Выписка из протокола пример: Выписка из протокола заседания комиссии. Образец и бланк 2021 года

Выписка из протокола пример: Выписка из протокола заседания комиссии. Образец и бланк 2021 года

Содержание

Выписка из протокола заседания комиссии. Образец и бланк 2021 года

Выписка из протокола заседания комиссии – документ, который может потребоваться в самых разных случаях.

Что такое протокол заседания комиссии

На предприятиях и в организациях работа всевозможных комиссий не такое уж и редкое явление. Обычно в состав комиссий включается несколько сотрудников компании, которые профессионально решают поставленные перед ними задачи. Комиссии бывают учредительные, аттестационные, приемочные, инвентаризационные, они собираются по поводу конференций, семинаров и т.д. При этом работа любой комиссии обязательно фиксируется в специальном протоколе. В него заносятся сведения о том, кто входит в комиссию, какие цели перед участниками были поставлены, каким образом они были достигнуты и решение комиссии.

ФАЙЛЫ
Скачать пустой бланк выписки из протокола заседания комиссии .docСкачать образец выписки из протокола заседания комиссии . doc

Виды протоколов

Протоколы условно можно поделить на два типа. К первому относятся краткие протоколы – они обычно применяются для регистрации работы комиссий, созванных в оперативном порядке, в том числе и незапланированных заранее. В них вносится только та информация, которая касается обсуждаемых вопросов, мнения участников и общего решения. А вот в полных протоколах сведения более объемны. В них вписываются не только основные данные, но и вся процедура заседания, включая подробное обсуждение, реплики, мнения, ход голосования, итоги. На таких заседаниях с полным протоколом всегда есть председатель, который им руководит и секретарь, который во всех деталях фиксирует происходящее. Иногда полный протокол может достигать нескольких страниц.

Зачем делать выписку

Зачастую информация, содержащаяся в протоколах, отражает секретные моменты текущей деятельности фирмы и не предназначена для широкой аудитории. Выписка помогает решить эту проблему.

С ее помощью заинтересованные лица получают нужные им данные, а конфиденциальность протокола сохраняется. Также выписка целесообразна при чрезмерно большом объеме протокола. Как правило, речь в выписке идет только о каком-то конкретном принятом решении.

Если говорить о практике, которая имеет широчайшее распространение, то выписки из протоколов заседаний помогают руководству компаний осуществлять деятельность по организации работы своих предприятий, контролировать работу производств, регулировать выполнение распоряжений, приказов (иногда выписки даже являются своего рода их заменителем) и т.д.

При помощи выписок государственные надзорные ведомства, контрагенты, банковские кредитные учреждения своевременно информируются о деятельности фирмы.

Чем отличаются выписка и копия

Некоторые работники организаций ошибочно полагают, что копия и выписка – это одно и то же. Это не совсем так. Между ними есть принципиальное отличие: копия – это абсолютно идентичный оригиналу документ, который делается обычно при помощи копировальной техники. Выписка же – это только некоторая часть оригинала и достаточно часто формируется она от руки (когда из документа берутся только те куски текста, которые требуются в каком-то конкретном случае).

Кто делает выписку

Выписку обычно делает сотрудник предприятия, в чьем ведении находится работа с протоколами, в том числе по их сохранению (это может быть секретарь, юрист или сам руководитель организации).

При этом выписка обязательно должна быть заверена уполномоченным на этом работником компании. Также на выписке должна стоять печать (если компания применяет штампы для визирования бумаг).

Как получить выписку

Чтобы получить требуемую выписку от заинтересованного лица, должен поступить соответствующий запрос или заявление в письменном виде с обозначением причин, по которым ему нужен данный документ и указанием учреждения, для предоставления в которое он понадобился.

Образец выписки из протокола заседания комиссии

При необходимости сделать выписку, посмотрите ее пример – с его помощью вы без труда сделаете то, что вам нужно.

  1. В начале документа обязательно напишите наименование организации, также укажите состав комиссии, отметьте повестку дня.
  2. Далее выпишите те данные из хода заседания, которые касаются заинтересованного лица и обязательно – решение комиссии.
  3. После этого, в конце документа поставьте надпись «Верно» или «Выписка верна», подпишите и датируйте бланк.

Выписка из протокола общего собрания — образец 2021

Скачать образец выписки из протокола общего собрания акционеров

Скачать образец выписки из протокола общего собрания ООО

Скачать образец выписки из решения общего собрания

Что такое протокол мероприятия

Протокол — это официальный документ, который ведется в письменном виде в ходе общего собрания людей, объединенных одним делом или проблемой. Общий сбор может быть у жильцов одного дома, акционеров или работников предприятия, а записывать результаты события сейчас требуют даже на родительских собраниях в школах. В резолюции отражают ход событий, перечень затрагиваемых вопросов и обсуждений, очередность выступлений и их основные тезисы, а также принятые решения.

Поскольку выписка из протокола общего собрания, образец которой представлен в статье, — это частичная копия стенограммы мероприятия, в которой содержатся краткие сведения и итог рассмотрения конкретного вопроса, в ней нужно указать полное наименование организации (юридического лица), дату проведения сбора, и сформулировать вопрос, который является основной темой фрагмента. При необходимости могут полностью копироваться абзацы текста, в которых приводятся принятые по вопросу решения. В юридических лицах такая форма документации используется для донесения новой информации. По сути она является основанием для изменений в производственных процессах организации и уточнения частностей. В этом случае делопроизводитель компании оформляет необходимое число копий и передает ответственным за исполнение лицам. Эти же копии впоследствии будут основным документом для контроля за исполнением принятых решений.

В отношении физических лиц фрагменты из документов, касающихся прав и законных интересов граждан, выдаются по их требованию, в порядке, установленном актуальным на сегодняшний день Указом Президиума ВС СССР от 04. 08.1983 № 9779-X (ред. от 08.12.2003) «О порядке выдачи и свидетельствования предприятиями, учреждениями и организациями копий документов, касающихся прав граждан».

В каких случаях нужна

Чаще всего фрагменты резолюций требуются:

  • для предоставления в финансовые организации;
  • для ФНС или иных контролирующих органов;
  • для предоставления информации участникам общества в части, их касающейся;
  • при обращении заинтересованных лиц по вопросам, которые были рассмотрены.

Как написать выписку из протокола собрания

Составлением подобной документации занимается секретарь организации или сотрудник, ответственный за делопроизводство. Единого регламентированного порядка составления этого документа не разработано. Существуют лишь общепринятые правила оформления:

  • начинаться она должна со слов «Выписка из протокола общего собрания...»;
  • в вводной части текста указывают количество участников события и основные реквизиты протокола;
  • указывается не только суть вопроса, но и его номер (пункт), под которым он фигурирует в основном документе;
  • составитель — тот, кто подписывает выписку из протокола общего собрания, после текста пишет фразу «Выписка верна», расшифровывает свою подпись, должность и также указывает дату составления;
  • подпись составителя и верификация дополняются печатью организации.

В документах для внутреннего пользования заверить документ может секретарь, а вот копия для внешних организаций заверяется обязательно руководством.

Копии выписок имеют разный срок хранения. В зависимости от важности затронутых во время заседания вопросов, они могут храниться от 5 до 75 лет (пункты 415 и 656 перечня, утвержденного Приказом Минкультуры России от 25.08.2010 № 558).

срок действия, образец, как выглядит

С помощью протокола документируют происходящее на собрании или заседании. В организации, созданной на основе членства участников — физических и юридических лиц — коллегиальные решения обязательны для исполнения. Собрание как высший орган управления существует в коммерческих (ООО, АО, ПАО) и некоммерческих (педсовет, профсоюз, садовое товарищество, родительский комитет, ТСЖ и др.) учреждений. Протокол может содержать несколько листов текста. Если необходимо донести какое-либо из принятых решение до заинтересованной стороны, используют выписки из него.

И сегодня мы узнаем, какова форма выписки из протокола, как проходит ее оформление, и что для этого потребуется.

Общая информация

Понятие и особенности выписки из протокола

Выписка из протокола — копия его отдельных частей, сформированная и заверенная установленный образом. В законодательстве нет особых норм, регулирующих порядок составления выписки. Часто правила по подготовке, оформлению и заверению документа содержатся в локальных нормах — принятых в организации инструкциях по делопроизводству. Если таких нет, руководствуются:

  • ГОСТ Р 7.08-2013. В нем есть определение понятия «выписка из документа», которое применяется в отношении выписки из протокола;
  • ГОСТ Р 6.30-2003. Включает правила оформления документов, в том числе порядок заверения, внесения реквизитов;
  • действующим до сих пор Указом Президиума ВС РФ СССР № 9779-X от 04.08.1983. Он определяет, что выписка из документов (в т.
    ч. протоколов) должна выдаваться по требованию любого гражданина или организации, чьи права затронуты обозначенными там решениями;
  • нормами, регулирующими деятельность разных юридических лиц. В отношении ООО к таким относится, например, ФЗ № 14 от 08.02.1998 г.

