктов разделения. Это может привести к переполнению разрядной сетки ЭВМ, что требует специальных приемов решения проблемы. Так, объединение нескольких легких, практически нераспределяющихся компонентов в один компонент с относительной летучестью более высококипящего из них и тяжелых, практически нераспределяющихся компонентов в один компонент с относительной летучестью более низкокипящего из них существенно не искажает результатов расчета. [c.59]

    Если число больше максимального, то оно выходит за разрядную сетку машины старшими разрядами, т. е. старшие разряды теряются. Это приводит к так называемому переполнению разрядной сетки и искажению результатов вычислений. [c.28]

    Составить операторную схему программы и программу, отвечающую на вопрос возникнет ли переполнение разрядной сетки машины при сложении этих чисел (не выполняя операцию сложения над этими числами)  [c.74]

    Р5 — проверяет выполнение условия х + /1 0,5 если условие выполнено, то передает управление оператору Аи, в противном случае - оператору Я , Аб — вычисляет значение величины л=1 (л — 1 — признак переполнения разрядной сетки). [c.177]

    При работе с числами с фиксированной запятой эти тумблеры, как правило, должны быть включены. Выключение их допускается только в тех случаях, когда программы построены с учетом особенностей работы машин при переполнении разрядной сетки. [c.19]

    Рассматриваемая функция (9) есть многочлен шестой степени относительно переменной 1, причел заданные параметры отвечают требованиям вычислений в режиме с фиксированной запятой. Однако функция (9) является суммой семи членов, каждый из которых меньше единицы таким образом, / (О I и пол чить ее значение в режиме с фиксированной запятой не удастся из-за возможности переполнения разрядной сетки. Чтобы избежать переполнения, разделим обе части равенства на число А > 7  [c.21]

    При решении задач в режиме с фиксированной запятой в памяти вычислительной машины числа должны все время удовлетворять условию (8). Необходимость обеспечить выполнение этого условия значительно усложняет подготовительный этан программирования и потому относится к существенным недостаткам режима с фиксированной занятой. Чтобы гарантировать отсутствие переполнения разрядной сетки машины на любом этане решения задачи, программист должен проверить выполнимость условия (8) для заданных значений параметров в каждом случае сложения, вычитания и деления, предусмотренном алгоритмом задачи. [c.29]

    Условие (18) показывает, что суммировать в машине выражения, входящие в формулы (12 "), нельзя, так как возникнет переполнение разрядной сетки. [c.36]

    Обратимся к вычислению дроби (23). Формально наибольшему значению этой дроби соответствует величина, которую принимает дробь при наибольшем числителе и наименьшем знаменателе. Подставляя соответствующ,ие значения параметров (см. табл. 5), получили бы абсурд — тепло уходяш их газов оказалось бы больше выделяемого при сгорании топлива тепла. Эта нелепость объясняется умозрительным выбором числовых границ параметров без учета физической сущности их взаимоотношений. Тем не менее программиста такое положение смущать не должно. Более того, иной путь оказался бы затруднительным, а для вычислений не был бы слишком полезен. Б данном случае удобней ограничиться тем соображением из практики работы печей, что часовой расход топлива не превышает 10 000 кг ч с большим запасом на будущее. Разделив предварительно дробь на это число, будем гарантированы от переполнения разрядной сетки при делении. При таком делении мы не должны [c.57]

    Дробь, стоящая в скобках предыдущего выражения, характеризует различие в теплосодержаниях единицы объема воздуха, нагреваемого от температуры во До температуры в и охлаждаемого от Ib" до Ib - Чем больше величина дроби, тем больше нагретого воздуха надо примешать к наружному, чтобы на входе в воздухоподогреватель установилась температура в. Обычно полагают W = = 80° С. Примем такое условие если температура воздуха, до которой должен нагреть его воздухоподогреватель, не будет превышать 110° С, то нагревать воздух предварительно до 80° С мы также не будем. В этом случае, как легко проверить, подставив указанные температуры в предыдущее выражение, величина в круглых скобках не превысит единицы, т. е. переполнения разрядной сетки не произойдет ни нри делении, ни при сложении. Предположим, что максимальное значение круглой скобки — единица. Тогда максимальное значение весовой скорости Wb будет соответствовать моменту, когда [c.61]

    Таким образом, содержимое знакового разряда и 36 разряда в первом ряду лампочек указывает на наличие переполнения разрядной сетки машины если в этих разрядах стоят разные двоичные цифры, то разрядная сетка машины переполнена. [c.97]

    В сумматор засылается нуль, так что становится о = О, после чего выполняется операция o-l-—>. Переполнения разрядной сетки произойти не может. [c.105]

    Переполнения разрядной сетки произойти не может. В первых образцах машины выполняется операция 1 — 1->. [c.105]

    В машинах с плавающей запятой, так же как и для машин с фиксированной запятой, возможно переполнение разрядной сетки, которое заключается теперь в том, что в результате какой-либо операции возникает число, имеющее порядок с большей разрядностью, чем допустимая при представлении порядка в машине. В машинах с плавающей запятой возможно появление машинных нулей, т. е. нормализованных чисел, отличных от нуля, но имеющих порядок, меньший самого малого порядка, представимого в машине обычно машинные нули записываются в виде нулевой мантиссы и нулевого порядка. [c.32]


    При х- -у 0" условие (2.7) оказывается невыполненным и происходит переполнение разрядной сетки сумматора. [c.73]

    Пример 2.5. Пусть и=0, =8, к=2, и пусть д =0,10001001, =0,1101101. В данном случае д +г/= 1,01100100 > 10 = 1 и, следовательно, при циклическом сложении обратных кодов чисел х к у должно произойти переполнение разрядной сетки сумматора. Действительно, сумма х+у обратного кода не имеет. С другой стороны, циклическое сложение величин =0010001001 и [(/]цдр=0011011011 [c.73]

    Замечания. 1. Если А>1, то признаком переполнения разрядной сетки сумматора является возникновение недопустимой комбинации нулей и единиц в знаковых разрядах результата. При к= признаком переполнения разрядной сетки является неравенство старшей цифры результата циклического сложения старшим цифрам кодов и [з ]обр. [c.74]

    Строго говоря, переполнение разрядной сетки происходит при х- -у 10" или х у[c.75]

    При сложении на сумматоре кодов чисел / , Ю " и происходит переполнение разрядной сетки части сумматора, отведенной для оперирования мантиссами (говорят, что произошло нарушение нормализации результата влево ), В этом случае производится исправление результата, заключающееся в сдвиге всех разрядов кода, выдаваемого сумматором, вправо на один разряд. При этом в самом старшем разряде кода сохраняется его содержимое, а младший из удерживаемых разрядов округляется обычным способом.Одновременно порядок увеличивается на единицу. Такое исправление результата равносильно получению в качестве суммы нормализованного числа (т,-Ю +от )-10 ,  [c.82]

    Переполнение разрядной сетки той части сумматора, которая отведена для оперирования мантиссами, не мешает получению искомой суммы или разности. Переполнение разрядной сетки в целом после сложения или вычитания может произойти только при увеличении порядка тг на 1 и заключается в переполнении той части разрядной сетки, которая введена под порядок, В этом случае иа сумматора в управляющее устройство машины передается сигнал о переполнении, называемый, как и для машин с фиксированной запятой, сигналом ф (при переполнении Ф=1, в противном случае Ф = 0), [c.82]

    При сложении порядков сомножителей или вычитании из порядка делимого порядка делителя может произойти переполнение разрядной сетки. В этом случае из арифметического устройства в управляющее устройство передается сигнал ф=1. [c.84]

    Возможности некоторых машин позволяют переходить к пересчету масштабов автоматически, например по сигналу переполнения разрядной сетки. [c.103]

    Операции в арифметическом устройстве выполняются над модулями 33-разрядных чисел. Операции со знаками этих чисел производятся в устройстве управления, куда переносятся знаки исходных чисел и где получается результат операции над знаками. В АУ вырабатывается сигнал переполнения разрядной сетки (сигнал ф). [c.318]

    Если все арифметические действия, требуемые алгоритдюм задачи, решаемой с представлением чисел с плавающей запятой, выполняются по приведенным выше правилам, то переполнения разрядной сетки машины произойти не может. Однако в этом случае рекомендуется включать тумблер Останов ф па машине Урал-1 и тумблер Т—О—Д на машине Минск-1 , так как они служат дополнительным средством контроля правильности работы машин. [c.19]

    Под надписями Блокировка ф и Остановка ф — тумблеры, обеспечивающие управление машиной по переполнению включение тумблера Остановка ф обеспечит остановку машины прхг возникновении переполнения разрядной сетки, если тумблер Блокировка ф будет выключен при том же условии, если тумблер Остановка ф будет выключен тоже, то при возникновении неренолнения машина потеряет единицу переполнения и пропустит следующую по порядку команду, передав -правление через одну команду ели тумблер Блокировка ф будет включен, то сигнал переполнения разрядной сетки вырабатываться не будет и положение соседнего тумблера никакой роли играть тоже не будет расположенная между тумблерами кнопка Сброс Однотактный режим  [c.99]

    Замечания 1. Если число знаковых разрядов дополнительного кода й>1, то переполнение разрядной сетки проявляется в том, что в знаковых разрядах результата возникает недопустимая комбинация нулей и единиц. Это может служить признаком переполнения. При призна- [c.76]

    Сложение и вычитание чисел с фиксированной запятой. Числа с фиксированной запятой, подлежащие сложению или вычитан1 ю, обычно представляют в обратном или дополнительном коде (в зависимости от типа сумматора, которым располагает машина), и операции производятся по правилам, описанным в предыдущем параграфе. Если в запоминающем устройстве эти числа представлены в другом коде, то предварительно производится их перевод в код, принятый для выполнения действий. При переполнении разрядной сетки из сумматора в устройство управления передается специальный сигнал. Этот сигнал, являющийся одноразрядным двоичным числом, принято называть сигналом ф. Таким образом, при переполнении ф=1, а прн отсутствии переполнения ф = 0. [c.80]


границ | Подготовка крио-ЭМ сетки образцов мембранного белка для анализа отдельных частиц

Введение

В течение последних 10 лет были достигнуты впечатляющие успехи в способности решать макромолекулярные структуры с использованием крио-ЭМ, кульминацией которых стала Нобелевская премия по химии 2017 года, присужденная Жаку Дюбоше, Иоахиму Франку и Ричарду Хендерсону за разработку этой техники и применяя его для определения структуры биомолекул в растворе с высоким разрешением (Cheng et al., 2017). Одним из значительных достижений, сделавших возможными недавний прорыв, стало внедрение прямых электронных детекторов с превосходным DQE (Detective Quantum Efficiency) (Milazzo et al., 2011; Bammes et al., 2012), которые также могут работать с более высокой частотой кадров, позволяя записывать фильмов вместо одиночных изображений. Эти функции позволяют корректировать движение образца, вызванное электронным излучением и дрейфом, вызванным изменениями температуры, во время последующих этапов обработки изображения (выравнивание кадра) (Glaeser et al., 2011; Brilot et al., 2012; Ли и др., 2013; Zheng et al., 2017).

Несмотря на эти достижения, до сих пор сложно получить структуры с высоким разрешением отдельных белков или их комплексов. Многие аспекты подготовки проб белка до сих пор плохо изучены, и поэтому их сложно освоить. Здесь мы представляем обзор последних разработок в методах приготовления белка для крио-ЭМ, чтобы облегчить понимание поведения белка и помочь пользователю в этом процессе.

Подготовка и стабилизация образцов белка

Перед тем, как заморозить образец на сетке ЭМ, важно оценить несколько биохимических и биофизических аспектов образца белка, таких как состав, чистота, однородность, стабильность и биохимическая активность (рис. 1A). Предварительное знание молекулярной массы и олигомерного состояния белка, а также состава буфера (концентрация соли, pH, кофакторы, криозащитные средства и другие добавки), в котором белок стабилен, может значительно облегчить приготовление крио-ЭМ сетки (рис. 1А).Кроме того, оценка однородности образца с помощью электронной микроскопии с отрицательным окрашиванием (NS-EM) перед подготовкой крио-EM решетки поможет не только подтвердить, что был соблюден правильный протокол очистки, но также обеспечит отсутствие загрязняющих веществ или продуктов разложения в образец белка. Такие загрязнения могут значительно помешать последующему вычислительному анализу изображений частиц.

Рисунок 1 . Общий рабочий процесс очистки белка и различные стратегии стабилизации мембранного белка с использованием искусственных мембран. (A) Цитоплазматические или мембранные белки первоначально экспрессируются в жидких или твердых культурах, а осадки хранятся после сбора путем центрифугирования. Для высвобождения цитоплазматических белков в раствор или для получения экстрактов клеточных мембран используются различные физические или химические методы разрушения клеток. Загрязненные цитоплазматические белки или солюбилизированные клеточные мембраны, содержащие интересующий белок, очищают с помощью комбинации различных методов быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC).После того, как стабильность, целостность и активность белка проверяются различными биофизическими методами. Конечная концентрация образца и состав буфера корректируются перед подготовкой ЭМ сетки. (B) Трансмембранные домены белков защищены ацильными цепями фосфолипидов гидрофобных клеточных мембран. Мицеллы представляют собой сферические везикулы, в которых гидрофобные цепи детергента обращены внутрь, а гидрофильные полярные головки обращены наружу. Бицеллы получают из смеси липидов и детергентов с короткой цепью.Липиды будут взаимодействовать с белком, образуя липидный бислой, а детергент будет формировать ободок двуцеллы. Мицеллы образуются после солюбилизации мембранного белка детергентами. SMALP (липидные частицы стирола и малеиновой кислоты) представляют собой полимерные наночастицы, которые защищают ацильную цепь липидного бислоя. Нанодиски представляют собой липидные бислои, стабилизированные путем обертывания пояса амфипатических спиральных мембранных каркасных белков (MSP) вокруг мембранных белков, солюбилизированных детергентом. Полимеры амфипола оборачиваются вокруг гидрофобных участков мембранного белка с образованием стабильного комплекса в растворе.Липосомы - это искусственные сферические липидные мембраны, на которых могут собираться мембранные белки.