Заполнение документа

ГОСТом рекомендовано делать выписку на фирменном бланке организации. Она состоит из нескольких частей:

  • вводной (наименование, дату и место проведения собрания, список присутствующих с распределением по ролям, отметку о кворуме). Воспроизводится в соответствии с протоколом;
  • основной — нужные абзацы из повестки дня, разделы «СЛУШАЛИ», «ВЫСТУПИЛИ»;
  • результирующей части (решение) из раздела «ПОСТАНОВИЛИ»;
  • блок «Подписи»: перечень участников, подписавших протокол, их ФИО.

В конце синей шариковой или гелиевой ручкой проставляется заверение.

Выписка из протокола общего собрания трудового коллектива о награждении (ее образец) доступен для просмотра ниже, скачать его можно здесь.

Выписка из протокола общего собрания трудового коллектива о награждении

Выписка из протокола трудового коллектива о награждении — 1 Выписка из протокола трудового коллектива о награждении — 2

Скачать выписку из протокола педагогического совета (ее образец) можно здесь.

Выписка из протокола педсовета (образец)

Выписка из протокола профсоюзного собрания также доступна для скачивания.

Выписка из протокола профсоюзного собрания (образец)

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии также доступна для скачивания.

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии

Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии — 1 Выписка из протокола заседания аттестационной комиссии — 2

Функции

Выписка необходима для предоставления заинтересованным сторонам, контрагентам, государственным структурам. Чаще всего ее оформляют в двух случаях:

  • в протоколе содержится информация, представляющая коммерческую или личную тайну;
  • полный текст протокола слишком большой.

Выписки, посвященные какому-либо решению, могут рассылаться заинтересованным сторонам (работникам, филиалам организации). Часто таким образом руководство доносит предписания и приказы до исполнителей.

О том, как оформить выписку из протокола, читайте ниже.

Порядок получения документа

Составление

Протокол подшивается в тетрадь и хранится в архиве организации. Выписки из него готовит секретарь по запросу заинтересованного лица, он же чаще всего ее заверяет (если в уставе не определено иное).

Как правильно составить выписку:

  • Вводная часть воспроизводится, как в протоколе. Проставляется дата, место, наименование документа («Выписка из протокола общего собрания ООО «Цветочек» № XX»). Указываются председатель, секретарь, присутствующие на заседании участники. Особо отмечается, есть ли кворум.
  • Основная часть включает цитату из повестки дня с указанием порядкового номера в очереди вопросов. Далее иду разделы «СЛУШАЛИ» (ФИО докладчика), «ВЫСТУПАЛИ» (имена тех, кто высказывался по вопросу).
  • Резолютивная часть — принятое решение («ПОСТАНОВИЛИ»).
  • Перечень участников, подписавших протокол, без проставления реальных автографов (необходимо заменить на слова «Личная подпись»), напротив — их ФИО.

Заверение

Заверение необходимо для того, чтобы выписка получила юридическую значимость. Оно оформляется согласно ГОСТ Р 6.30-2003. Секретарь или иное должностное лицо, уполномоченное подписывать документы, вносит:

  • слово «Верно»;
  • должность составителя;
  • подпись и расшифровку;
  • дату составления и заверения;
  • пометку, где находится оригинал протокола.

Если выписка предназначена для предоставления в стороннюю организацию, проставляют печать. Ее нужно ставить так, чтобы частично покрывать должность и роспись составителя.

Выписку готовят как в отношении одного вопроса, так и нескольких. Она бесплатна; срок изготовления зависит от того, кто заверяет документ. В некоторых организациях принципы ведения делопроизводства определены в локальных инструкциях. Иногда лица, имеющие право заверения, прописаны в уставе. Ими могут быть генеральный директор, руководитель подразделения, председатель правления.

Важная информация

  1. Есть ли разница между выписками из протокола собраний коммерческой или некоммерческой организации (педсовета, СНТ)? Выписки из протокола составляются унифицированным образом. Разница может заключаться в специфике самого протокола. Например, если уставом определено правило ведения подробного документирования, помимо основных разделов могут быть приведено обсуждение вопроса: реплики, особые мнения, ход голосования. На оперативных или внеплановых собраниях ведут краткий протокол, поэтому выписка может не содержать раздел «ВЫСТУПИЛИ», а только «СЛУШАЛИ» и принятое решение.
  2. Нужно ли заверять выписку у нотариуса? Практика показывает, что финансовые и государственные структуры (налоговая и ПФР) часто требуют нотариального заверения выписок по примеру протоколов. Согласно ФЗ № 14, документирование хода собрания ООО должно быть удостоверено присутствующим на нем нотариусом, если в уставе не прописан иной порядок. Обязательно заверение протокола, если решения касаются финансовых вопросов деятельности ЮЛ или смена руководства. Не каждый нотариус готов заверить выписку, если он не следил за ходом заседания. Те, кто соглашаются, требуют оригинал протокола, в котором удостоверены подписи участников. Даже если в уставе прописан договорной порядок принятия решений, при обсуждении важных вопросов рекомендуется приглашать нотариуса. В спорных ситуациях можно сослаться на устав, в котором прописано проведение собраний без юриста, и определено должностное лицо, имеющее право заверять документы.

Составляем выписку из протокола в 2021 году. Бланк и образец

Выписка из протокола представляет собой выдержку из обширного документа, в котором зафиксировано большое количество информации, относящейся к проведению того или иного собрания.

Файлы в . DOC:Бланк выписки из протоколаОбразец выписки из протокола

Назначение выписки

Любое протоколируемое совещание (заседание) или собрание – это процедура, включающая в себя множество действий, к которым могут относиться:

  1. оглашение повестки собрания;
  2. избрание президиума и секретаря;
  3. выступления участников собрания;
  4. обмены репликами и прения;
  5. назначение голосования и результаты голосования и т.д.

То есть описание процедурных действий могут занимать до половины текста протокола. Более подробно о составлении протоколов различного рода совещаний можно прочитать в материале по ссылке.

При условии, что в повестку собрания входят несколько вопросов, по каждому из которых проводится голосование и принимается решение, протокол может иметь достаточно большой объем. Поэтому при необходимости предоставления информации только по одному из нескольких вопросов, рассматривавшихся на собрании, оформляется выписка из протокола.

Если же совещание проводилось только по одному вопросу, то вместо выписки вполне можно подготовить копию.

Оформление выписки

Сама по себе выписка – это не предоставление информации. Полноценным документом выписка станет только в случае, если будет соответствующим образом оформлена.

Прежде всего, выдача выписки из протокола – это всегда ответ на просьбу о предоставлении информации. Это означает, что выписка из протокола интегрируется в текст ответа на запрос или заявление.

В рамках данной статьи вы можете скачать типовой образец выписки рассматриваемого вида. Для дальнейшего использования образца вам потребуется его индивидуализировать, внеся в отведенные для этого строки следующие сведения:

  1. ФИО или наименование и адрес лица, которому выписка направляется или выдается;
  2. если выписка оформляется не на фирменном бланке предприятия или организации, в левый верхний угол листа потребуется вписать наименование выдающей выписку организации и ее основные реквизиты;
  3. основания выдачи выписки из протокола. Указывается номер запроса (заявления) и дата его поступления;
  4. дата проведения собрания, наименование учреждения, в котором собрание проводилось, ФИО членов президиума и секретаря собрания, повестка собрания, нужная информация из протокола по теме запроса или заявления, включая решение собрания или результаты голосования;
  5. подпись руководителя предприятия.

Выписка из протокола общего собрания

Протоколы очень важная часть в любом делопроизводстве. С их помощью оформляются все важные собрания или заседания на предприятии. Но, в некоторых случаях нужна выписка из документа, по одному какому то пункту.

Основные моменты, которые понадобятся при составлении

Если возникает потребность цитировать определенную часть протокола, а весь остальной его смысл просто не нужен, делается выписка. При этом совсем не нужно предоставлять полную версию протокола, достаточно чтоб документ был правильно оформлен. Так же выписка поможет донести до масс только некоторые сведения, а основную информацию оставить за кадром.