Приготовление образца мембранного белка

По оценкам, 20–30% генов почти всех известных геномов (эубактериальных, архейных и эукариотических) кодируют мембранные белки (Wallin and Heijne, 1998; Krogh et al., 2001). Мембранные белки играют важную роль в клетках и органеллах, влияя на функцию тканей или поведение организмов (Alberts et al., 2014). Структурная информация необходима для понимания биологических механизмов, в которых эти белки играют решающую роль.Тем не менее, определение трехмерных структур мембранных белков представляет собой наиболее сложный случай из всех белков, в основном из-за, казалось бы, непреодолимых трудностей во время подготовки образцов.

Основной проблемой в биохимии мембранных белков или мембранных белковых комплексов, безусловно, является определение и оптимизация химических условий, способных солюбилизировать белок из мембраны и стабилизировать его нативное состояние в растворе. К сожалению, метод, который работает для одного конкретного белка, может не подходить для другого; поэтому не существует «золотого правила» для эффективной стабилизации любого мембранного белка, и в настоящее время лучшим способом для этого является эмпирический метод проб и ошибок.В любом случае понимание физико-химических свойств, а также плюсов и минусов, связанных с различными методами, может быть полезной отправной точкой для решения, какая стратегия может лучше всего работать в конкретном случае.

В течение многих лет детергенты традиционно использовались для солюбилизации мембранных белков или белковых комплексов, что позволяет стабильно работать с ними в растворе (Seddon et al., 2004; Privé, 2007; Paulsen et al., 2015). Детергенты солюбилизируют мембранные белки, имитируя естественную липидную двухслойную среду мембран, и их можно классифицировать в соответствии с их структурой на четыре основные категории; Ионные, неионные, цвиттерионные детергенты и соли желчных кислот; (Седдон и др., 2004; Рисунок 1B). При использовании моющих средств необходимо учитывать некоторые аспекты. С белками следует обращаться в растворах, содержащих детергент выше критической концентрации мицелл (CMC), чтобы свести к минимуму денатурацию. Следует иметь в виду, что солюбилизация белков не всегда поддерживает их нативную структуру и стабильность; таким образом, детергент, который используется для экстракции из мембран, может быть несовместим с последующими этапами стабилизации и / или биохимической характеристикой солюбилизированного белка.

Недавно был разработан новый класс солюбилизирующих агентов, состоящий из смешанного сополимера с гидрофильной основной цепью и гидрофобными боковыми цепями, известных как амфиполы (Popot et al., 2011). Эти молекулы обвивают гидрофобную часть белка и подвергают свои гидрофильные компоненты водной среде (рис. 1B). Амфиполы имеют значительные преимущества перед традиционными моющими средствами. Например, поскольку они полностью связаны с белком, в растворе почти нет свободного полимера; таким образом сводя к минимуму проблемы, связанные с разделением фаз, возникающим при кристаллизации, повышенной вязкостью в экспериментах по спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или пониженным контрастом в крио-ЭМ изображениях.Амфиполы успешно использовались в структурных исследованиях многих мембранных белков, демонстрируя их эффективность в качестве солюбилизирующих агентов (Flötenmeyer et al., 2007; Althoff et al., 2011; Bai et al., 2015; Mazhab-Jafari et al., 2016; Wilkes. и др., 2017).

Хотя мембранные белки, солюбилизированные с использованием этих агентов, демонстрируют значительную стабильность и растворимость, они все же находятся в среде, очень отличной от естественной липидной мембраны. В целом было показано, что состав мембран имеет решающее значение для правильного функционирования ассоциированных с мембранами белков, модулируя их структуру и стабильность посредством специфических липидно-белковых взаимодействий (Zhou and Cross, 2013; Saliba et al., 2015). Решением для преодоления этих недостатков является реконструкция белка в искусственные липидные мембраны, такие как липосомы (Rigaud and Lévy, 2003; рис. 1B). Липосомы показали хорошие результаты не только в определении структур мембранных белков с помощью крио-ЭМ (Tilley et al., 2005; Wang, Sigworth, 2009; Jensen et al., 2016; Кудряшев и др., 2016), но и полезный инструмент для анализа этих белков с помощью ЯМР (Warschawski et al., 2011; Dürr et al., 2012).

Из-за трудностей, присущих очистке липосом и манипулированию ими, в последние годы наиболее часто используемым инструментом на основе двухслойной липидной среды является нанодиск (Denisov and Sligar, 2016, 2017).Нанодиски состоят из области липидного бислоя мембраны, обернутой амфипатическими спиралевидными мембранными каркасными белками (MSP) (Bayburt et al., 2002), в результате чего получается стабильная частица в форме диска, содержащая целевой белок или белковый комплекс (рис. 1Б). Сильное взаимодействие между MSP и липидами мембран и очень низкая растворимость последних в воде позволяют самосборку нанодисков (Денисов, Слигар, 2017). Хотя эта технология успешно использовалась для определения структуры мембранных белков различными методами, крио-ЭМ может быть той, где преимущества использования нанодисков используются наиболее эффективно (Ефремов и др., 2015; Гацогианнис и др., 2016; Кедров и др., 2016), иногда улучшая разрешение и качество структур, полученных в других исследованиях (Гао и др., 2016; Шен и др., 2016).

Еще одним солюбилизирующим средством, не содержащим детергентов, являются сополимеры стирола и малеиновой кислоты (SMA) (Dörr et al., 2016). Наиболее поразительной особенностью этих амфипатических молекул является их способность растворять липидные бислои непосредственно из клеток в виде нанодисков, окруженных полимером (а не MSP) (Long et al., 2013; Figure 1B).На сегодняшний день этот метод использовался в нескольких биохимических и биофизических отчетах (Orwick et al., 2012; Dörr et al., 2014; Lee et al., 2016), но лишь в нескольких структурных исследованиях мембранных белков (Postis et al. др., 2015; Пармар и др., 2018).

Подготовка крио-ЭМ сети

Криогенная подготовка сетки образцов позволяет фиксировать биологические образцы путем быстрого переноса и охлаждения их в жидком этане (−188 ° C). В этих условиях кристаллы льда не могут образовываться, что сохраняет целостность образца.В идеале образцы крио-ЭМ должны содержаться в тонком слое стекловидного льда с толщиной, максимально приближенной к размерам частиц. Это сводит к минимуму многократное рассеяние и максимизирует контраст образца в микроскопе. На практике примерно 3 мкл образца наносится на решетку крио-ЭМ (рис. 2А), чтобы способствовать ее абсорбции, после чего следует промокание фильтровальной бумагой для удаления избытка жидкости и создания очень тонкого слоя суспензии белка на решетке, которая затем быстро замораживается (погружное замораживание) в жидком этане (рис. 2В).К сожалению, оптимальную толщину льда трудно воспроизвести с одной сетки на другую из-за неровных свойств поверхности промокательной бумаги. Чтобы устранить это ограничение, недавно были разработаны альтернативные методы без блоттинга, которые обеспечивают более надежное и воспроизводимое приготовление сеток. Те же недавно разработанные автоматизированные системы также уменьшили объем образца белка, необходимый для каждой подготовки сетки, с микролитра до нано- или даже фемтолитрового диапазона. Некоторые из новых устройств включают робота «Spotiton», который использует струйный дозатор для нанесения капель 2–16 нл на самоблоттинговые сетки (Jain et al., 2012; Разиньков и др., 2016; Noble et al., 2018), распылительно-погружной системы, которая подает капли непосредственно на электромагнитную сетку (Feng et al., 2017), систему на основе микрокапилляров, которая наносит и распределяет образец по сетке (Arnold et al., 2017), а также систему, которая использует поверхностные акустические волны для доставки капель объемом 30–200 фл от микрожидкостного чипа к электромагнитной сетке (Ashtiani et al., 2018).

Рисунок 2 . Различные конструкции сетки ПЭМ (просвечивающая электронная микроскопия) и полуавтоматический метод стеклования образцов. (A) Примеры сетки ПЭМ с отверстиями из фольги нестандартного размера (Лейси) или с отверстиями определенного диаметра и расстоянием между ними (Quantifoil). (B) Автоматическое устройство глубокой заморозки обычно используется для остекловывания образцов. Образец наносят пипеткой на поверхность крио-ЭМ решетки, и избыток образца удаляют промоканием фильтровальной бумагой с последующим немедленным замораживанием в жидком этане. Образец можно заморозить на решетке с (i) или без (ii) тонкой непрерывной пленки из различных материалов.Во время замораживания образцов можно использовать сетки ПЭМ с различными сетками, фольгой и поддерживающими материалами.

Часто бывает так, что при применении к ЭМ сетке (рис. 2А) белковый комплекс агрегируется и / или распадается. Это может произойти из-за того, что образец подвергается физическим условиям, отличным от условий внутри ячейки или оптимизированного буфера для очистки (рис. 2В). Такие поверхности, как аморфный углерод, металлическая опорная структура, фильтровальная бумага и граница раздела воздух-вода, влияют на поведение частиц и их распределение по сетке (рис. 2В).Примечательно, что если рассматривать сетку диаметром 3 мм и слой льда толщиной 800 Å, отношение площади поверхности к объему в этом слое на 4 порядка больше, чем в исходной капле раствора объемом 3 мкл, содержащей образец, добавляя еще больше сложности к процессу. Предпринимаются усилия, чтобы понять и превзойти это пагубное воздействие на биологические образцы (Glaeser and Han, 2017). Вместе все эти факторы могут привести к сбою подготовки сетки или к общему отсутствию воспроизводимости от сетки к сетке.

Часто концентрация белка на сетке не соответствует концентрации белка в растворе из-за эффектов поверхностной адгезии. Плотность частиц может быть выше ожидаемой, если они имеют тенденцию поглощать больше на поверхности, и ниже, если они отталкиваются от поверхности или поглощаются опорными конструкциями. Принимая во внимание, что для крио-ЭМ требуется в 5–10 раз больше концентрации образца, чем для NS-EM, очень полезная таблица, которая дает оценку количества частиц, ожидаемых в тонком слое стекловидного льда на решетках с отверстиями для данного концентрацию размерных макромолекулярных комплексов можно найти в обзоре Виноткумара и Хендерсона (2016) за 2016 год.

Несколько модификаций и альтернатив были протестированы для преодоления ограничений в стабильности, распределении и (предпочтительной) ориентации частиц во время подготовки крио-ЭМ решетки. В случае динамических комплексов центрифугирование в градиенте глицерина в сочетании с химическим сшиванием (GraFix; Kastner et al., 2008), как было доказано, увеличивает стабильность образца. Добавление детергентов ниже его CMC (Lyumkis et al., 2013; Fernandez-Leiro et al., 2015), использование аффинных сеток или антител (Kelly et al., 2008; Earl et al., 2017), химически окисленные углеродные пленки (Llaguno et al., 2014), ПЭГилирование золотых решеток (Meyerson et al., 2014) и использование «ДНК-клетки», которая окружает и защищает белки (Martin et al. al., 2016a) являются одними из наиболее успешных описанных подходов для улучшения стабильности, распределения и ориентации частиц на крио-ЭМ сетке. В случаях, когда можно получить только небольшие объемы образцов, прямой блоттинг с нативных гелей на ЭМ-сетки также оказался успешным (Knispel et al., 2012). Стоит упомянуть наклон образца как метод преодоления преимущественной ориентации частиц, концепция, которая не нова и недавно была снова исследована с хорошими результатами (Naydenova, Russo, 2017; Tan et al., 2017).

Опоры и фольга

Сетка представляет собой кусок металлической сетки диаметром 3 мм, служащий основной опорой для образца. Сетки указаны в единицах металлических линий на дюйм; таким образом, сетки сетки 200 или 400 содержат 200 или 400 линий на дюйм, соответственно (рис. 2A).Фольга - это тонкий слой, расположенный непосредственно поперек и поверх опоры решетки, в котором есть отверстия или другая сложная геометрия (рис. 2В). Регулярный повторяющийся массив круглых отверстий (сетки Quantifoil или C-Flat) обычно выбирается первым типом сеток, поскольку они облегчают автоматический сбор данных. В качестве альтернативы также можно использовать сетки с нестандартной геометрией, такие как углерод Лейси (рис. 2А).

Опоры сетки и фольга (рис. 2В) могут быть изготовлены из разных материалов.Например, металлы (отдельно или в сплавах) используются для изготовления опор решетки, т. Е. Медь, никель, молибден, кремний, титан, алюминий и золото (Vonck, 2000; Yoshioka et al., 2010; Russo and Passmore, 2014b). ). Медь является наиболее распространенной, потому что она дешевая и является хорошим проводником (важная особенность, позволяющая избежать вредного заряда образца). В случае фольги наиболее распространенным материалом является аморфный углерод (рис. 2В), поскольку он инертен, относительно прозрачен для электронов, электрически (в некоторой степени) и теплопроводен и легко превращается в фольгу.Многие другие материалы (TiSi, SiN, SiO 2 , SiC) также рассматривались и тестировались на протяжении многих лет по разным причинам, но только некоторые из них дали хорошие результаты и только в отдельных случаях (Typke et al., 2004 ; Rhinow, Kühlbrandt, 2008; Yoshioka et al., 2010). Аморфная углеродная фольга имеет свои ограничения при использовании в сочетании с другим материалом основы сетки. Две основные причины побудили исследователей испытать различные материалы как в опорах для сеток, так и в фольге, чтобы преодолеть недостатки использования сеток из двух материалов.Первый возникает из-за дифференциального теплового сжатия. Когда традиционная сетка (медь / углерод или золото / углерод) охлаждается до температуры жидкости N 2 (-196 ° C), металлическая основа сжимается больше, чем углеродная фольга, вызывая образование складок («крио-сморщивание»). ) и последующая потеря напряжения (Glaeser, 1992; Booy and Pawley, 1993). Коэффициент теплового расширения для меди составляет 16,6 × 10 –6 К, а для углерода - 0,5–8,8 × 10 –6 К (Glaeser, 1992; Booy and Pawley, 1993).Криоизгибание способствует перемещению на 200–400 Å перпендикулярно плоскости опоры (Russo and Passmore, 2014b), а также боковым движениям в горизонтальной плоскости (Brilot et al., 2012) во время облучения электронами. Приближая коэффициент теплового расширения опоры сетки к фольге (например, используя титан, молибден или вольфрам вместо меди или золота), можно минимизировать этот эффект (Booy and Pawley, 1993; Fujiyoshi, 1998; Vonck, 2000). Вторая проблема возникает из-за электрических свойств углерода, так как его проводимость довольно низкая и он ведет себя как полупроводник (Larson et al., 2011). Как и в случае с другими полупроводниками, проводимость уменьшается (или увеличивается удельное сопротивление) при понижении температуры. Это способствует накоплению зарядов на фольге и последующему движению, вызванному излучением, которое вызывает потерю разрешения на электронных микрофотографиях (Russo and Passmore, 2016a; Russo and Henderson, 2018). В последние несколько лет золото стало отличной альтернативой для решения этих проблем (Руссо и Пассмор, 2014b, 2016b). Во-первых, поскольку вся сетчатая структура (как опора, так и фольга) изготовлена ​​из одного и того же материала, она равномерно усаживается, и плоскостность / жесткость фольги сохраняется после криопогружения.Во-вторых, удельное сопротивление тонких пленок золота на несколько порядков ниже, чем у тонких пленок углерода, и оно становится более проводящим при понижении температуры (нормальное поведение для металлов), что помогает уменьшить накопление зарядов на подложках (Russo and Passmore, 2016b). . Улучшенная стабильность опоры уменьшает движение частиц во время сбора изображений более чем на порядок, что приводит к повышению качества изображения.

Обработка фольгой

Опорные поверхности часто бывают гидрофобными, что препятствует эффективному растеканию водного раствора по сеткам.Чтобы уменьшить гидрофобность, они обрабатываются плазмой низкой энергии, которая создается за счет ионизации газа под низким давлением, также известного как «тлеющий разряд». Воздух - наиболее используемая газовая смесь, но есть также плазменные камеры, в которых используются определенные смеси газов, включая кислород, водород и аргон, или атмосферу, обогащенную амиламином. Воздух обеспечивает сетку отрицательным зарядом, в то время как амиламин дает положительный заряд, и то и другое полезно в зависимости от случая. Ионы также взаимодействуют с поверхностью, удаляя определенные загрязнения.Распространенной проблемой при приготовлении проб белка крио-ЭМ является неполное смачивание поверхности сетки, которую можно решить, регулируя плазму и условия для достижения более равномерного распределения раствора по сетке (рис. 2В). К другим видам обработки фольги, испытанным в прошлом, относятся УФ (Burgess et al., 2004) и электронное (Miyazawa et al., 1999) излучение.

Создание условий, способствующих разделению белковых частиц между отверстиями фольги, иногда является серьезной проблемой.Одна из возможных стратегий - добавить еще одну поверхность (сплошную пленку) поверх фольги, чтобы обеспечить дополнительную физическую поддержку частицам для адсорбции. На практике дополнительные пленки также могут помочь преодолеть ограничения, такие как низкая концентрация белка, распределение частиц в отверстиях решетки, предпочтительная ориентация и проблемы на границе раздела воздух-вода (рис. 2В). Как показано в литературе, наиболее распространенным типом пленки является очень тонкий слой аморфного углерода (10–100 Å), который относительно просто изготовить и использовать в лаборатории (Bernal and Stock, 2004; Passmore and Russo, 2016 ).

К сожалению, пленки из аморфного углерода вносят существенный вклад в фоновый сигнал, что менее важно при изучении больших белковых комплексов, но становится значимым для комплексов с массой 150 кДа (или меньше). В этих случаях альтернативой является использование пленки другого типа. Графен (Pantelic et al., 2011), например, является превосходным материалом-носителем, потому что он представляет собой гексагональную решетку атомов углерода толщиной 1 атом (0,34 нм) с чрезвычайно хорошими свойствами проводимости (Heersche et al., 2007; Chen et al., 2008) и механической прочности (Lee et al., 2008; Wang et al., 2009; Рисунок 2B). Он также практически невидим при разрешении, достигнутом в электронной микроскопии (Meyer et al., 2007). Следовательно, хотя графеновые носители трудно изготавливать и переносить (Li et al., 2009; Regan et al., 2010; Pantelic et al., 2011), они обладают более идеальными свойствами, которые потенциально могут уменьшить эффекты зарядки и улучшить изображение. качество. Графен по своей природе гидрофобен, и его необходимо сделать гидрофильным, чтобы поверхность могла смачиваться.Недавно был разработан ряд методов для преодоления этого ограничения. Частичное гидрирование поверхности графена было использовано для контроля адсорбции белка на поверхности (Russo and Passmore, 2014a). Кроме того, оксид графена (Pantelic et al., 2010) приобрел популярность (Bokori-Brown et al., 2016; Boland et al., 2017), поскольку его легче производить и наносить на сетки (Martin et al., 2016b ), а также потому, что он гидрофильный по своей природе, что позволяет избежать стадии плазменной обработки (рис. 2В).Тем не менее, воспроизводимость и покрытие с использованием оксида графена затруднены, и это может способствовать фоновому шуму.

Выводы

Практические аспекты, проблемы и примеры, описанные выше, наряду с многочисленными другими исследованиями, показывают, насколько сложной и сложной может быть подготовка образцов белка. Определение структур с высоким разрешением с помощью крио-ЭМ - это быстро развивающаяся область, в частности, с последними разработками в области обнаружения и регистрации, удобными микроскопами и улучшенным программным обеспечением для предварительного формования.В этом контексте подготовка образцов белка по-прежнему остается методом проб и ошибок, в котором необходимо изучить различные подходы, чтобы максимизировать шансы на успех.

Конечная цель - перейти от процессов проб и ошибок к более контролируемым и воспроизводимым протоколам подготовки проб белка. Улучшенные опоры сетки уменьшат перемещение образца во время сбора данных, уменьшат накопление заряда и помогут контролировать ориентацию и распределение частиц в слое льда.

Мы ожидаем таких достижений в будущем, как разработка и производство других автоматических устройств для стеклования на основе различных технологий, разработка протоколов быстрого определения толщины льда, минимизация радиационно-индуцированного движения и зарядки, а также использование более настраиваемых взаимодействующих поверхностей. Кроме того, в ближайшем будущем мы станем свидетелями увеличения инвестиций в разработку новых методов солюбилизации для подготовки образцов мембранных белков, улучшенных детекторов электронного микроскопа, записывающего оборудования и программного обеспечения для обработки данных.Эти новые разработки позволят нам достичь теоретического предела разрешающей способности этого мощного метода раньше, чем ожидалось.

Авторские взносы

GS написал рукопись и подготовил рисунки. ТК редактировал рукопись и рисунки, а также руководил работой. Оба автора одобрили окончательный вариант рукописи.

Финансирование

Эта работа была поддержана институциональным финансированием от Imperial College London до TC.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Благодарим Чака Фара и Наташу Лукоянову за критическое прочтение рукописи.

Список литературы

Альбертс Б., Джонсон А., Льюис Дж., Морган Д., Рафф М., Робертс К. и др. (2014). Молекулярная биология клетки . Нью-Йорк, штат Нью-Йорк; Абингдон: Наука о гирляндах.

Альтхофф Т., Миллс Д. Дж., Попот Дж. Л. и Кюльбрандт В. (2011). Расположение компонентов цепи переноса электронов в митохондриальном суперкомплексе крупного рогатого скота I1III2IV1. EMBO J. 30, 4652–4664. DOI: 10.1038 / emboj.2011.324

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Арнольд, С.А., Альбиз, С., Биери, А., Синтичаки, А., Адаиксо, Р., МакЛеод, Р.А., и др. (2017). Подготовка сетки для криоэлектронной микроскопии без блоттинга и без потерь из образцов белка нанолитрового размера и экстрактов отдельных клеток. J. Struct. Биол. 197, 220–226. DOI: 10.1016 / j.jsb.2016.11.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Аштиани, Д., Венугопал, Х., Белоусофф, М., Спайсер, Б., Мак, Дж., Нилд, А. и др. (2018). Доставка капель фемтолитра с использованием распыления на основе поверхностных акустических волн для подготовки крио-ЭМ сетки. J. Struct. Биол. 203, 94–101. DOI: 10.1016 / j.jsb.2018.03.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бай, Х.С., Янь, К., Ян, Г., Лу, П., Ма, Д., Сан, Л. и др. (2015). Атомная структура гамма-секретазы человека. Природа 525, 212–217. DOI: 10.1038 / природа14892

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баммес Б. Э., Рочат Р. Х., Джакана Дж., Чен Д. Х. и Чиу В. (2012). Прямое обнаружение электронов позволяет производить крио-ЭМ-реконструкции с разрешением выше 3/4 частоты Найквиста. J. Struct. Биол. 177, 589–601. DOI: 10.1016 / j.jsb.2012.01.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Байбурт Т. Х., Гринькова Ю. В., Слигар С. Г. (2002). Самосборка дискоидных фосфолипидных бислойных наночастиц с белками мембранного каркаса. Nano Lett. 2, 853–856. DOI: 10.1021 / nl025623k

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бернал Р. А. и Сток Д. (2004). Трехмерная структура интактной Н + -АТФазы / синтазы Thermus thermophilus с помощью электронной микроскопии. Структура 12, 1789–1798. DOI: 10.1016 / j.str.2004.07.017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бокори-Браун, М., Мартин, Т. Г., Нейлор, К. Э., Басак, А. К., Титболл, Р.В., Савва К. Г. (2016). Крио-ЭМ структура поры лизенина объясняет встраивание в мембрану белков семейства аэролизинов. Nat. Commun. 7: 11293. DOI: 10.1038 / ncomms11293

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Боланд А., Мартин Т. Г., Чжан З., Янг Дж., Бай X. С., Чанг Л. и др. (2017). Крио-ЭМ-структура комплекса сепаразы-секурин многоклеточных животных с разрешением, близким к атомному. Nat. Struct. Мол. Биол. 24, 414–418. DOI: 10.1038 / нсмб.3386

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Booy, F. P., и Pawley, J. B. (1993). Крио-сморщивание - то, что происходит с углеродными пленками на медных сетках при низких температурах. Ультрамикроскопия 48, 273–280. DOI: 10.1016 / 0304-3991 (93) -3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Брилот, А. Ф., Чен, Дж. З., Ченг, А., Пан, Дж., Харрисон, С. К., Поттер, С. С. и др. (2012). Движение остеклованного образца на дырчатой ​​углеродной пленке под действием луча. J. Struct. Биол. 177, 630–637. DOI: 10.1016 / j.jsb.2012.02.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Берджесс, С. А., Уокер, М. Л., Тирумуруган, К., Триник, Дж., И Найт, П. Дж. (2004). Использование негативного окрашивания и обработки изображений с одной частицей для исследования динамических свойств гибких макромолекул. J. Struct. Биол. 147, 247–258. DOI: 10.1016 / j.jsb.2004.04.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чен, Дж.Х., Янг, К., Адам, С., Фюрер, М. С., Уильямс, Э. Д. и Ишигами, М. (2008). Рассеяние на заряженных примесях в графене. Nat. Phys. 4, 377–381. DOI: 10.1038 / nphys935

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дёрр, Дж. М., Кооренгевель, М. К., Шефер, М., Прокофьев, А. В., Шейделаар, С., ван дер Крейсен, Э. А. В. и др. (2014). Изоляция, характеризация и функциональное восстановление тетрамерного K + канала без использования моющих средств: сила нативных нанодисков. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 111, 18607–18612. DOI: 10.1073 / pnas.1416205112