Общее собрание

Не смотря на то, что не существует унифицированной формы оформления выписки, все же есть несколько пунктов и советов, к которым стоит прислушаться. Протокол составляется для документирования заседаний, собраний, конференций, докладов, и прочего. В зависимости от типа собрания протоколы разделяются на:

  • Полный протокол. В нем обязательно должна быть зафиксирована вся информация о ходе собрания, включая высказывания ее участников, замечания и реплики. Это более точная форма фиксации.
  • Краткие, которые составляются, если нужно зафиксировать только данные докладчиков, вопросы которые обсуждались, и окончательное решение, которое было принято. Чаще всего такой тип документа используется для фиксирования оперативок или других коротких рабочих собраний.

Чаще всего протоколы, как и выписки из них, составляются на фирменных бланках предприятия, или на альбомных листах со штампом компании. Обязательно в бумаге должна быть указана такая информация:

  1. Полное название компании или организации.
  2. Название документа, который составляется. В нашем случае это протокол или выписка из него.
  3. Порядковый номер протокола.
  4. Место, где проводилось заседание.
  5. Если необходимо ставится гриф утверждения, но это не является обязательным условием.
  6. Дата, когда проводилось собрание или оперативка.
  7. Текст документа, который разделяется на вводный и основной. В вводной части обязательно указываются данные обо всех участниках собрания, их данные и должности, которые они занимают.
  8. Подписи все участников мероприятия, которыми они подтверждают правильность и достоверность всего изложенного в документе.

В полном варианте протокол получается значительных размеров, основная часть может занимать даже несколько листов.

Если возникает потребность передать какие-либо сведения из протокола, то копировать его весь полностью не рационально, а в некоторых случаях просто недопустимо. Именно поэтому выписка является оптимальным решением проблемы.

В выписке вы можете подать сведения, которые касаются только одного конкретного явления или действия, и не давать знать о всех вопросах, которые обсуждались во время заседания.

Правовые нормы

В терминологическом стандарте «Делопроизводство и архивное дело» нет определения термину «выписка из протокола». Этот вид  документа относится к разделу архивных выписок из документов.

Но, понятие выписка из документа есть в современном словаре архивной терминологии. При этом нужно понимать, что правила и порядок оформления выписок соответствует оформительской последовательности копий документов. Но, такие данные можно назвать правильными только частично.

На самом деле выписка составляется в тех ситуациях, когда копировать весь протокол не имеет смысла, или если в документе есть конфиденциальная информация, которую нежелательно знать посторонним людям.

Документ не считается действующим, пока он не заверен документально. Обязательно должно быть:

  1. От руки написано «Верно»
  2. Полное название должности, которую занимает ответственное лицо, которое заверяет документ
  3. Личная подпись
  4. После подписи в скобках нужно ее расшифровать.
  5. Дата, когда бумага была заверена.

Если следовать всем правилам, документ будет заверен правильно, и приобретет юридическую силу.

Что представляет собой выписка, и зачем она нужна?

Выпиской из протокола называется копия части документа, которая несет основные сведения по отдельному пункту или вопросу. При составлении документа важно обозначить:

  • Вводную часть, в которой будут указаны вопросы, которые рассматривались на повестке дня.
  • Копия нужных абзацев документа, где указаны заслушанные вопросы и принятые по ним решения.
  • Реквизиты, которые являются копией тех, которые стоят на оригинале.
  • Заверительная подпись. Она обязательно должна содержать слово «верно», а далее подпись составителя с расшифровкой, его подпись, дата, когда документ был написан.

Чаще всего выписки используются для донесения нужной информации, которая была принята во время заседания, до заинтересованных субъектов.

Выписка из протокола

На деле именно с помощью таких выписок происходит контроль за процессами производства или выполнением административных решений, формируется документация организации.

После собрания руководитель, с помощью рассылки или передачи бумаг информирует своих подчиненных и ответственных лиц о принятых решениях.

По правилам, секретарь организации в течении двух дней после оформления и подписания договора, должен оформить все необходимые копии, и отправить их по почте или вручить лично ответственным лицам.

Как оформляется выписка из протокола?

Не смотря на то, что нет четко регулированного порядка составления выписки, лучше всего придерживаться такого проверенного алгоритма:

  1. Для начала нужно дать название документу. В данном случае это будет « Выписка из протокола собрания…». Обязательно правильно укажите название собрания, его дату и присутствующих на ней работников.
  2. Из основного документа следует скопировать вводную часть. При этом обязательно прописываются все реквизиты оригинала, в которые входит дата и место собрания, количество присутствующих работников.
  3. Процитируйте из протокола нужный отрывок, делать это нужно предельно внимательно, которая касается именно нужного вопроса. Так же обязательно указывается порядковый номер пункта, по которому делается выписка.
  4. Основной текст документа формируется с помощью копирования основного текста нужного пункта. Нужно скопировать только ту часть, которая касается именно того вопроса, который нужен для раскрытия темы.

Обязательно укажите такие части, как «Слушали», суть обсуждения вопроса, и пункт «Постановили».

Пример протокола общего собрания

  1. Укажите должностных лиц, которые подписались в конце протокола, тем самым заверили правильность его составления.
  2. Руководитель или секретарь должен заверить получившуюся бумагу. Для этого в конце он пишет слово «Верно», и ставит собственную подпись и дату.

Кто должен подписывать документ

В законодательстве нет такого закона, который бы заставил заверять бумагу только руководителям. Иногда их нужно оформить очень много, и вместо того чтоб решать текущие важные вопросы, директор должен заниматься бумажной работой. В некоторых случаях выписка может заверяться руководством, но в большинстве случаев это делают секретари предприятия. В конце бумаги секретарь ставит свою подпись, чем подтверждает, что документ составлен правильно, и написанное абсолютно верно. Это правило касается внутренних документов предприятия.

Что же касается документов, которые отправляются в другие организации, то они заверяются исключительно руководством. Секретарь может поставить и свою роспись, но подпись начальника должна быть обязательно. Иначе бумага не будет иметь никакой юридической силы.

В нашем материале вы подробно ознакомитесь с тем, как составить протокол общего собрания трудового коллектива.

Здесь мы подробно рассмотрим, как верно составить коллективный трудовой договор.

Что нужно делать для получения выписки из ЕГРИП? Об этом вы узнаете из нашего материала.

Кроме этого обязательно должна присутствовать печать компании. Она должна быть расположена таким образом, чтоб край захватывал подпись директора или ответственного лица, и название его должности.

В итоге можно сказать, что выписка из протокола общего собрания это документ, в котором содержится копия вводной части бумаги с необходимым вводным вопросом, которая не включает в себя повестку дня, и копия отдельного абзаца об итоговом постановлении.

В выписке могут быть ответы как на несколько вопросов сразу, так и на один из них отдельно, в зависимости от потребности.

Главная суть документа в информировании ответственных лиц организации о решениях, которые были приняты на собраниях. Так же выписки из документов могут отсылаться в заинтересованные организации для того чтоб наладить сотрудничество.

Как составить выписку из протокола собрания образец

Протоколы очень важная часть в любом делопроизводстве. С их помощью оформляются все важные собрания или заседания на предприятии. Но, в некоторых случаях нужна выписка из документа, по одному какому то пункту.

Основные моменты, которые понадобятся при составлении

Если возникает потребность цитировать определенную часть протокола, а весь остальной его смысл просто не нужен, делается выписка. При этом совсем не нужно предоставлять полную версию протокола, достаточно чтоб документ был правильно оформлен. Так же выписка поможет донести до масс только некоторые сведения, а основную информацию оставить за кадром.

Не смотря на то, что не существует унифицированной формы оформления выписки, все же есть несколько пунктов и советов, к которым стоит прислушаться. Протокол составляется для документирования заседаний, собраний, конференций, докладов, и прочего. В зависимости от типа собрания протоколы разделяются на:

  • Полный протокол. В нем обязательно должна быть зафиксирована вся информация о ходе собрания, включая высказывания ее участников, замечания и реплики. Это более точная форма фиксации.
  • Краткие, которые составляются, если нужно зафиксировать только данные докладчиков, вопросы которые обсуждались, и окончательное решение, которое было принято. Чаще всего такой тип документа используется для фиксирования оперативок или других коротких рабочих собраний.