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Dörr, J.M., Scheidelaar, S., Koorengevel, M.C., Dominguez, J.J., Schäfer, M., van Walree, C.A., et al. (2016). Сополимер стирола и малеиновой кислоты: универсальный инструмент для исследования мембран. Eur. Биофиз. J. 45, 3–21. DOI: 10.1007 / s00249-015-1093-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ефремов Р.Г., Лейтнер А., Эберсольд Р. и Раунсер С. (2015). Архитектура и механизм конформационного переключения рианодинового рецептора. Nature 517, 39–43. DOI: 10.1038 / природа13916

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фэн, Х., Фу, З., Каледхонкар, С., Цзя, Ю., Шах, Б., Джин, А., и др. (2017). Быстрый и эффективный микрожидкостный метод распыления-погружения для крио-ЭМ одиночных частиц с высоким разрешением. Структура 25, 663.e3–670.e3. DOI: 10.1016 / j.str.2017.02.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фернандес-Лейро, Р., Конрад, Дж., Шерес, С. Х. У. и Ламерс, М. Х. (2015). Крио-ЭМ-структуры репликативной ДНК-полимеразы E. Coli демонстрируют ее динамические взаимодействия со скользящим зажимом ДНК, экзонуклеазой и τ. Элиф 4: e11134. DOI: 10.7554 / eLife.11134

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Флётенмейер, М., Вайс, Х., Трибет, К., Попот, Дж. Л., и Леонард, К. (2007). Использование амфипатических полимеров для криоэлектронной микроскопии НАДН: убихинон оксидоредуктаза (комплекс I). J. Microsc. 227, 229–235. DOI: 10.1111 / j.1365-2818.2007.01805.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Gatsogiannis, C., Merino, F., Prumbaum, D., Roderer, D., Leidreiter, F., Meusch, D., et al. (2016). Внедрение токсина Tc в мембрану с почти атомарными деталями. Nat. Struct. Мол.Биол. 23, 884–890. DOI: 10.1038 / nsmb.3281

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Глэзер Р. М., Макмаллан Г., Фаруки А. Р. и Хендерсон Р. (2011). Изображения монослойных кристаллов парафина с идеальным контрастом: минимизация движения образца под действием пучка. Ультрамикроскопия 111, 90–100. DOI: 10.1016 / j.ultramic.2010.10.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Heersche, H. B., Jarillo-Herrero, P., Оостинга, Дж. Б., Вандерсипен, Л. М. К., и Морпурго, А. Ф. (2007). Биполярный сверхток в графене. Nature 446, 56–59. DOI: 10.1038 / nature05555

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джайн, Т., Шихан, П., Крам, Дж., Каррагер, Б., и Поттер, К. С. (2012). Spotiton: прототип интегрированной струйной системы дозирования и стеклования для крио-ТЕМ. J. Struct. Биол. 179, 68–75. DOI: 10.1016 / j.jsb.2012.04.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дженсен, К.Х., Брандт, С. С., Шигемацу, Х., Сигворт, Ф. Дж. (2016). Статистическое моделирование и удаление выступов липидной мембраны для определения крио-ЭМ структуры восстановленных мембранных белков. J. Struct. Биол. 194, 49–60. DOI: 10.1016 / j.jsb.2016.01.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кастнер Б., Фишер Н., Голас М. М., Сандер Б., Дубе П., Берингер Д. и др. (2008). GraFix: пробоподготовка для одночастичной электронной криомикроскопии. Nat. Методы 5, 53–55. DOI: 10.1038 / nmeth2139

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кедров А., Виклс С., Кревенна А. Х., ван дер Слуис Э. О., Бушауэр Р., Бернингхаузен О. и др. (2016). Структурная динамика комплекса YidC: рибосома в процессе биогенеза мембранных белков. Cell Rep. 17, 2943–2954. DOI: 10.1016 / j.celrep.2016.11.059

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Келли, Д.Ф., Дуковски Д. и Вальц Т. (2008). Очистка монослоя: быстрый метод выделения белковых комплексов для одночастичной электронной микроскопии. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 105, 4703–4708. DOI: 10.1073 / pnas.0800867105

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Книспель, Р. В., Кофлер, К., Бойку, М., Баумейстер, В., и Никелл, С. (2012). Блоттинг белковых комплексов от нативных гелей до сеток электронной микроскопии. Nat. Методы 9, 182–184.DOI: 10.1038 / Nmeth.1840

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Крог, А., Ларссон, Б., Фон Хейне, Г., и Зоннхаммер, Э. Л. Л. (2001). Прогнозирование топологии трансмембранного белка с помощью скрытой марковской модели: приложение для полных геномов. J. Mol. Биол. 305, 567–580. DOI: 10.1006 / jmbi.2000.4315

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кудряшев, М., Кастаньо-Диес, Д., Делуз, К., Хассейн, Г., Грассо, Л., Graf-Meyer, A., et al. (2016). Структура серотонинового 5-HT3 рецептора мыши в липидных пузырьках. Структура 24, 165–170. DOI: 10.1016 / j.str.2015.11.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ларсон, Д. М., Даунинг, К. Х., Глезер, Р. М. (2011). Поверхность напыленных углеродных пленок представляет собой изолирующий материал с большой шириной запрещенной зоны. J. Struct. Биол. 174, 420–423. DOI: 10.1016 / j.jsb.2011.02.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, К., Вэй, X., Кисар, Дж. У., и Хоун, Дж. (2008). Измерение упругих свойств и внутренней прочности однослойного графена. Наука 321, 385–388. DOI: 10.1126 / science.1157996

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, С. К., Ноулз, Т. Дж., Постис, В. Л. Г., Джамшад, М., Парслоу, Р. А., Лин, Ю. П. и др. (2016). Метод выделения мембранных белков в их локальном липидном окружении без использования детергентов. Nat. Protoc. 11, 1149–1162.DOI: 10.1038 / nprot.2016.070

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Li, X., Cai, W., An, J., Kim, S., Nah, J., Yang, D., et al. (2009). Синтез качественных и однородных пленок графена на медных фольгах на большой площади. Наука 324, 1312–1314. DOI: 10.1126 / science.1171245

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, X., Муни, П., Чжэн, С., Бут, К. Р., Браунфельд, М. Б., Губбенс, С., и др. (2013).Подсчет электронов и коррекция движения, индуцированного пучком, позволяют получать криоЭМ одиночных частиц с разрешением, близким к атомному. Nat. Методы 10, 584–590. DOI: 10.1038 / nmeth.2472

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Llaguno, M.C., Xu, H., Shi, L., Huang, N., Zhang, H., Liu, Q., et al. (2014). Химически функционализированные углеродные пленки для визуализации одиночных молекул. J. Struct. Биол. 185, 405–417. DOI: 10.1016 / j.jsb.2014.01.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лонг, А.Р., О'Брайен, К. К., Малхотра, К., Швалл, К. Т., Альберт, А. Д., Уоттс, А. и др. (2013). Стратегия без детергентов для восстановления активных ферментных комплексов из природных биологических мембран в наноразмерные диски. BMC Biotechnol. 13:41. DOI: 10.1186 / 1472-6750-13-41

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Люмкис, Д., Жюльен, Дж. П., Де Вал, Н., Купо, А., Поттер, К. С., Класс, П. Дж. И др. (2013). Крио-ЭМ структура полностью гликозилированного растворимого расщепленного тримера оболочки ВИЧ-1. Наука 342, 1484–1490. DOI: 10.1126 / science.1245627

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мартин Т. Г., Бхарат Т. А. М., Йоргер А. К., Бай X., Преториус Ф., Фершт А. Р. и др. (2016a). Дизайн молекулярного носителя для определения крио-ЭМ структуры. Proc. Natl. Акад. Sci. США 113, E7456 – E7463. DOI: 10.1073 / pnas.1612720113

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мартин Т.Г., Боланд, А. В. П., Фицпатрик, А., Шерес, С. Х. У. (2016b). Изготовление сетки из оксида графена. DOI: 10.6084 / m9.figshare.3178669.v1.

CrossRef Полный текст

Mazhab-Jafari, M. T., Rohou, A., Schmidt, C., Bueler, S. A., Benlekbir, S., Robinson, C. V., et al. (2016). Атомная модель встроенного в мембрану VO двигателя эукариотической V-АТФазы. Природа 539, 118–122. DOI: 10.1038 / природа19828

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мейер, Дж.К., Гейм, А. К., Кацнельсон, М. И., Новоселов, К. С., Бут, Т. Дж., И Рот, С. (2007). Структура подвешенных листов графена. Nature 446, 60–63. DOI: 10.1038 / nature05545

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мейерсон, Дж. Р., Рао, П., Кумар, Дж., Читтори, С., Банерджи, С., Пирсон, Дж. И др. (2014). Самособирающиеся монослои улучшают распределение белка на криоЭМ носителях с дырчатым углеродом. Sci. Отчет 4: 7084. DOI: 10.1038 / srep07084

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Милаццо, А.C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., et al. (2011). Первоначальная оценка детектора устройства прямого обнаружения для криоэлектронной микроскопии одиночных частиц. J. Struct. Биол. 176, 404–408. DOI: 10.1016 / j.jsb.2011.09.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Миядзава А., Фудзиёси Ю., Стоуэлл М. и Анвин Н. (1999). Никотиновый ацетилхолиновый рецептор с разрешением 4,6 Å: поперечные туннели в стенке канала. J. Mol. Биол. 288, 765–786. DOI: 10.1006 / jmbi.1999.2721

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Найденова, К., Руссо, К. Дж. (2017). Измерение эффектов ориентации частиц для повышения эффективности электронной криомикроскопии. Nat. Commun. 8: 629. DOI: 10.1038 / s41467-017-00782-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нобл, А. Дж., Вэй, Х., Дандей, В. П., Чжан, З., Поттер, К.С., Электрон С. и др. (2018). Снижение эффектов адсорбции частиц на границе раздела воздух-вода в криоЭМ. bioRxiv 288340 . DOI: 10.1101 / 288340

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Орвик, М. К., судья, П. Дж., Прочек, Дж., Линдхольм, Л., Грациадей, А., Энгель, А., и др. (2012). Образование и физико-химические характеристики наноразмерных липид-полимерных комплексов без применения моющих средств: липодиск. Angew. Chem. Int. Эд. Англ. 51, 4653–4657. DOI: 10.1002 / anie.201201355

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пантелич, Р. С., Мейер, Дж. К., Кайзер, Ю., Баумейстер, В., и Плитцко, Дж. М. (2010). Оксид графена: субстрат для оптимизации приготовления замороженных гидратированных образцов. J. Struct. Биол. 170, 152–156. DOI: 10.1016 / j.jsb.2009.12.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Pantelic, R. S., Suk, J. W., Magnuson, C. W., Meyer, J. C., Wachsmuth, P., Kaiser, U., и другие. (2011). Графен: подготовка и введение подложки. J. Struct. Биол. 174, 234–238. DOI: 10.1016 / j.jsb.2010.10.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пармар М., Роусон С., Скарфф К. А., Голдман А., Даффорн Т. Р., Мюнч С. П. и др. (2018). Использование платформы SMALP для определения структуры белка крио-ЭМ мембраны одной частицы размером менее 1 нм. Biochim. Биофиз. Acta 1860, 378–383. DOI: 10.1016 / j.bbamem.2017.10.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Паульсен, К. Э., Армаш, Дж. П., Гао, Ю., Ченг, Ю., и Джулиус, Д. (2015). Структура ионного канала TRPA1 предполагает механизмы регуляции. Природа 520, 511–517. DOI: 10.1038 / природа14367

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Попот, Ж.-Л., Альтхофф, Т., Багнар, Д., Банер, Ж.-Л., Баззакко, П., Биллон-Дени, Э. и др. (2011). Амфиполы от А до Я *. Annu. Rev. Biophys. 40, 379–408. DOI: 10.1146 / annurev-biophys-042910-155219

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Постис, В., Роусон, С., Митчелл, Дж. К., Ли, С. К., Парслоу, Р. А., Даффорн, Т. Р. и др. (2015). Использование SMALP в качестве нового каркаса мембранного белка для исследования структуры с помощью электронной микроскопии с отрицательным окрашиванием. Biochim. Биофиз. Acta - Biomembr. 1848, 496–501. DOI: 10.1016 / j.bbamem.2014.10.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Разиньков, И., Дандей, В. П., Вэй, Х., Чжан, З., Мельнеков, Д., Райс, В. Дж. И др. (2016). Новый метод остекловывания образцов для криоЭМ. J. Struct. Биол. 195, 190–198. DOI: 10.1016 / j.jsb.2016.06.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Риган В., Алем Н., Алеман Б., Генг Б., Гирит О., Мазерати Л. и др. (2010). Прямой перенос слоистого графена. Заявл. Phys. Lett. 96: 113102. DOI: 10.1063 / 1.3337091

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ринов, Д., и Кюльбрандт, W. (2008). Электронная криомикроскопия биологических образцов на проводящих пленках металлического стекла титан-кремний. Ультрамикроскопия 108, 698–705. DOI: 10.1016 / j.ultramic.2007.11.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Руссо, К. Дж., И Пассмор, Л. А. (2014a). Контроль адсорбции белка на графене для крио-ЭМ с использованием низкоэнергетической водородной плазмы. Nat. Методы 11, 649–652. DOI: 10.1038 / Nmeth.2931