Чаще всего протоколы, как и выписки из них, составляются на фирменных бланках предприятия, или на альбомных листах со штампом компании. Обязательно в бумаге должна быть указана такая информация:

  1. Полное название компании или организации.
  2. Название документа, который составляется. В нашем случае это протокол или выписка из него.
  3. Порядковый номер протокола.
  4. Место, где проводилось заседание.
  5. Если необходимо ставится гриф утверждения, но это не является обязательным условием.
  6. Дата, когда проводилось собрание или оперативка.
  7. Текст документа, который разделяется на вводный и основной. В вводной части обязательно указываются данные обо всех участниках собрания, их данные и должности, которые они занимают.
  8. Подписи все участников мероприятия, которыми они подтверждают правильность и достоверность всего изложенного в документе.

В полном варианте протокол получается значительных размеров, основная часть может занимать даже несколько листов.

В выписке вы можете подать сведения, которые касаются только одного конкретного явления или действия, и не давать знать о всех вопросах, которые обсуждались во время заседания.

Правовые нормы

В терминологическом стандарте «Делопроизводство и архивное дело» нет определения термину «выписка из протокола». Этот вид документа относится к разделу архивных выписок из документов.

Но, понятие выписка из документа есть в современном словаре архивной терминологии. При этом нужно понимать, что правила и порядок оформления выписок соответствует оформительской последовательности копий документов. Но, такие данные можно назвать правильными только частично.

На самом деле выписка составляется в тех ситуациях, когда копировать весь протокол не имеет смысла, или если в документе есть конфиденциальная информация, которую нежелательно знать посторонним людям.

Документ не считается действующим, пока он не заверен документально. Обязательно должно быть:

  1. От руки написано «Верно»
  2. Полное название должности, которую занимает ответственное лицо, которое заверяет документ
  3. Личная подпись
  4. После подписи в скобках нужно ее расшифровать.
  5. Дата, когда бумага была заверена.

Если следовать всем правилам, документ будет заверен правильно, и приобретет юридическую силу.

Что представляет собой выписка, и зачем она нужна?

Выпиской из протокола называется копия части документа, которая несет основные сведения по отдельному пункту или вопросу. При составлении документа важно обозначить:

  • Вводную часть, в которой будут указаны вопросы, которые рассматривались на повестке дня.
  • Копия нужных абзацев документа, где указаны заслушанные вопросы и принятые по ним решения.
  • Реквизиты, которые являются копией тех, которые стоят на оригинале.
  • Заверительная подпись. Она обязательно должна содержать слово «верно», а далее подпись составителя с расшифровкой, его подпись, дата, когда документ был написан.

Чаще всего выписки используются для донесения нужной информации, которая была принята во время заседания, до заинтересованных субъектов.

Выписка из протокола

На деле именно с помощью таких выписок происходит контроль за процессами производства или выполнением административных решений, формируется документация организации.

По правилам, секретарь организации в течении двух дней после оформления и подписания договора, должен оформить все необходимые копии, и отправить их по почте или вручить лично ответственным лицам.

Как оформляется выписка из протокола?

Не смотря на то, что нет четко регулированного порядка составления выписки, лучше всего придерживаться такого проверенного алгоритма:

  1. Для начала нужно дать название документу. В данном случае это будет « Выписка из протокола собрания…». Обязательно правильно укажите название собрания, его дату и присутствующих на ней работников.
  2. Из основного документа следует скопировать вводную часть. При этом обязательно прописываются все реквизиты оригинала, в которые входит дата и место собрания, количество присутствующих работников.
  3. Процитируйте из протокола нужный отрывок, делать это нужно предельно внимательно, которая касается именно нужного вопроса. Так же обязательно указывается порядковый номер пункта, по которому делается выписка.
  4. Основной текст документа формируется с помощью копирования основного текста нужного пункта. Нужно скопировать только ту часть, которая касается именно того вопроса, который нужен для раскрытия темы.

Обязательно укажите такие части, как «Слушали», суть обсуждения вопроса, и пункт «Постановили».

Пример протокола общего собрания

  1. Укажите должностных лиц, которые подписались в конце протокола, тем самым заверили правильность его составления.
  2. Руководитель или секретарь должен заверить получившуюся бумагу. Для этого в конце он пишет слово «Верно», и ставит собственную подпись и дату.

Кто должен подписывать документ

В законодательстве нет такого закона, который бы заставил заверять бумагу только руководителям. Иногда их нужно оформить очень много, и вместо того чтоб решать текущие важные вопросы, директор должен заниматься бумажной работой. В некоторых случаях выписка может заверяться руководством, но в большинстве случаев это делают секретари предприятия. В конце бумаги секретарь ставит свою подпись, чем подтверждает, что документ составлен правильно, и написанное абсолютно верно. Это правило касается внутренних документов предприятия.

Что же касается документов, которые отправляются в другие организации, то они заверяются исключительно руководством. Секретарь может поставить и свою роспись, но подпись начальника должна быть обязательно. Иначе бумага не будет иметь никакой юридической силы.

В нашем материале вы подробно ознакомитесь с тем, как составить протокол общего собрания трудового коллектива.

Здесь мы подробно рассмотрим, как верно составить коллективный трудовой договор.

Что нужно делать для получения выписки из ЕГРИП? Об этом вы узнаете из нашего материала.

Кроме этого обязательно должна присутствовать печать компании. Она должна быть расположена таким образом, чтоб край захватывал подпись директора или ответственного лица, и название его должности.

В итоге можно сказать, что выписка из протокола общего собрания это документ, в котором содержится копия вводной части бумаги с необходимым вводным вопросом, которая не включает в себя повестку дня, и копия отдельного абзаца об итоговом постановлении.

В выписке могут быть ответы как на несколько вопросов сразу, так и на один из них отдельно, в зависимости от потребности.

Остались вопросы? Узнайте, как решить именно Вашу проблему — позвоните прямо сейчас:

+7 (499) 577-03-71
(Москва)

+7 (812) 425-60-36
(Санкт-Петербург)

8 (800) 350-23-69 доб 680
Для всех регионов!

Это быстро и бесплатно!

Главная суть документа в информировании ответственных лиц организации о решениях, которые были приняты на собраниях. Так же выписки из документов могут отсылаться в заинтересованные организации для того чтоб наладить сотрудничество.

Что такое протокол мероприятия

Протокол — это официальный документ, который ведется в письменном виде в ходе общего собрания людей, объединенных одним делом или проблемой. Общий сбор может быть у жильцов одного дома, акционеров или работников предприятия, а записывать результаты события сейчас требуют даже на родительских собраниях в школах. В резолюции отражают ход событий, перечень затрагиваемых вопросов и обсуждений, очередность выступлений и их основные тезисы, а также принятые решения.

Поскольку выписка из протокола общего собрания, образец которой представлен в статье, — это частичная копия стенограммы мероприятия, в которой содержатся краткие сведения и итог рассмотрения конкретного вопроса, в ней нужно указать полное наименование организации (юридического лица), дату проведения сбора, и сформулировать вопрос, который является основной темой фрагмента. При необходимости могут полностью копироваться абзацы текста, в которых приводятся принятые по вопросу решения. В юридических лицах такая форма документации используется для донесения новой информации. По сути она является основанием для изменений в производственных процессах организации и уточнения частностей. В этом случае делопроизводитель компании оформляет необходимое число копий и передает ответственным за исполнение лицам. Эти же копии впоследствии будут основным документом для контроля за исполнением принятых решений.

В отношении физических лиц фрагменты из документов, касающихся прав и законных интересов граждан, выдаются по их требованию, в порядке, установленном актуальным на сегодняшний день Указом Президиума ВС СССР от 04.08.1983 № 9779-X (ред. от 08.12.2003) «О порядке выдачи и свидетельствования предприятиями, учреждениями и организациями копий документов, касающихся прав граждан».

В каких случаях нужна

Чаще всего фрагменты резолюций требуются:

  • для предоставления в финансовые организации;
  • для ФНС или иных контролирующих органов;
  • для предоставления информации участникам общества в части, их касающейся;
  • при обращении заинтересованных лиц по вопросам, которые были рассмотрены.

Как написать выписку из протокола собрания

Составлением подобной документации занимается секретарь организации или сотрудник, ответственный за делопроизводство. Единого регламентированного порядка составления этого документа не разработано. Существуют лишь общепринятые правила оформления:

  • начинаться она должна со слов «Выписка из протокола общего собрания. »;
  • в вводной части текста указывают количество участников события и основные реквизиты протокола;
  • указывается не только суть вопроса, но и его номер (пункт), под которым он фигурирует в основном документе;
  • составитель — тот, кто подписывает выписку из протокола общего собрания, после текста пишет фразу «Выписка верна», расшифровывает свою подпись, должность и также указывает дату составления;
  • подпись составителя и верификация дополняются печатью организации.

В документах для внутреннего пользования заверить документ может секретарь, а вот копия для внешних организаций заверяется обязательно руководством.

Копии выписок имеют разный срок хранения. В зависимости от важности затронутых во время заседания вопросов, они могут храниться от 5 до 75 лет (пункты 415 и 656 перечня, утвержденного Приказом Минкультуры России от 25.08.2010 № 558).

Выписка из протокола заседания комиссии – документ, который может потребоваться в самых разных случаях.

Что такое протокол заседания комиссии

На предприятиях и в организациях работа всевозможных комиссий не такое уж и редкое явление. Обычно в состав комиссий включается несколько сотрудников компании, которые профессионально решают поставленные перед ними задачи. Комиссии бывают учредительные, аттестационные, приемочные, инвентаризационные, они собираются по поводу конференций, семинаров и т.д. При этом работа любой комиссии обязательно фиксируется в специальном протоколе. В него заносятся сведения о том, кто входит в комиссию, какие цели перед участниками были поставлены, каким образом они были достигнуты и решение комиссии.

Виды протоколов

Протоколы условно можно поделить на два типа. К первому относятся краткие протоколы – они обычно применяются для регистрации работы комиссий, созванных в оперативном порядке, в том числе и незапланированных заранее. В них вносится только та информация, которая касается обсуждаемых вопросов, мнения участников и общего решения. А вот в полных протоколах сведения более объемны. В них вписываются не только основные данные, но и вся процедура заседания, включая подробное обсуждение, реплики, мнения, ход голосования, итоги. На таких заседаниях с полным протоколом всегда есть председатель, который им руководит и секретарь, который во всех деталях фиксирует происходящее. Иногда полный протокол может достигать нескольких страниц.

Зачем делать выписку

Зачастую информация, содержащаяся в протоколах, отражает секретные моменты текущей деятельности фирмы и не предназначена для широкой аудитории. Выписка помогает решить эту проблему.

С ее помощью заинтересованные лица получают нужные им данные, а конфиденциальность протокола сохраняется. Также выписка целесообразна при чрезмерно большом объеме протокола. Как правило, речь в выписке идет только о каком-то конкретном принятом решении.

Если говорить о практике, которая имеет широчайшее распространение, то выписки из протоколов заседаний помогают руководству компаний осуществлять деятельность по организации работы своих предприятий, контролировать работу производств, регулировать выполнение распоряжений, приказов (иногда выписки даже являются своего рода их заменителем) и т.д.

При помощи выписок государственные надзорные ведомства, контрагенты, банковские кредитные учреждения своевременно информируются о деятельности фирмы.

Чем отличаются выписка и копия

Некоторые работники организаций ошибочно полагают, что копия и выписка – это одно и то же. Это не совсем так. Между ними есть принципиальное отличие: копия – это абсолютно идентичный оригиналу документ, который делается обычно при помощи копировальной техники. Выписка же – это только некоторая часть оригинала и достаточно часто формируется она от руки (когда из документа берутся только те куски текста, которые требуются в каком-то конкретном случае).

Кто делает выписку

Выписку обычно делает сотрудник предприятия, в чьем ведении находится работа с протоколами, в том числе по их сохранению (это может быть секретарь, юрист или сам руководитель организации).

При этом выписка обязательно должна быть заверена уполномоченным на этом работником компании. Также на выписке должна стоять печать (если компания применяет штампы для визирования бумаг).

Как получить выписку

Чтобы получить требуемую выписку от заинтересованного лица, должен поступить соответствующий запрос или заявление в письменном виде с обозначением причин, по которым ему нужен данный документ и указанием учреждения, для предоставления в которое он понадобился.

Образец выписки из протокола заседания комиссии

При необходимости сделать выписку, посмотрите ее пример – с его помощью вы без труда сделаете то, что вам нужно.

  1. В начале документа обязательно напишите наименование организации, также укажите состав комиссии, отметьте повестку дня.
  2. Далее выпишите те данные из хода заседания, которые касаются заинтересованного лица и обязательно – решение комиссии.
  3. После этого, в конце документа поставьте надпись «Верно» или «Выписка верна», подпишите и датируйте бланк.

Образец оформления выписки из протокола заседания кафедры

 

БАШКИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ (филиал) УралГУФК

Кафедра теории и методики зрелищных видов спорта и восточных единоборств

ВЫПИСКА ИЗ ПРОТОКОЛА ЗАСЕДАНИЯ КАФЕДРЫ ТЕОРИИ И МЕТОДИКИ ЗРЕЛИЩНЫХ ВИДОВ СПОРТА, И ВОСТОЧНЫХ ЕДИНОБОРСТВ ОТ 15.01.2012. N7

 

ПРИСУСТВОВАЛИ: зав. каф. ТиМ ЗВС и восточных ед-в, к.п.н., доцент А.С. Мавлеткулова, доцент кафедры, к.п.н. В.А. Абрамов, доцент кафедры, к.б.н. Л.Р. Шафикова, ст. преподаватель каф. Е.Р. Муфтиева, ст. преподаватель каф. М.В. Тарасова, преподаватель каф. А.В. Абдуллина, преподаватель каф. А.Х. Гайсина, преподаватель каф. О.М. Тимербаев.

СЛУШАЛИ: Тарасову М.В., которая представила на обсуждение учебное пособие «Шейпинг» для студентов 1 курса очного и 5 курса заочного обучения, обучающихся по специальности 032102 «Физическая культура для лиц с отклонениями в состоянии здоровья».

ВЫСТУПИЛИ: Мавлеткулова А.С. зав. каф. ТиМ ЗВС и восточных ед-в, к.п.н., доцент.

  • Каким образом в учебном пособии отражена специфика занятий для лиц с отклонениями в состоянии здоровья?

Шафикова Л.Р. к.б.н., доцент.

  • Присутствуют ли в учебном пособии вопросы для самоконтроля?

Заслушали вопросы по содержанию пособия, получили четкие ответы.

РЕШИЛИ:

  1. Учебное пособие рекомендовано для студентов 1 курса очного и 5 курса заочного обучений по специальности 032102 «Физическая культура для лиц с отклонениями в состоянии здоровья. (читательский адрес).
  1. Учебное пособие соответствует программе дисциплин «шейпинг».

ПОСТАНОВИЛИ: Ходатайствовать перед Экспертным советом о рассмотрении учебного пособия Тарасовой М.В. и утверждении его к печати.

  

Зав. каф. Т и М ЗВС и вост.ед-в: к.п.н., доцент

А.С. Мавлеткулова

Секретарь

Е.Г. Огуречникова

Extract Protocol Refactoring (Swift) - Повышение общего поведения

Extract Protocol позволяет нам обобщать наши типы.

Контекст: у вас есть класс (или другой объект), и в некоторых случаях вы хотите, чтобы его место занял другой класс.

Другой класс можно сделать подклассом. Но это очень тесно связывает два класса. Кроме того, если есть только несколько общих методов, может даже не иметь смысла быть подклассом.

Или вы можете ввести протокол, который будут реализовывать оба класса.Протокол определяет методы (и, возможно, свойства), которые должен реализовывать тип.

Механика

(Описание «Extract Protocol» основано на подходе, аналогичном «Extract Interface», описанному Мартином Фаулером в Refactoring . )

  1. Создать пустой протокол:
 протокол P {} 

или, если вы хотите ограничить его реализациями классов (в отличие от структур или перечислений):

 протокол P: AnyObject {} 

Можно запускать тесты, но проблем быть не должно.

  1. Орудие марки A P:
 класс A: P {…} 

или (если у него уже есть родители):

 класс A: существующие протоколы родительского или родительского контроля, P {…} 

Вы можете запускать тесты; проблем быть не должно.

  1. Скопируйте все необходимые переменные из класса в протокол
 var v: Введите {get set} 

и методы

 функция f (аргументы) -> ReturnType 

Вы можете запускать тесты после перемещения любого из них.

  1. Преобразование использования A в тип P.

Пример:

 func f (что-то: A)
     =>
func f (что-то: P) 

Вы можете запускать тесты после перевода любого клиента на новый протокол.

  • Одновременно можно работать с одним участником вызова. Если вы получили какие-либо предупреждения об отсутствующих (полях или) методах, вернитесь к шагу 3 и добавьте недостающее объявление в протокол.
  • У вас могут быть некоторые клиентские сайты, которым все еще нужно сохранить тип A, но внимательно подумайте, может ли протокол что-то упустить.
  1. Запустите тесты и убедитесь, что все в порядке.