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Руссо, К.Дж., И Пассмор, Л. А. (2016a). Прогресс в направлении оптимальной поддержки образцов для электронной криомикроскопии. Curr. Opin. Struct. Биол. 37, 81–89. DOI: 10.1016 / j.sbi.2015.12.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Руссо, К. Дж., И Пассмор, Л. А. (2016b). Ультрастабильные золотые подложки: свойства носителя для электронной криомикроскопии высокого разрешения биологических образцов. J. Struct. Биол. 193, 33–44. DOI: 10.1016 / j.jsb.2015.11.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Салиба, А. Е., Вонкова, И., Гэвин, А. С. (2015). Систематический анализ белок-липидных взаимодействий достигает своей зрелости. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16, 753–761. DOI: 10.1038 / nrm4080

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Седдон, А. М., Курноу, П., и Бут, П. Дж. (2004). Мембранные белки, липиды и детергенты: не только мыльная опера. Biochim.Биофиз. Acta - Biomembr. 1666, 105–117. DOI: 10.1016 / j.bbamem.2004.04.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шен П.С., Ян X., ДеКаэн П.Г., Лю X., Балкли Д., Клэпхэм Д.Э. и др. (2016). Структура канала поликистоза почек PKD2 на липидных нанодисках. Cell 167, 763.e11–773.e11. DOI: 10.1016 / j.cell.2016.09.048

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тан, Ю.З., Болдуин, П. Р., Дэвис, Дж. Х., Уильямсон, Дж. Р., Поттер, К. С., Каррагер, Б. и др. (2017). Решение проблемы предпочтительной ориентации образца при однокомпонентной крио-ЭМ через наклон. Nat. Методы 14, 793–796. DOI: 10.1038 / nmeth.4347

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тилли, С. Дж., Орлова, Э. В., Гилберт, Р. Дж. К., Эндрю, П. У. и Сайбил, Х. Р. (2005). Структурные основы порообразования бактериальным токсином пневмолизином. Cell 121, 247–256.DOI: 10.1016 / j.cell.2005.02.033

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Типке Д., Даунинг К. Х. и Глезер Р. М. (2004). Электронная микроскопия биологических макромолекул: преодоление разрыва между тем, что позволяет физика, и тем, что мы можем получить в настоящее время. Microsc. Микроанал . 10, 21–27. DOI: 10.1017 / S14314040164

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Виноткумар, К. Р., Хендерсон, Р. (2016).Электронная криомикроскопия одиночных частиц: тенденции, проблемы и перспективы на будущее. Q. Rev. Biophys. 49: e13. DOI: 10.1017 / S0033583516000068

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Валлин Э. и Хейне Г. В. (1998). Полногеномный анализ интегральных мембранных белков эубактериальных, архейских и эукариотических организмов. Protein Sci. 7, 1029–1038. DOI: 10.1002 / pro.5560070420

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, Г., Шен, X., Ван, Б., Яо, Дж., И Парк, Дж. (2009). Синтез и характеристика гидрофильных и органофильных нанолистов графена. Углерод Н. Ю. 47, 1359–1364. DOI: 10.1016 / j.carbon.2009.01.027

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Варшавски Д. Э., Арнольд А. А., Богранд М., Гравель А., Шартран Э. и Маркотт И. (2011). Выбор мембранных миметиков для ЯМР структурных исследований трансмембранных белков. Biochim. Биофиз. Acta - Biomembr. 1808, 1957–1974. DOI: 10.1016 / j.bbamem.2011.03.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wilkes, M., Madej, M. G., Kreuter, L., Rhinow, D., Heinz, V., De Sanctis, S., et al. (2017). Молекулярное понимание липидной регуляции Ca 2+ TRP-канала Полицистин-2. Nat. Struct. Мол. Биол. 24, 123–130. DOI: 10.1038 / nsmb.3357

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжэн, С.К., Паловчак, Э., Армаш, Дж. П., Верба, К. А., Ченг, Ю., и Агард, Д. А. (2017). MotionCor2: анизотропная коррекция движения, вызванного лучом, для улучшенной криоэлектронной микроскопии. Nat. Методы 14, 331–332. DOI: 10.1038 / nmeth.4193

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжоу, Х. X., Кросс, Т. А. (2013). Влияние мембранных миметических сред на белковые структуры мембран. Annu. Rev. Biophys. 42, 361–392. DOI: 10.1146 / annurev-biophys-083012-130326

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Система тлеющего разряда для решеток TEM

Уникальная двухкамерная обработка, безопасное обращение с реагентами

GloQube имеет две независимые вакуумные камеры: чистая камера, предназначенная для применений, требующих гидрофобного / гидрофильного преобразования, обычно с использованием воздуха в качестве технологического газа; и паровая камера, предназначенная для использования с такими реагентами, как метанол и алкиламин.Для обеспечения безопасности оператора используются многоразовые флаконы с реагентами, закрытые перегородкой. Загрузка и извлечение реагентов удобна и надежна - флакон, находящийся в держателе, вставляется в экранированную иглу с помощью простого байонетного соединения.

Во избежание случайного повреждения высоковольтный провод экранирован. Ток плазмы регулируется путем регулировки уровня вакуума с помощью клапана утечки аргона с предварительно установленным напряжением плазмы. Для максимальной эффективности нанесения покрытия распылением система газового инжектора обеспечивает поступление газообразного аргона в камеру рядом с плазменным разрядом.Вентиляция - аргон.

Основные характеристики
  • Двойные независимые камеры
  • Гидрофильный / гидрофобный и отрицательный / положительный режимы
  • Полностью автоматический, короткое время процесса
  • Интуитивно понятное управление с помощью сенсорного экрана
  • Безопасная подача пара с использованием пробирок с перегородкой
  • Автоматическое переключение между камерами для предотвращения перекрестного загрязнения
  • Быстрая и простая загрузка образца
  • Контролируемая вентиляция для предотвращения нарушения образца
  • Стабильные и надежные результаты
  • Трехлетняя гарантия

Основное применение EMS GloQube ™ - гидрофилизация (смачивание) поддерживающие пленки и сетки для ПЭМ с углеродным покрытием, которые в противном случае имеют тенденцию быть гидрофобными.Обработка тлеющим разрядом воздухом сделает поверхности пленки отрицательно заряженными и гидрофильными и позволит легко растекаться водным растворам. Этот и другие процессы описаны ниже.

Метанол Метанол 905 заряженные белковые молекулы
(e.г. ферритин, цитохром c)
Процесс тлеющего разряда
Состояние поверхности Заряд Атмосфера Типичные области применения
Гидрофильный Отрицательный с T-образным покрытием Воздух Углерод Воздух Воздух - с последующей обработкой ацетатом магния Адгезия нуклеиновой кислоты к углеродным пленкам
Гидрофильный Положительный Алкиламин Белки, антитела и нуклеиновые кислоты
Положительный
Простая загрузка образцов, быстрое время обработки

В каждую камеру можно поместить два предметных стекла 25 x 75 мм. Загрузка может быть проще, чем при использовании дверок вытяжной камеры и предметных столиков. Ступени регулируются по высоте и оснащены съемными держателями для стекол. Для дополнительного удобства и обеспечения легкого доступа для очистки камеры ступени могут быть полностью удалены.

Управление с сенсорного экрана - быстрый ввод данных, простое управление

Интуитивно понятный сенсорный экран позволяет нескольким пользователям быстро вводить и сохранять предпочтительные «рецепты» процесса.Стандартные стандартные протоколы тлеющего разряда загружаются по умолчанию. Кроме того, оператору доступны файлы справки и полезные данные о техническом обслуживании, такие как своевременность системы и время с момента последней очистки. Порт связи Ethernet включен для обновлений программного обеспечения.

Вакуум, автоматическая арматура и контролируемая вентиляция

GloQube ™ имеет автоматическую арматуру между камерами, которая поддерживает чистоту за счет предотвращения перекрестного загрязнения. В конце технологического цикла автоматический мягкий сброс в атмосферу через входные отверстия с фильтрами гарантирует, что сетки ТЕА не будут нарушены.Для GloQube ™ требуется один вакуумный насос, работающий в диапазоне от 0,1 до 1 мбар. Типичное время откачки до рабочего вакуума составляет 60 секунд.

4
Электропитание и процессы
Плазменный ток 1-40 мА
Высоковольтный источник питания 30 Вт
Максимальное напряжение 800 В чистая камера Постоянный ток положительный Светящийся постоянный ток отрицательный
Полярность электродов - испарительная камера Постоянный ток положительный Светящийся постоянный ток отрицательный
Стенд для образца 125 x 100 мм (4.9 "x 3,94") с местом для двух стеклянных слайдов 25 x 75 мм (1 "x 3")
Рабочая высота предметного столика Регулируемая 12,5 мм (0,5 дюйма), 22,5 мм (0,9 дюйма) или 35 мм (1,38 дюйма)
Требуемое время удержания насоса 0-24 часа
Время процесса 1-600 секунд
Безопасность
Воздухозаборники камеры медленная вентиляция для минимизации искажения образца
Встроенное хранилище реагентов Реагенты (например,г. метанол или алкиламин) содержатся в многоразовых запечатанных стеклянных флаконах, чтобы свести к минимуму воздействие опасностей. (Только GloQube-D)
Высоковольтные защитные блокировки Аппаратная защитная блокировка и программное обеспечение для управления процессом
Вакуум
Контроль вакуума Встроенный датчик вакуума
от 0,1 до 1 мбар
Минимальные требования к вакуумному насосу 6 м 3 / час, 3600 л / м, 0.03 мбар предельный вакуум. Входной фланец: KF 16
Время откачки Типичное время откачки до рабочего вакуума 0,27 мбар за 60 секунд
Вакуумная изоляция Запорные клапаны для переключения вакуума и предотвращения перекрестного загрязнения технологической камеры
Пользовательский интерфейс
Пользовательский интерфейс Полный графический интерфейс с кнопками и элементами управления на сенсорном экране. В дополнение к отображению профилей доступны параметры, экран справки и информация об обслуживании. и коммуникации
Размер камеры Ш x 100 мм В x 127 мм Г (3.94 x 3,94 x 5 дюймов)
Размер прибора 336 мм В x 364 мм Г (13,2 x 14,3 дюйма)
Вес прибора 19,5 кг (42,9 фунта) (GloQube-D)
Насос (дополнительно) 391 мм Ш x 127 мм Г x 177 мм В (15,4 дюйма x 5 дюймов x 7 дюймов)
Вес насоса 16 кг (35,3 фунта)
Площадь основания с дополнительным насосом 366 мм Ш x 600 мм Г x 336 мм В (14,4 "x 23,6" x 13,2 ")
Требования к питанию 120 В 60 Гц, 15 A или 230 В 50 Гц, 10 A
Номинальная мощность прибора 100-240 В переменного тока 60/50 Гц 700 ВА, включая насос, вход IEC
Допустимая мощность насоса 115/230 В 60/50 Гц 450 Вт
Коммуникационный порт Порт Ethernet для обновления программного обеспечения прибора

Компания «Электронная микроскопия» представляет уникальный препарат ионные лотки, которые можно использовать для окрашивания и / или размещения испарителя для покрытия сеток.

В центре лотков имеется резьбовое отверстие M4, позволяющее установить штифтовое крепление. У них также есть винтовой штифт посередине, который можно использовать в качестве ручки для манипулирования лотками.

Они изготовлены из медицинского алюминия и поставляются в пластиковом ящике для хранения.

Доступен в двух размерах:

  1. 36 Объем: размеры 1,688 дюйма (Д) x 1,688 дюйма (Ш) x 0,250 дюйма (43 мм x 43 мм x 6 мм)
  2. Объем 81: размеры 2,563 дюйма (Д) x 2,563 дюйма (Ш) x 0,250 дюйма (65 мм x 65 мм x 6 мм)

Электронная микроскопия: сетки и подготовка образцов

Электронная микроскопия: сетки и подготовка образцов


Графика любезно предоставлена ​​IDG Books

Рисунок 1. Сверху: Вид сетки сверху, показывающий сетку. Внизу: Вид сбоку сетки с углеродным покрытием, показывающий относительное положение углеродной пленки относительно сетки и образца.

Большинство биологических работ EM выполняется на небольших (несколько миллиметров) медных дисках, называемых сетками , отлитых с мелкой сеткой. Эта сетка может сильно различаться в зависимости от предполагаемого применения, но обычно составляет около 15 квадратов на миллиметр (400 квадратов на дюйм). Поверх этой сетки наносится тонкий слой углерода путем испарения на него углеродного графита.Именно на этой тонкой углеродной пленке будет лежать образец, чтобы его можно было исследовать под микроскопом (рис. 1). Углерод, как правило, является гидрофобным веществом (то есть он отталкивает воду), и если на него поместить каплю воды, вода будет стремиться минимизировать его контакт с углеродом. Чтобы сделать поверхность более доступной для воды и взвешенного образца, углерод необходимо сделать гидрофильным. Это достигается тлеющим разрядом. При тлеющем разряде решетки с углеродным покрытием помещаются внутри частично откачанной камеры, подключенной к источнику питания.Когда между катодом и анодом на каждом конце камеры подается высокое напряжение, потенциал электронов ионизирует газ внутри камеры. Эти отрицательно заряженные ионы затем осаждаются на углероде, придавая углеродной пленке общую гидрофильную (притягивающую воду) поверхность.