Этот рефакторинг «опирается на компилятор», чтобы сообщить вам, пропустили ли вы что-нибудь в интерфейсе вашего протокола.

Пример

SortedTable - это двумерный массив, который можно сортировать. (Обрезано из более крупного примера.)

  class SortedTable {
    init ([[Строка]]) {…}
    func rows () -> Int {…}
    func columns () -> Int {…}
    подстрочный индекс (r: Int, c: Int) -> String {…}
    func sort () {…}
}  

Нам нужны новые версии этого класса, например.g., тот, который читает из базы данных, или тот, который обертывает этот класс дополнительными функциями.

  1. Создать пустой протокол
 протокол SortableTable {} 
  1. Заставьте класс реализовать это.
 class SortedTable: SortableTable {
    // отдыхаем как раньше
} 

3. Скопируйте определения методов из класса в протокол:

Протокол
 SortableTable {
    func rows () -> Int
    func columns () -> Int
    функция сортировки ()
} 

Мы «случайно» опустили нижний индекс.

4. Поменяйте местами, которые относятся к классу, чтобы вместо этого использовать протокол:

 var model = SortedTable (array2d)
    =>
модель var: SortableTable = SortedTable (array2d) 

Мы видим синтаксическую ошибку ниже:

Модель
 [r, c] <---- нет такого метода 

Вернитесь к шагу 3 и добавьте индекс в протокол.

 протокол SortingTable {
    . . .
    подстрочный индекс (r: Int, c: Int) -> String
} 

Теперь все работает и работает правильно.Если у вас есть новый класс, поддерживающий этот интерфейс, вы можете добавить его, не меняя ничего, кроме вызова конструктора.

KAPA Express Extract Kit: часто задаваемые вопросы

Каковы основные области оптимизации?
Наборы KAPA Express Extract Kits были тщательно протестированы для выделения ДНК из широкого спектра типов образцов. В зависимости от типа образца могут присутствовать различные повреждающие ДНК агенты и / или ингибиторы, которые могут влиять как на процесс экстракции, так и на последующую ПЦР.Первоначально оптимизируйте протокол ПЦР, используя следующие рекомендации, а затем повторите экстракцию ДНК.

  • Оптимизация ПЦР:
    • KAPA2G Robust HotStart ReadyMix или KAPA2G Robust DNA Polymerase Kits рекомендуются для последующей ПЦР с использованием экстракта KAPA Express. Надежная ДНК-полимераза KAPA2G была разработана специально для улучшения процессивности и устойчивости к обычным ингибиторам ПЦР. Надежность надежной ДНК-полимеразы KAPA2G особенно полезна для увеличения показателей успешности ПЦР для неочищенных экстрактов с использованием экстракта KAPA Express.
    • Некоторые неочищенные экстракты ДНК могут содержать высокие концентрации ингибиторов ПЦР. Если использование надежной ДНК-полимеразы KAPA2G не дает приемлемых результатов, может потребоваться разбавить экстракт ДНК перед ПЦР. Повторите эксперимент с образцом положительного контроля (например, геномная ДНК, очищенная с использованием набора на основе колонки) и серией 10-кратных разведений экстракта ДНК (приготовленного в ТЕ или 10 мМ трис-HCl, pH 8,0-8,5). В экстракты ДНК также можно добавить известную концентрацию образца положительного контроля, чтобы определить, можно ли разбавить ингибиторы, сохраняя при этом достаточно высокую концентрацию матрицы для поддержки амплификации мишени.
    • Уменьшите температуру отжига на 2–5 ° C и / или увеличьте время отжига или удлинения.
    • Неспецифические продукты, димеры праймеров и / или смазывание могут возникать в результате РНК или деградированной ДНК, происходящей из-за присутствия ингибиторов в образце. Модификации протокола цикла ПЦР (например, увеличение температуры отжига, сокращение времени отжига и / или удлинения) и использование ДНК-полимеразы HotStart могут снизить неспецифическую амплификацию.
    • ДНК
    • , выделенная из сложных типов образцов, может быть дополнительно очищена с использованием осаждения изопропанолом или этанолом для удаления ингибиторов.
  • Оптимизация экстракции ДНК:
    • Стадия лизиса при 75 ° C может варьироваться от 10 до 30 минут. Используйте более длительное время инкубации при 75 ° C, чтобы максимально увеличить выход ДНК (например, для тканей крысы и собаки требуется инкубация в течение 15-20 минут).
    • Для некоторых типов образцов (например, рыбы) снижение температуры стадии лизиса с 75 ° C до 60 ° C повышает эффективность экстракции. Температуру лизиса можно оптимизировать, выполнив температурный градиент от 55 ° C до 75 ° C в течение 10 минут с последующей инкубацией при 95 ° C в течение 5 минут.
    • Тепловая инактивация фермента экстракта KAPA Express в течение не менее 5 минут при 95 ° C имеет важное значение, поскольку переносимый фермент разрушает ДНК-полимеразу во время ПЦР.
    • Добавление некоторых типов образцов может снизить pH ниже 7. ДНК быстро разлагается в средах с низким pH, особенно при повышенных температурах во время протокола лизиса. Проверьте pH экстрагированной ДНК после завершения протокола лизиса с помощью pH-бумаги. Если pH <7,5, используйте буфер экстракта KAPA Express с конечной концентрацией 1.5 - 2Х. В качестве альтернативы к начальной реакции экстракции можно добавить меньшее количество образца.
    • Обычно экстракты ДНК не требуют количественной оценки перед использованием в ПЦР, и количественная оценка не рекомендуется, однако можно использовать NanoDrop или аналог, чтобы получить указание на количество загрязняющих факторов.

Требуется ли центрифугирование перед ПЦР?
В зависимости от типа образца можно пропустить этап центрифугирования после реакции экстракции.Надежная ДНК-полимераза KAPA2G рекомендуется для последующей ПЦР, поскольку остатки пробы и ингибиторы будут присутствовать в более высоких концентрациях и почти всегда будут давать ненадежные результаты, если используются другие ДНК-полимеразы, такие как Taq дикого типа. Осаждение мусора приведет к более надежной ПЦР. Очень важно осаждать кровь перед использованием в последующих применениях.

Можно ли использовать ДНК, экстрагированную с помощью набора KAPA Express Extract Kit, непосредственно в кПЦР?
ДНК, экстрагированную с помощью наборов KAPA Express Extract Kits, можно использовать непосредственно в КПЦР, однако существуют ограничения.Основные ограничения включают: гашение флуорофора переносящимися ингибиторами (например, кровью), как хорошо известно, гасит флуоресценцию SYBR ® ; ингибирование реакции КПЦР; и / или низкие концентрации ДНК из протокола экстракции.

Рекомендации по использованию KAPA Express Extract с последующим qPCR включают:

  • Выполните серийное разведение экстрагированной ДНК с ТЕ или 10 мМ Трис pH 8,0. Это разбавит любые потенциальные ингибиторы, уменьшив ингибирование ПЦР и гашение флуорофора.Вероятно, что некоторое тушение останется, а концентрация ДНК, вероятно, будет недооценена.
  • Тушение флуорофора зависит от используемого типа, попробуйте использовать другой флуорофор. ДНК-полимераза KAPA SYBR была разработана для оптимальной работы в строгих условиях реакции qPCR в реальном времени, и она снижает ингибирование красителя SYBR Green I, и, следовательно, можно использовать повышенные концентрации SYBR Green I.
  • В экстракты ДНК также можно «добавить» известную концентрацию образца положительного контроля, чтобы определить, можно ли разбавить ингибиторы.В идеале серийное разведение готовят из образца экстракта KAPA Express и ту же ДНК, используемую в одной концентрации стандартной кривой, добавляемой ко всем серийным разведениям. Это даст четкое определение ингибиторов (все более отложенная оценка Ct при серийных разведениях) или отсутствие ДНК в экстрагированном образце (та же оценка Ct, что и стандарт, даже с неразбавленным образцом).
  • Попробуйте разные протоколы лизиса (см. Рекомендации выше), чтобы максимизировать выход ДНК.

Каковы рекомендации по хранению набора KAPA Express Extract Kit?
После получения храните весь набор при -20 ° C в морозильной камере с постоянной температурой.При хранении в этих условиях и правильном обращении все компоненты набора сохранят полную активность в течение как минимум шести месяцев с даты получения или до даты истечения срока годности, указанной на наборе. KAPA Express Extract Buffer и фермент можно хранить при 4 ° C для регулярного краткосрочного использования (до одной недели). При условии аккуратного обращения и отсутствия контаминации, компоненты набора не будут повреждены, если их оставить (непреднамеренно) при комнатной температуре на короткие периоды времени (до 24 часов).Не рекомендуется длительное хранение при комнатной температуре или 4 ° C. Обратите внимание, что реагенты, хранящиеся при температуре выше -20 ° C, более подвержены разложению при загрязнении пользователем; поэтому хранение при таких температурах осуществляется пользователем на свой страх и риск.

Как долго можно хранить извлеченную ДНК?
ДНК, экстрагированная с помощью набора KAPA Express Extract Kit, со временем разлагается в буфере для экстракции 1X Express, а присутствие переносимых ингибиторов может ускорить процесс разложения. Обычно ДНК, выделенная из «чистых» образцов, таких как буккальные мазки и волосяные фолликулы, стабильна при 4 ° C или -20 ° C в течение нескольких недель после экстракции, но это может быть сокращено до нескольких дней в зависимости от типа образца.Для длительного хранения рекомендуется разведение экстракта ДНК в буфере TE 1: 5. Это делается для того, чтобы ДНК хранилась в стабильной буферной среде. Фактор разведения может варьироваться от 1: 1 до 1:20, в зависимости от последующего применения и выхода ДНК. Для последующих применений, чувствительных к ЭДТА, TE можно заменить 10 мМ трис-HCl, pH 8,0 - 8,5. Экстракты ДНК, хранящиеся таким образом, обычно стабильны не менее шести месяцев. Для более длительного хранения (особенно из образцов с высокой концентрацией ингибиторов переноса) рекомендуется дальнейшая очистка ДНК с использованием осаждения изопропанолом или этанолом для полного удаления ингибиторов.

Могу ли я использовать полимеразу Taq других производителей с ДНК, экстрагированной с помощью набора KAPA Express Extract Kit?
Полимераза Taq дикого типа будет работать с ДНК, выделенной из «чистых» типов образцов (например, буккальных мазков, волосяных фолликулов), но будет ненадежной при амплификации более сложных образцов и шаблонов. Для достижения максимальной эффективности амплификации рекомендуется использовать KAPA2G Robust HotStart ReadyMix для всех типов образцов.

Можно ли использовать ДНК, выделенную с помощью набора KAPA Express Extract Kit, с другими продуктами Kapa Biosystems?
Наборы ДНК-полимеразы KAPA Taq, быстрой ДНК-полимеразы KAPA2G, ДНК-полимеразы KAPA HiFi и KAPA SYBR FAST qPCR были успешно использованы с ДНК, экстрагированной с помощью экстракта KAPA Express для амплификации ряда ампликонов.Надежная ДНК-полимераза KAPA2G рекомендуется для повседневного использования с ДНК, экстрагированной с помощью экстракта KAPA Express из-за улучшенных характеристик в присутствии ингибиторов переноса.

Требуется ли по-прежнему промывка ксилолом при работе с тканью FFPE?
При использовании набора KAPA Express Extract Kit этап промывки ксилолом не требуется. После стадии центрифугирования слой воска обычно находится поверх буфера или сбоку. Супернатант содержит ДНК и извлекается путем прокалывания через слой воска наверху.Рекомендуется обрезать излишки воска вокруг образца стерильным скальпелем, чтобы оставалась только ткань. Избыток парафина не повлияет на процесс экстракции, но затруднит восстановление ДНК.

Можно ли использовать набор KAPA Express Extract Kit для экстракции РНК?
Процесс экстракции оптимизирован для ДНК. РНК будет химически разлагаться во время протокола нагревания, поэтому экстракция РНК не рекомендуется с помощью набора KAPA Express Extract Kit.

Руководство по подготовке проб для ELISA | Abcam

Методы подготовки образцов

Надосадочная жидкость клеточной культуры

  • Перенесите среду для культивирования клеток в центрифужную пробирку и центрифугируйте при 1500 об / мин в течение 10 минут при 4 ° C.
  • Немедленно выполните аликвотирование супернатанта и храните образцы при -80 ° C. Сведите к минимуму циклы замораживания / оттаивания.

Экстракт клеток

  • Поместите планшеты с культурой ткани на лед.
  • Аспирируйте среду и осторожно промойте клетки один раз ледяным PBS.
  • Аспирируйте PBS и добавьте 0,5 мл буфера для полной экстракции на 100-миллиметровую пластину.
  • Соскребите клетки на наклонной пластине и перенесите в предварительно охлажденную пробирку.
  • Кратковременно перемешайте на вортексе и инкубируйте на льду в течение 15-30 мин.
  • Центрифуга при 13000 об / мин в течение 10 минут при 4 ° C для осаждения нерастворимого содержимого.
  • Аликвотирование супернатанта (это растворимый клеточный экстракт) для очистки охлажденных пробирок на льду и хранения образцов при -80 ° C. Сведите к минимуму циклы замораживания / оттаивания.

Кондиционированная среда

  • Поместите клетки в полную (содержащую сыворотку) питательную среду и дайте клеткам пролиферировать до желаемого уровня слияния.
  • Удалите питательную среду и очень осторожно промойте несколькими мл теплого PBS.Повторите этап стирки.
  • Удалите последнюю промывку PBS и осторожно добавьте среду для роста, не содержащую сыворотки.
  • Инкубировать 1-2 дня.
  • Перенесите среду в центрифужную пробирку и центрифугируйте при 1500 об / мин в течение 10 минут при 4 ° C.
  • Немедленно выполните аликвотирование супернатанта и храните образцы при -80 ° C. Сведите к минимуму циклы замораживания / оттаивания.

Молоко

  • Соберите образцы и центрифугируйте при 10000 x g в течение 2 минут при 4 ° C.
  • Отберите аликвоты супернатанта и храните образцы при -80 ° C.Сведите к минимуму циклы замораживания / оттаивания.


Плазма

  • Соберите цельную кровь в пробирки, содержащие антикоагулянт, например пробирки для коагуляции BD Vacutainer (№ по каталогу: 363080/363080), или добавьте 0,1 М цитрата натрия до 1/10 конечного объема.
  • Центрифуга при 3000 об / мин в течение 10 минут при 4 ° C.
  • Немедленно произведите аликвотирование супернатанта (плазмы) и храните образцы при -80 ° C. Сведите к минимуму циклы замораживания / оттаивания.

Моча

  • Соберите образцы и центрифугируйте при 10000 x g в течение 2 минут при 4 ° C.
  • Отберите аликвоты супернатанта и храните образцы при -80 ° C. Сведите к минимуму циклы замораживания / оттаивания.


Слюна

  • Соберите образцы и центрифугируйте при 10000 x g в течение 2 минут при 4 ° C.
  • Отберите аликвоты супернатанта и храните образцы при -80 ° C. Сведите к минимуму циклы замораживания / оттаивания.


Сыворотка

  • Соберите цельную кровь в необработанную пробирку или, например, пробирку без антикоагулянта, такую ​​как пробирки BD Vacutainer Serum (№ по каталогу: 367812).
  • Инкубируйте в покое при комнатной температуре в течение 20 мин.
  • Центрифуга при 3000 об / мин в течение 10 минут при 4 ° C.
  • Немедленно произведите аликвотирование супернатанта (сыворотки) и храните образцы при -80 ° C. Сведите к минимуму циклы замораживания / оттаивания.


Экстракт ткани

  • Рассеките интересующую ткань чистыми инструментами, желательно на льду и как можно быстрее, чтобы предотвратить разложение протеазами.
  • Поместите ткань в микроцентрифужные пробирки с круглым дном и погрузите в жидкий азот до «быстрого замораживания».Храните образцы при -80 ° C для дальнейшего использования или на льду для немедленной гомогенизации.
  • Для кусочка ткани размером ~ 5 мг добавьте в пробирку ~ 300 мкл буфера для полной экстракции (см. Рецепт буфера для экстракции клеток / тканей) и гомогенизируйте с помощью электрического гомогенизатора.
  • Промойте лезвие дважды, используя 300 мкл буфера для полной экстракции для каждого полоскания, затем поддерживайте постоянное перемешивание в течение 2 часов при 4 ° C (например, поместите на орбитальный шейкер в холодную комнату).
  • Центрифуга в течение 20 минут при 13000 об / мин при 4 ° C.Поместите на лед, аликвотируйте супернатант (это экстракт растворимого белка) в свежую охлажденную пробирку и храните образцы при -80 ° C. Сведите к минимуму циклы замораживания / оттаивания.