После того, как небольшая капля образца помещена на гидрофильную сетку, ее необходимо окрасить, чтобы образец можно было легко отличить от фона. В просвечивающей электронной микроскопии для бомбардировки образца используется пучок электронов высокой энергии.В зависимости от количества энергии, которое было поглощено образцом, интенсивность луча, попадающего на экран просмотра, изменяется, и создается изображение (помните, что контраст возникает из-за взаимодействия луча с образцом). Однако углерод, кислород, азот и водород, основные компоненты биологических молекул, не очень плотные, и количество поглощаемых ими электронов минимально по сравнению с интенсивностью электронного луча. Поэтому для нормального просмотра ЭМ образцы окрашиваются солью тяжелого металла, которая легко поглощает электроны.Обычно это свинец, вольфрам, молибден, ванадий или обедненный уран. После окрашивания образец промокают, сушат на воздухе и готов к исследованию под микроскопом.

Окрашивание этими тяжелыми атомами называется «отрицательным окрашиванием», потому что человек видит не сам объект, а, скорее, область, свободную от пятна, окруженную пятном. В этой области нет пятен, потому что материал образца (например, белок) предотвращает его осаждение на углеродном слое. Хороший контраст достигается, когда пятно полностью окружает образец и соседнюю область.

Решетки с отверстиями

Рис. 2. Вверху: Подслушанное изображение самодельной сетки с дырками. Внизу: Изображение изготовленной решетки с отверстиями.

Хотя углеродная пленка очень тонкая и обычно не представляет большой проблемы с закрытием образца, для исследований с высоким разрешением неокрашенных биологических макромолекул любое вмешательство в луч может быть проблематичным. Для исследований с высоким разрешением используются решетки с отверстиями в сочетании с электронной микроскопией замораживающих образцов (крио).Подобно обычным сеткам с углеродным покрытием, дырчатые сетки покрыты тонким слоем углерода. Однако в процессе подготовки углеродная пленка осаждается таким образом, чтобы в углероде оставались отверстия желаемого размера (рис. 2). Одна из целей этих отверстий - исключить любое поглощение и рассеяние электронного луча углеродной пленкой, которое будет создавать шум и препятствовать прохождению сигнала. Поскольку cryo EM не использует окрашивание, желательно любое устранение фонового шума.Отверстия также позволяют образовываться «карманам» растворителя. Внутри этих карманов образец остается полностью гидратированным, даже если образец был заморожен.

Проблема может возникнуть, когда дырчатые решетки используются в сочетании с белками, которые имеют положительный заряд, такими как ДНК, связывающие белки. Поскольку углеродная пленка имеет небольшой отрицательный заряд, особенно после тлеющего разряда, она легко притягивает положительно заряженные белки. Следовательно, такой белок будет предпочтительно приземляться на углерод, а не на дырки.Обходной путь был разработан с использованием вторичного углеродного слоя. Дырявую сетку изготавливают, как описано выше. Однако перед нанесением образца поверх исходной пленки наносится очень тонкий слой углерода. Поскольку этот углерод является непрерывным, нет никаких предпочтений относительно того, где будет располагаться белок. Кроме того, слой достаточно тонкий, чтобы не оказывать большого влияния на отношение сигнал / шум образца.

СЛЕДУЮЩИЙ

Методы подготовки: испарение углерода


Приготовление макромолекулярных комплексов для криоэлектронной микроскопии

  • Для крио-ЭМ биологический образец сначала наносится на медные или молибденовые сетки, покрытые слоем дырявой углеродной пленки.Сетки из молибдена используются, когда критически важным требованием является плоскостность образца, поскольку молибден сводит к минимуму эффект смятия из-за теплового сжатия. Углерод с отверстиями обеспечивает дополнительную поддержку и стабильность решетки образца. Хорошая углеродная пленка с дырками будет иметь много отверстий диаметром примерно 1–5 мкм и может быть изготовлена ​​в лаборатории с минимальными ресурсами. Чтобы подготовить свои собственные решетки из углепластика с отверстиями, выполните действия, описанные в варианте A, или см. Вставку 1. В качестве альтернативы можно приобрести имеющиеся в продаже решетки с отверстиями с заданным распределением отверстий и размером (вариант B).Периодическое размещение отверстий в имеющихся в продаже сетках делает их более подходящими для автоматического сбора данных. Недостатками использования имеющихся в продаже сеток являются существенно более высокая стоимость, а также компромисс в уровне контроля качества. Для получения дополнительной информации о подготовке дырявого угля для поддержки см. Исх. 12.

    ДРУГИЕ ПРОТОКОЛЫ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА УГЛЕРОДА

    Существуют и другие протоколы для создания дырчатых углеродных решеток, в которых используется конденсация на холодной стеклянной поверхности для создания отверстий в слое формвара.Еще один метод использует предварительно сформированный нуклеопоровый фильтр в качестве дырявого субстрата (http://cimbio.scripps.edu/misc/ documentation).

    1. Изготовление сеток с покрытием из дырчатого углерода ~ 4 ч

      1. Приготовьте 2% (вес / объем) раствор формвара. Для создания множества отверстий подходящего размера суспензию капель глицерина / воды готовят в растворе формвара (пластика). Эти подвешенные капли образуют отверстия в углеродной поверхности (что будет позже).

        Поэтому важно иметь в растворе достаточно высокую концентрацию образующих дырки капель подходящего размера.В вытяжном шкафу растворите 0,2 г Formvar в 45 мл хлороформа в бутылке Уитона и встряхивайте, пока порошок не растворится.

      2. Добавьте 45 мл ацетона и 1,5 мл 90% (об. / Об.) Глицерина в воде и энергично встряхивайте в течение 10 мин.

      3. Обработайте смесь ультразвуковым датчиком в течение 5 мин. Капли глицерина, образующие отверстия, сливаются до нужного размера через 30 мин.

      4. Очистите предметные стекла, чтобы подготовить их к нанесению покрытия. Предметные стекла оптического микроскопа покрыты пленкой с отверстиями из пластика (Formvar).Эти предметные стекла следует сначала очистить, чтобы пленки легко снимались, а отверстия формировались равномерно. Вымойте с моющим средством и водой, тщательно ополоснув.

      5. Замочите предметные стекла в 95% этаноле на несколько минут.

      6. Протрите слайд насухо безворсовой тканью вдоль длинной оси слайда, чтобы совместить последующие отверстия.

      7. Покройте слайды дырявой пленкой. Опустите 2–3 см предметного стекла в стакан на 50 мл с 2% дырочным раствором Формвара и подержите там 5 с.

      8. Медленно извлеките предметное стекло под углом 45 ° к поверхности раствора. Сторона, которая образует острый угол с поверхностью, должна использоваться для следующего шага.

      9. Подождите, пока пленка высохнет (~ 1 мин).

      10. Осторожно окуните предметное стекло с покрытием в стакан с ацетоном и оставьте его конец погруженным примерно на 5 с при осторожном перемешивании.

      11. Посмотрите на слайд с фазово-контрастным LM. Может быть изрядное количество гладко круглых, а иногда и сгруппированных отверстий, которые приведут к сети дырявых формваров.Гладкие отверстия будут иметь больший контраст, чем сеть (см.). Если сеть кажется бледной, отверстия еще не перфорированы, и предметное стекло следует снова окунуть в ацетон (см.).

        Хорошая дырка Формвар. Изображение с фазово-контрастной LM, показывающее появление хорошей сети отверстий в покрытии Formvar на предметном стекле.

        Псевдо-дырчатая Формвар. Изображение с фазово-контрастного LM, показывающее внешний вид, когда покрытие Formvar не полностью перфорировано.

      12. Наблюдайте за каждым слайдом и сохраняйте лучшие.Окончательные решетки будут иметь гладкие круглые отверстия, несмотря на то, что на этом этапе они выглядят нерегулярно.

      13. Подготовьте дырявые решетки ЭМ. Надрежьте края предметного стекла с покрытием однолезвийной бритвой. Обязательно используйте ту сторону предметного стекла, которая образует острый угол с раствором, как описано выше.

      14. Снимите дырявую пленку Formvar с предметного стекла на поверхность емкости с дистиллированной водой.

      15. Поместите сетку 300 меш на пленку.

      16. Снимите всю покрытую сеткой пленку парафильмом и дайте им высохнуть (1 час).

      17. Покройте сетки слоем углерода толщиной 10 нм (что определяется по темно-серому цвету) с помощью вакуумного испарителя, пока они еще находятся на парапленке.

      18. Удалите сетки из парафильма и поместите их пленкой вверх в стеклянную чашку Петри на 4–5 листов фильтровальной бумаги, пропитанной хлороформом или амилацетатом.

      19. Оставьте сетки на ночь в насыщенной растворителем среде, чтобы удалить остатки формвара.

    2. Имеющиеся в продаже готовые решетки, покрытые дырочным углеродом

      1. Выберите подходящий тип готовых решеток.В этой лаборатории обычно используются сетки Quantifoil (http://www.quantifoil.com/) или C-flat (http://www.protochips.com/c_flat.html), которые изготавливаются по стандартному шаблону. отверстий на ЭМ сетке. При использовании готовых решеток с отверстиями выберите тип сетки, подходящий для вашего применения. Медные сетки размером 300 меш с отверстиями диаметром 2 мкм обычно используются для одночастичных применений.

      2. Перед использованием решетки Quantifoil, возможно, потребуется очистить органическим растворителем для удаления остаточного пластика и других загрязнений.Положите 4–5 слоев фильтровальной бумаги в стеклянную чашку Пертри.

      3. Смочите бумагу хлороформом с помощью стеклянной пипетки Пастера.

      4. Поместите сетки дырчатой ​​угольной стороной вверх на пропитанную фильтровальную бумагу.

      5. Накройте чашку Петри и оставьте решетки в вытяжном шкафу на ночь.

      6. При необходимости выполните дополнительные действия по промывке. Может потребоваться повторить этот шаг с деионизированной водой для удаления водорастворимых загрязнителей.

  • Решите, будет ли использоваться тонкий углерод (вариант A). Образцы либо наносятся непосредственно на дырчатый углерод, и в этом случае они заполняют отверстия в виде суспензии, либо помещаются на тонкий слой углерода, который покрывает дырчатый углерод. Тонкий углерод имеет некоторые преимущества, такие как пониженная зарядка и повышенная стабильность при воздействии электронного луча. Кроме того, значение расфокусировки изображений легче измерить по сильному сигналу тонкого углерода. Недостатком использования тонкой углеродной подложки является то, что она добавляет к изображению фоновый шум, что снижает отношение сигнал / шум.Обратитесь к варианту B для экспериментов без использования тонкого углерода.

    1. Изготовление и перенос тонкого угля>

      1. Начните с куска слюды размером 4 × 2 см. Расколите слюду, чтобы открылась свежая поверхность.

      2. Поместите свежеоткрытой стороной слюды лицевой стороной вверх на фильтровальную бумагу в чашке Петри.

      3. Приклейте слюду лентой к фильтровальной бумаге по самому краю слюды, чтобы она не нарушалась при вентиляции колпака испарителя.

      4. Покройте слюду тонким слоем (~ 5 нм) углерода с помощью угольного испарителя (см.).

        Слюда с углеродным покрытием. На свежесколотую слюду с помощью вакуумного испарителя наносят тонкий слой (приблизительно 50 Å) углерода. Толщину угля можно оценить, наблюдая за уровнем серого на фильтровальной бумаге (см. Красную стрелку). Также обратите внимание на пустоты, оставленные дырявыми угольными решетками в центре изображения, которые были повторно покрыты слюдой.

        Толщина углеродной пленки определяется полученным цветом или с помощью монитора толщины пленки.Решетки с отверстиями могут быть покрыты углеродом одновременно со слюдой или отдельно, если нет необходимости в тонком углероде (из слюды).

      5. Отрежьте кусок слюды с покрытием, немного превышающий размер сетки (5 мм), и нанесите углерод со слюды на поверхность фильтрованной деионизированной воды.

        Плавающий углерод можно визуализировать с помощью источника света высокой интенсивности, помещенного под углом к ​​поверхности воды.

      6. Возьмите углерод, используя решетку с отверстиями, убедившись, что сторона решетки с отверстиями находится в контакте с тонким углеродом.

      7. Повторяйте шаги 15 и 16, пока не будет подготовлено достаточное количество сеток.

      8. Решетки с углеродным покрытием можно использовать до 1 недели, если они оставлены в эксикаторе.

    2. Использование решеток с отверстиями без тонкого угля

      1. См. Во вставке 2 рекомендации по нанесению образца на сетку без тонкого угля поверх дырявого угля.

        NO THIN CARBON

        Образец также можно наносить непосредственно на дырчатый уголь.

        Концентрация образца должна быть увеличена в пять раз, чтобы получить такое же распределение частиц на сетке, при условии, что первоначальный предварительный скрининг был проведен с использованием метода отрицательного окрашивания.

      Сетки тлеющего разряда

  • Сетки рекомендуется тлеющим разрядом, чтобы образец покрыл сетку гладко и равномерно12,13. Приведены примеры изображений, показывающих хорошее () и плохое распространение () (см. Также). Тлеющий разряд / плазменная очистка удаляет любые остаточные углеводороды, тем самым делая сетки гидрофильными.В качестве альтернативы, гидрофобная поверхность может быть создана путем тлеющего разряда в присутствии раствора амиламина. Для тлеющего разряда принесите решетки с отверстиями с тонким углем или без него (в зависимости от используемого протокола) и поместите их на фильтровальную бумагу в небольшой чашке Петри.

    Микрофотография рибосом в стекловидном льду. Микрофотография показывает равномерное распределение частиц рибосом на замороженно-гидратированной сетке. Примечание : Контраст был инвертирован для последующей обработки изображения.

    ТАБЛИЦА 1

    Buffer
    Проблема Причина Решение Пример изображения
    Луч не виден Недостаточное блоттинг, слишком толстый лед или время изменения или увеличение пятен промокательная бумага (TI)
    Плохая контрастность Недостаточное промокание, слишком толстый лед Увеличьте время промокания или количество помарок или замените промокательную бумагу

    Плотный фон из если уровни сахарозы, глицерина и т. д.ниже 5%
    Накопление загрязнений в колонке Проверить, работает ли антиконтаминатор, высушить или удалить пленку, загруженную в прицел
    Неровный или пятнистый лед поверхность Решетки предварительной очистки; перед нанесением образца используйте свежий уголь и сетку с тлеющим разрядом (SP)
    Избыточное загрязнение Плохое перемещение или обращение Сократите время воздействия влажной среды на образец и холодные инструменты (BC)
    Примеси этана Используйте этан высокого качества; не трясите баллон с этаном; когда резервуар близок к тому, чтобы стать пустым, замените резервуар
    Кристаллический лед Неправильное погружение Убедитесь, что решетка погружается достаточно глубоко и достаточно быстро в криоген (X), (V)
    Расклеивание из-за работы с теплыми инструментами Предварительно охладите инструменты и убедитесь, что все контактные поверхности находятся ниже -140 ° C
    Плохой тепловой контакт решетки с держателем Очистите лодку для образца или убедитесь, что зажимное кольцо плотно затянуто
    Лиофилизированный образец Сильный нагрев, избыточное промокание (редко) Убедитесь, что все контактные поверхности ниже -140 ° C
    Деградированный образец Враждебная поверхность подложки Свойства Используйте другую партию сеток, чистых сеток и сеток тлеющего разряда
    Повышенная концентрация соли из-за испарения на сетке Используйте двусторонний блот; blot в среде с высокой влажностью
  • Поместите сетки в колпак тлеющего разрядника.

  • Закройте колпак.

  • Вакуумируйте колпак примерно на 1 мин.

  • Тлеющий разряд в течение 25 с при мощности около 20 Вт.

    Обратите внимание на светло-фиолетовое свечение в колпаке.

  • Медленно выпустите воздух из колпака.

  • Снимите чашку Петри с решетками. Теперь они готовы к нанесению на них образца.

    Сетки следует использовать в течение 1 часа после тлеющего разряда или их следует повторно обработать.

  • Подготовьте образец, как описано во вставке 3. Пример хорошо подготовленного образца показан на рис.

    ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦА

    Из-за относительно большого размера макромолекул, визуализируемых с помощью крио-ЭМ, в методах очистки обычно используется скоростная седиментация в сахарозе или глицерине. Крайне важным требованием является удаление таких криозащитных средств из образца перед замораживанием. Это связано с тем, что при высоких концентрациях криозащитные средства будут мешать процессу замораживания и, даже при более низких концентрациях, будут вносить вклад в фоновый шум, уменьшая контраст между сигналом от комплекса и фоном.Более низкое отношение сигнал / шум затрудняет идентификацию и выравнивание частиц. Как правило, количество криозащитного средства должно быть как можно меньшим и никогда не должно превышать 5% (вес / объем).

    Cryo-EM требует небольшого количества материала. Одна крио-ЭМ сетка состоит из 4–5 мкл образца с концентрацией всего 30 нМ для рибосом (~ 70 мкг мл -1 для рибосомы 70S) с использованием тонкого углеродного слоя и легко будет содержать достаточно отдельных частиц. для всего набора данных.

    Примечание : Если тонкослойная углеродная пленка (см. Выше) опущена, то концентрация образца должна быть увеличена примерно в пять раз, чтобы получить эквивалентное распределение частиц.Некоторый первоначальный скрининг концентрации образца должен быть выполнен для оптимизации сбора данных. Наконец, может потребоваться некоторая предварительная работа для предотвращения слипания или агрегирования отдельных частиц. Идеальный образец должен покрывать всю сетку с частицами, близкими, но не касающимися друг друга ().

    Поскольку крио-ЭМ реконструкции получаются путем объединения тысяч отдельных проекций, чрезвычайно важно получить однородный образец. Неоднородность может возникать из-за нескольких факторов, таких как частичная занятость лиганда, связывание которого связано с конформационными изменениями в целевой макромолекуле.Следовательно, предпочтительно сначала проверить биохимические условия, такие как стехиометрия лиганда, время и температура инкубации, буферные условия (т.е. pH, концентрация соли) и концентрации компонентов, которые дают наиболее гомогенный образец. Дефектные по расщеплению лиганды, негидролизуемые аналоги АТФ / ГТФ или антибиотики обычно используются для «блокировки» комплексов в одном и том же состоянии. Кроме того, существуют вычислительные методы для устранения неоднородности после сбора данных19–21; однако чем более чистый и однородный исходный образец, тем проще обработка данных.

  • Выберите желаемую технику подготовки ЭМ-сетки. Варианты подготовки сетки: замороженная-гидратированная, отрицательно окрашенная или более недавно разработанная комбинация этих двух, крио-отрицательная окраска. Замороженный гидратированный препарат, обсуждаемый в этом протоколе, позволяет визуализировать фактическое распределение плотности в сборке для изучения, но с низким контрастом. Напротив, при отрицательном окрашивании молекула оказывается в оболочке из электронно-плотного материала, который дает гораздо более высокий контраст, чем с замороженно-гидратированным препаратом при просмотре в электронном микроскопе14,15.Хороший справочник по протоколам отрицательного окрашивания представлен в ссылке. 16.

    Гибридным подходом этих двух методов является криоотрицательное окрашивание17, при котором молекула разводится в растворе красителя, промокается и замораживается погружением, как стандартная замороженно-гидратированная сетка.

    Обратите внимание, что в этом протоколе описывается подготовка замороженных гидратированных решеток для одночастичных образцов.

  • Установите стопорный поршень. Обратите внимание, что следующие шаги описывают метод использования стопорного поршня, описанный во вставке 4 и показанный в.Пример образца не стекловидного льда можно увидеть на.

    МОРОЗИЛЬНИК

    Для рутинной подготовки замороженно-гидратированной пробы обычно используется специально разработанный погружной аппарат22. Эти поршни должны позволять

    • удерживание электромагнитной сетки на краю, чтобы можно было нанести образец (пинцет)

    • удаление излишков образца с сетки для создания сетки, прозрачной для электронов (блоттинг)

    • чрезвычайно быстрое стеклование (погружение в чашку, содержащую криоген, например жидкий этан или пропан).

    Замороженный гидратированный образец следует перенести из пинцета в контейнер для хранения, поддерживая температуру ниже температуры расстекловывания -137 ° C (см. Ссылку 18) (сосуд для переноса) (пример образца в не стекловидном теле). лед можно увидеть в). Для повышения воспроизводимости сеток был разработан специальный погружной аппарат22. Он промокает с обеих сторон и сохраняет решетку между двумя листами фильтровальной бумаги перед быстрым погружением в жидкий этан (). Другие поршни, которые можно использовать, и протоколы их использования - это Vitrobot (http: // www.fei.com/) (см. ссылку 23), криогенную камеру Gatan (http://www.gatan.com/) и устройство для замораживания с временным разрешением. Единица с разрешением по времени, которая делается на заказ, полезна при попытке разрешить реакции, которые происходят в шкале времени 10 мс24.

    Ручной погружной морозильный аппарат. Образец прикладывают к сетке, удерживаемой пинцетом (синяя стрелка). Слой образца промокают между фильтрующими подушками (зеленая стрелка) и быстро погружают в чашку для криогенного вещества (красная стрелка).

    Решетки для замораживания с ручным поршнем ~ 1 час

  • Используйте устройство, описанное в рамке 4, в холодном помещении для увеличения относительной влажности и понижения температуры.В нашей лаборатории используются следующие условия: относительная влажность ~ 90% и температура ~ 6 ° C.

  • Заполните криогенный сосуд жидким азотом, чтобы охладить прибор, и дождитесь, пока не прекратится быстрое кипение азота.

  • Медленно конденсируйте этан в холодном криогенном резервуаре, пока он не заполнится жидким этаном.

    Этан следует поддерживать в мутном, но не замороженном состоянии. Возможно, потребуется разморозить этан в чашке с помощью медленной струи свежего этанового газа.

  • Поместите решетчатый ящик (для хранения замороженных решеток) в бассейн с жидким азотом.

  • Предварительно охладите набор из большого пинцета и отвертки в отдельном сосуде Дьюара объемом 350 мл, наполовину заполненном жидким азотом.

  • Возьмите пинцетом свежесваренную решетку с угольным покрытием и установите ее на погружной аппарат.

  • Пипеткой внесите 4–5 мкл образца на установленную решетку. Убедитесь, что он нанесен на сторону с углем.

  • Подождите определенное время (30 с), чтобы частицы могли прилипнуть к углю (если он используется).

    Это время ожидания влияет на распределение частиц и может быть изменено или исключено в зависимости от свойств частиц.

    Если погружение производится при более высоких температурах или низкой влажности, может происходить значительное испарение, приводящее к охлаждению, а также к увеличению концентрации соли. Этот эффект может повредить чувствительные образцы, и в таких случаях этот шаг следует пропустить.

  • Промокните сетку между двумя частями ватмана №. 1 фильтровальную бумагу примерно на 2 с и отпустите поршень педальным переключателем.

    Время блоттинга может быть разным, но цель состоит в том, чтобы сделать лед как можно тоньше, сохраняя при этом адекватную концентрацию образца.

  • Снимите пинцет и поднимите стержень плунжера от криогена, следя за тем, чтобы не удалить решетку с криогена, которая может заморозить или расстекловать образец.

    Приведены примеры изображений, на которых показаны лиофилизированные () и не стекловидные () образцы (см. Также).

  • Поместите сетку в предварительно охлажденный блок сетки и при необходимости повторите процесс.

  • Когда все решетки сделаны, выньте решетчатый ящик из бассейна и либо сохраните его, либо принесите в соответствующий контейнер к микроскопу.

  • Предварительно охладите все оборудование, необходимое для обработки, хранения и транспортировки замороженно-гидратированных решеток.После подготовки криосетки должны храниться ниже температуры расстекловывания -137 ° C (см. Ссылку 18). Следовательно, любой инструмент, который будет соприкасаться с решетками или решетчатыми коробками, необходимо предварительно охладить, предварительно погрузив его в жидкий азот.

    При работе с этими предварительно охлажденными инструментами необходимо надевать защитные перчатки, чтобы избежать обморожения. Кроме того, инструменты следует нагреть до комнатной температуры (20–30 ° C) и высушить перед повторным использованием, чтобы свести к минимуму попадание конденсированного льда в сетку (см. И (BC)).Ящики с индивидуальной маркировкой хранятся в сосуде Дьюара в атмосфере жидкого азота. Даже при этой температуре может происходить сублимационная сушка, поэтому рекомендуется использовать сетки в течение года с даты их изготовления.

  • Поместите замороженно-гидратированные решетки в предварительно охлажденный решетчатый ящик собственного производства или купленный на коммерческой основе.

  • Перенесите решетку в небольшой сосуд Дьюара на 350 мл, наполненный жидким азотом.

  • Поднесите решетку к микроскопу для просмотра, как описано в исх.9 или поместите его в криохранилище Дьюара.

  • Рекомендации по поиску и устранению неисправностей можно найти в.

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    сливная решетка - испанский перевод - Linguee

    Bo tt o m сливная решетка w i th Клапан для легкого отбора и разгрузки проб.

    unionprocess.com

    Rejilla de descarga inferior con v lvula para fcil muest re or y descarga .

    unionprocess.com

    Преобразование

    [...] Комплект состоит из u pp e r нагнетания c h ambe r , l сетки на е узел, крыльчатка и [...]

    вал мешалки / рычаг в сборе.

    unionprocess.com

    Комплект для преобразования констант

    [...] de un a cma ra d e descarga s uper ior, u nidad de p la impul d14 914 так что рй ансамбль [...]

    de eje / brazo agitador.

    unionprocess.com

    С fo rc e d сетка - f e ed ing, возможно e t o разряд t h e батареи в t h e сетка d u ri ng a given [...]

    таймфрейм.

    shop-microtherm.com

    Con l a inyeccin f orzada, e s posib le descargar la s bat er a s un d1475 en urant e un tiempo dado.

    shop-microtherm.com

    Между временем начала {1525} и временем окончания {1526}

    [...] батареи a r e разряд t o t h e grid

    e ed Напряжение [...]

    цель {1524}.

    shop-microtherm.com

    Entre la hora de inicio {1525} y la hora de fin

    [...] {1526} las bat er as s e descargan h asta el umbral de [...]

    тензин де иньекцин {1524}.

    shop-microtherm.com

    Если время старта и остановка

    [...]

    раз совпадают, значит

    [...] используется stan da r d grid - f e ed ing, а не принудительное жадное кормление ( n разряд o f t he аккумулятор в t h e сетка ) .

    shop-microtherm.com

    Si la hora de inicio y la hora de final

    [...] Сын idnticas, se utilizar la inyeccin est nd ar y no la inyeccin forza da (si n descarga d

    76 eb nl a красный ) .

    shop-microtherm.com

    Они защищают силовые полупроводники в

    [...]

    шкаф усиленный, временный

    [...] пики напряжения в t h e сетка , a nd th e y разряд e дроссель в случае [...]

    отключения от сети.

    gruposolar.es

    Varistores en el lado de la red Protegen a los semiconductores de

    [...]

    потенция en caso de picos

    [...] интенсивность напряжений и ограничения на и po, гарантия el иминацин [...]

    de la energa en la bobina

    [...]

    en caso de desconexin de la red.

    gruposolar.es

    В 19:00

    [...] инвертор запуск с t o разряд t h e батареи в t h e a a т он дал [...]

    максимальный ток.

    shop-microtherm.com

    A las 19h00 el

    [...] inversor co mienz a a descargar las bate r a s en la red a cor en la en la

    shop-microtherm.com

    При установке заподлицо в op e n сетка c e il ings, t h e

    76 h ar Характеристики такие же, как у [...]

    подвешен в свободном пространстве.

    trox.in

    El comportamiento de l flujo d e air es igual en el caso de montaje enrasado en techo reticulado [...]

    que cuando est suspendido.

    trox.com.ar

    Потребители должны обеспечить среднее потребление

    [...]

    , что меньше мощности источника

    [...] (генератор или пу bl i c сетка ) i n , чтобы избежать компа le t e разряд o f t he аккумулятор.

    shop-microtherm.com

    El usuario debe estar atento a tener un consumo medio

    [...]

    нижний по вкусу

    [...] fuente (gen er ador o red p blic a) , con el fin de ev it ar u na descarga co mple ta de la [.. .]

    батера.

    shop-microtherm.com

    Сюда входят простые приводы для работы на a сетке ( l ev e l o r o nt rol), а также наиболее сложные приложения, включающие изолированную сеть или параллельную работу.

    wkv-ag.de

    Este comprende desde Reguladores simples de posicin (Regulacin de caudal o nivel de agua) hasta sistemas complejos de seales para operacin aislada o en paralelo.

    wkv-ag.de

    Кроме того, в этом месте нет поддержки генератора аварийной энергии в случае подачи электроэнергии.

    [...] сбой на общественном ути ли т у сетка .

    daccess-ods.un.org

    Adems, no dispone de un grupo electrgeno de Emergencia en caso de que se produzca un fallo en el

    [...] suministro elc tr ico d e l a красный p bl ica .

    daccess-ods.un.org

    Максимально ускорить, доработки

    [...] к трансмиссии si o n сетке p r ot ection systems.

    aeval.es

    Acelerar en la medida de lo posible la adaptor de los sistemas de

    [...] Protecci n de l a красный d e tra ns porte.

    aeval.es

    Хочу отметить тот факт, что жизненно важно, чтобы инвестиции составили

    [...] сделано в силовой су пп л у сетка .

    europarl.europa.eu

    Me gustara sealar el hecho de que es de vital importancia que se invierta en la

    [...] красный d e sumin ist ro elctrico .

    europarl.europa.eu

    Чтобы иметь возможность работать, готовить или учиться в ночное время,

    [...] люди, живущие за пределами t h e grid h a ve искать альтернативу [...]

    решения.

    unpei.org

    Para poder trabajar, cocinar o estudiar de noche, las personas que se

    [...] encuentran f uera de la красный de ben busc ar soluciones [...]

    alternativas.

    unpei.org

    Наполнитель a n d нагнетание d e vi ces (включая фланцы или резьбовые заглушки) и защитные колпачки (если есть) должны быть защищены от любых непреднамеренное открытие.

    eur-lex.europa.eu

    Los rganos de llenado y vaciado (Incluyendo las bridas o los tapones roscados) y las tapas de proteccin que puedan existir, se asegurarn contra cualquier apertura intempestiva.

    eur-lex.europa.eu

    Я тоже думаю, что стоит присмотреться еще немного

    [...] близко на t h e выпуск f o r фонд развития.

    europarl.europa.eu

    Tambin me parece buena idea экзамен ms

    [...] детенидам nt и апробацин de l os fondos [...]

    para el desarrollo.

    europarl.europa.eu

    Я хочу

    [...] рекомендую th a t нагнетание b e g запущено на [...]

    раза в этом году.

    europarl.europa.eu

    Ме густара

    [...] recomendar q ue la gestin se a pruebe a [...]

    tiempo este ao.

    europarl.europa.eu

    Малые генераторы часто сталкиваются с проблемами, связанными с работой и синхронизацией между собой.

    europarl.europa.eu

    Los generadores de energa de pequeo tamao se toan a menudo con problemsas relacionados con la conexin de redes y la sincronizacin.

    europarl.europa.eu

    Новым отличительным отличительным признаком является хромированное кольцо Design с цифрой

    . [...] надпись «High Inten si t y Discharge X e no n».

    hella-press.de

    El Nuevo Difacado Destacado Es El Anillo De Diso Cromado Con El

    [...] rtulo "H igh Inte нс разряд Xen на " .

    hella-press.de

    Коллекция отвечает требованиям, предъявляемым к различным сферам применения: высокая обувь,

    [...]

    тапочки по щиколотку, три модели из мембраны Gore-Tex и ESD

    [...] (Electro St at i c Discharge ) a ls o доступно [...]

    в одной модели.

    proteccion-laboral.com

    Se trata de una coleccin que response a las exigencias de usos ms arguments: calzado alto, por el

    [...]

    tobillo, pantuflas, tres modelos que se han realizado conmbrana Gore-Tex, y un

    [...] modelo ESD ( Elect ro Sta tic Discharge) .

    proteccion-laboral.com

    IAH также выразил поддержку

    [...]

    JIIHP, в частности, для реализации проектов, связанных с искусственным питанием, водно-болотными угодьями и

    [...] Подводная лодка Groundw at e r Разряд .

    unesdoc.unesco.org

    La AIH tambin expres su apoyo al JIIHP, en

    [...]

    , в частности, в рамках проекта по искусственному пополнению, водно-болотные угодья и

    [...] Subma ri ne Gr oun dwa ter Discharge .

    unesdoc.unesco.org

    Ливингстон и его коллеги проанализировали 36 лет из

    [...] данные из Национальной больницы it a l Выпуск S u rv ey и выявлено сезонное [...]

    вариации и кластеризация

    [...]

    случаев аппендицита, которые, по его словам, подтверждают теорию о том, что аппендицит может быть вирусным заболеванием, таким как грипп.

    womenshealth.gov

    Ливингстон и сус колегас анализ

    [...]

    36 дат по

    [...] Encuesta n ac ional de altas hos pital ar ias (Национальное обследование при выписке из больниц) [...]

    и идентификатор вариации

    [...]

    estacionales y agrupacin de casos de apendicitis que, dijeron, apoyan la teora de que la apendicitis podra ser una enfermedad viral, como la gripe.

    womenshealth.gov

    В производстве и переработке электронных

    [...] компонентов, ESD (Electrost at i c Discharge , E SD ) представляет серьезную угрозу [...]

    для чувствительной электроники.

    gigatronic.es

    En la fabricacin y el процедурами компонентов

    [...] electrnico s, la descarga ele ct rost ti ca ( ElectroStatic Dis ch arge, [...]

    ESD) представляет серию изменений для разумной электричества.

    gigatronic.es

    После второй стадии обработки PACT стоки смешиваются с бесконтактным охлаждением

    [...]

    вода для регулировки температуры

    [...] до того, как быть сброшенным fe l y i n к реке Делавэр через NJPDES разрешено (New Jersey Pollu ti n1476 975 914 Напор E л im Система) [...]

    водопад.

    www2.dupont.com

    Despus de una segunda etapa de tratamiento PACT, el efluente se mezcla con agua Refrigerante sin contacto, de modo que sea posible

    [...]

    температура воздуха

    [...] antes de s er vertido de m anera segura en el Ro Delaware a travs del desage aprobado por el Sistem a de e liminacin de contaminantes en [...]

    desages de Nueva Jersey

    [...]

    (NJPDES, Система устранения выбросов загрязняющих веществ в Нью-Джерси).

    www2.dupont.com

    Эту запись следует цитировать

    [...] как: Early Suppo rt e d Discharge T r ia списки.

    www2.cochrane.org

    Esta revisin debera citarse

    [...] como: Ea rly S upp или ted Discharge Tri al ist s .

    www2.cochrane.org

    Обследование №14: Отображение

    [...] Chemical Substa nc e s Нагнетание w h en Отопление Clay

    guide.echa.europa.eu

    Estudio n 14 de la Agencia de Proteccin del Medio Ambiente danesa titulado Карта

    [...] Chemic al Subs tan ces Discharge whe n h eatin g Clay

    руководство.echa.europa.eu

    Наши записи показывают, что вы недавно были пациентом в [ИМЯ

    [...] БОЛЬНИЦА] a n d выписано o n [ DAT E O F

    Sterlingresearchgroup.com

    Nuestros registros indican que usted estuvo hospitalizado en [НАЗВАНИЕ

    [...] БОЛЬНИЦА] y que le di er on d e alta e l [D at E OF DISCHARGE].

    Sterlingresearchgroup.com

    8. Поверните маслоотражатель

    . [...] Клапан к th e T O НАГНЕТ H O SE положение. 11

    gfse.com

    8. Coloque la Vlvula de Desviacin del aceite a

    [...] la po si cin de descarga "TO DIS CH ARGE HOSE". 8

    gfse.com

    Как влияет фактор глубины разряда в аккумуляторных системах, подключенных к сети?

    Чтобы спроектировать аккумулятор, который прослужит долго и обеспечит надежную работу в течение всего номинального срока службы, необходимо учитывать несколько критериев, некоторые из которых уже рассмотрены в нашей статье «Аккумуляторные батареи».Рабочая температура, напряжение, скорость заряда и разряда, а также запланированная глубина разряда и дни автономной работы - все это ключевые термины, которые учитываются в размере и типе батареи, но один из этих параметров, глубина разряда (DOD), имеет заметное значение. влияние на срок службы батареи. DOD очень тесно связан с циклом жизни - или количеством циклов разряда, которое батарея может выполнить до того, как уменьшится до 80% от своей первоначальной емкости (точка, при которой батарея считается истекшей сроком службы).Хотя наиболее распространенным типом химии батарей для использования на солнечной энергии является свинцово-кислотная, DOD в некоторой степени влияет на химию каждой батареи.

    Очень часто можно услышать, что разработчики аккумуляторов просто удваивают размер аккумулятора на основе расчетных нагрузок и продолжительности разряда, чтобы достичь 50% DOD и прийти к общему размеру аккумулятора и бюджету. Для свинцово-кислотных аккумуляторов это всего лишь отправная точка.

    Вообще говоря, существует два типа солнечных батарей глубокого цикла.Наиболее распространенной является батарея Off Grid, которая работает каждый день и имеет достаточный размер, чтобы выдерживать длительную низкую освещенность. Вторым по распространенности является аккумулятор, рассчитанный на периодическое резервное питание и резервное питание, особенно в системах с подключением к сети переменного тока.

    Если предположить, что нагрузки и дни автономной работы уже известны, чем резервная батарея с подключением переменного тока отличается по размеру от автономной батареи? Батарея представляет собой массив ячеек - последовательно и параллельно. Каждая ячейка представляет собой химическую реакцию, и если химическая реакция может поддерживаться в рамках устойчивого окна, то способность каждой ячейки поддерживать реакцию может оставаться высокой в ​​течение всего номинального срока службы батареи и даже дольше.

    Вот типичный график зависимости срока службы батареи от DOD. При 50% DOD указанная батарея, как ожидается, проработает 1150 циклов, прежде чем ее емкость снизится до 80% от первоначальной, но при 20% DOD за цикл можно ожидать, что батарея прослужит 3300 циклов (или 9 лет при 1 цикле на день) - что является респектабельной целью для батареи Off Grid.


    Помните о сроке службы батареи - что может быть более точным, чем «правило 50%»? Для автономных приложений, где можно ожидать, что батарея будет работать каждый день, лучшим ориентиром было бы проектирование с DOD 20%, а не 50%.

    Для связанных с сетью систем с батареями, используемыми только для резервного копирования, DOD может пойти намного дальше, поскольку можно ожидать, что сеть покроет, по крайней мере, некоторые дни, в течение которых система работает, и, надеюсь, большинство из них - мы не хотим планировать для 100% защиты от разряда - чрезмерная разрядка может необратимо повредить аккумулятор. Но если бы мы запланировали 80% DOD, это позволило бы нам 675 циклов, и маловероятно, что мы испытаем 675 дней отключения электроэнергии за 10-летний период.

    Таким образом, при разработке батареи для резервного использования, глубина разряда может быть установлена ​​значительно ниже, чем при разработке батареи для ежедневного использования на велосипеде.Так, например, если система с прогнозируемым потреблением 500 Ач подключена к относительно исправной сети, ожидаются только периодические отключения, а батарея является высококачественной батареей глубокого цикла, то это могла бы быть батарея на 1000 Ач с 50% DOD. Теперь это может быть батарея емкостью 600 Ач с периодической разрядкой 80% - существенная экономия затрат и места.

    .

    Об авторе

    alexxlab administrator

    Оставить ответ