Объемы буфера для лизиса должны определяться в зависимости от количества присутствующей ткани. Типичная концентрация конечного белкового экстракта составляет> 1 мг / мл.


Рецепт буфера для экстракции клеток / тканей

  • 100 мМ Трис, pH 7,4
  • 150 мМ NaCl
  • 1 мМ EGTA
  • 1 мМ EDTA
  • 1% Triton X-100
  • 0.5% дезоксихолат натрия

Дополнительные реагенты, необходимые для получения полного экстракционного буфера .

  • Коктейль ингибиторов фосфатазы
  • Коктейль ингибиторов протеазы
  • PMSF


Добавьте в буфер для экстракции клеток коктейли ингибиторов фосфатазы и протеазы, как описано производителем, и PMSF до 1 мМ, непосредственно перед использованием.



Общие рекомендации
  • Рекомендуемая концентрация белкового экстракта составляет не менее 1-2 мг / мл.
  • Обычно экстракты сыворотки, плазмы, клеток и тканей разбавляют на 50% связывающим буфером.
  • Перед использованием после размораживания центрифугируйте образцы при 10 000 об / мин в течение 5 минут при 4 ° C, чтобы удалить осадок.


Дополнительные ресурсы ELISA.

Руководство по ИФА

>> Следующая страница: Контрольные образцы, необходимые для ИФА.

<< Предыдущая страница: Выберите правильный набор для ИФА.

Загрузить полное руководство

Добыча | Протокол

Добыча

Экстракция - это распространенный метод, используемый в органической химии для выделения целевого соединения.В процессе экстракции растворенное вещество переносится из одной фазы в другую, чтобы отделить его от непрореагировавших исходных материалов или примесей. Экстракция также используется для облегчения выделения растворенного вещества из реакционного растворителя, который трудно удалить испарением, такого как растворитель с высокой температурой кипения. Как правило, существует три типа экстракции. Во-первых, при экстракции твердое вещество-жидкость растворенное вещество переходит из твердой фазы в жидкую. При экстракции жидкость-жидкость растворенное вещество переносится из одной жидкости в другую.При кислотно-щелочной экстракции растворенное вещество превращается в ионное соединение и переносится из органической фазы в водную фазу. Типичный пример экстракции - заваривание кофе или чая. Твердая фаза, содержащая кофеин, ароматизаторы растений и запахи, превращается горячей водой в жидкую фазу.

Жидкостно-жидкостная экстракция

Экстракция жидкость-жидкость либо переносит органическое соединение, растворенное в водной фазе, в органический растворитель, либо его используют для переноса непрореагировавших реагентов, солей и других водорастворимых примесей в водную фазу, оставляя при этом органическое соединение интерес к органической фазе.Несмешивающиеся жидкости - это жидкости, которые никогда не образуют гомогенного раствора, даже при тщательном перемешивании. Вместо этого несмешивающиеся жидкости разделяются на разные фазы, такие как масло и вода.

При экстракции жидкость-жидкость органическое соединение, растворенное в водной фазе, переносится в органический растворитель. Для проведения жидкостно-жидкостной экстракции сначала водный раствор, содержащий растворенное вещество, добавляется в делительную воронку. Затем в делительную воронку добавляют нерастворимый в воде органический растворитель.Когда содержимое воронки хорошо перемешано, органическое соединение распадается на органическую фазу из-за его более высокой растворимости в органической фазе, чем в водной фазе.

Поскольку два растворителя не смешиваются, две жидкости образуют дискретные слои с плотной жидкостью внизу и менее плотной жидкостью вверху. После того, как две фазы снова разделятся на два слоя, их разделяют, открывая запорный кран на дне делительной воронки и позволяя одному слою вытекать.Жидкость, из которой было удалено растворенное вещество, называется рафинатом, а жидкость, в которой было удалено растворенное вещество, называется экстрактом.

Органическое соединение распределяется между двумя слоями в зависимости от его растворимости в каждой фазе. Равновесие достигается, когда химический потенциал растворенного вещества одинаков в двух фазах. Коэффициент распределения растворенного вещества K представляет собой отношение концентрации образца в органическом слое к концентрации в водной фазе. Коэффициент распределения является константой, зависящей как от растворенного вещества, так и от пары растворителей, используемых при экстракции.Коэффициент распределения является выражением предпочтения растворенного вещества для каждого из двух растворителей. Растворенные вещества с большим коэффициентом распределения имеют более высокую тенденцию экстрагироваться в слой органического растворителя. Растворенные вещества с небольшими коэффициентами распределения предпочитают переходить в водную фазу.

Определение пары растворителей для жидкостно-жидкостной экстракции является жизненно важным шагом. При выборе растворителей следует учитывать следующее. Во-первых, растворенное вещество должно быть более растворимым в растворителе, чем в воде.Следовательно, необходимо знать коэффициент распределения растворенного вещества в потенциальной паре растворителей. Во-вторых, пара растворителей не должна смешиваться с водой и не должна образовывать гомогенный раствор при смешивании. В-третьих, растворители должны быть инертными и не вступать в реакцию с растворенным веществом. Растворитель также должен быть летучим, чтобы его можно было легко удалить из растворенного вещества. Несмешивающийся с водой органический растворитель обычно имеет неполярную или низкую полярность.

Также важно знать плотности растворителей для определения идентичности верхнего и нижнего слоев.Большинство органических жидкостей имеют более низкую плотность, чем вода, за исключением хлорированных органических растворителей, и оседают на дно делительной воронки.

Кислотно-щелочная экстракция

Кислотно-основная экстракция - это тип жидкостно-жидкостной экстракции, при которой органические соединения отделяются на основе их кислотно-основных свойств. Если растворенное вещество представляет собой кислоту или основание, его заряд изменяется при изменении pH. Как правило, большинство органических соединений нейтральны и поэтому более растворимы в органических растворителях, чем в воде.Однако, если органическое соединение становится ионным, оно становится более растворимым в воде. Это полезно для извлечения органической кислоты или основного соединения из органической фазы в водную фазу.

Кислотно-щелочная экстракция использует это свойство, превращая растворенное вещество в его водорастворимую солевую форму, тем самым изменяя его растворимость. Растворимость органического соединения и его соли должна резко отличаться, чтобы методика была эффективной.

Например, рассмотрим смесь, содержащую органическую карбоновую кислоту, амин и нейтральное соединение.Карбоновые кислоты, состоящие из шести или более атомов углерода, нерастворимы в воде и полностью растворимы в органических растворителях. Однако их сопряженные основания (ионное соединение) растворимы в воде и нерастворимы в органических растворителях. Амин, состоящий как минимум из семи атомов углерода, нерастворим в воде, но растворим в органических растворителях. Конъюгированная кислота этого амина (ионного соединения) растворима в воде и нерастворима в органических растворителях.

При взаимодействии с основанием карбоновая кислота нейтрализуется до ее солевой формы.Остальные соединения в смеси остаются нейтральными. Как только карбоновая кислота превращается в соль, она переходит в водную фазу, в то время как нейтральные соединения остаются в органической фазе.

Кислотно-щелочная экстракция также используется для разделения двух слабых кислот или двух слабых оснований со значительной разницей в их pK a . В случае кислот относительно более сильная кислота, имеющая небольшое значение pKa, нейтрализуется до соли с использованием слабого основания. Слабое основание не реагирует эффективно с более слабой кислотой, и только более сильная кислота превращается в соль.Затем соль экстрагируют в водную фазу во время экстракции. Этот процесс аналогичен для слабых оснований, где относительно более сильное основание нейтрализуется до соли с помощью слабой кислоты.

Список литературы

  1. Харрис, округ Колумбия (2015). Количественный химический анализ. Нью-Йорк, Нью-Йорк: W.H. Фримен и компания.

Прошлое и настоящее

Извлечение ДНК, РНК и белка - основной метод, используемый в молекулярной биологии.Эти биомолекулы можно выделить из любого биологического материала для последующих процессов, аналитических или препаративных целей. В прошлом процесс экстракции и очистки нуклеиновых кислот был сложным, длительным, трудоемким и ограниченным с точки зрения общей производительности. В настоящее время существует множество специализированных методов, которые можно использовать для извлечения чистых биомолекул, например, протоколы на основе растворов и колонок. Ручной метод, безусловно, прошел долгий путь с течением времени с различными коммерческими предложениями, которые включали полные наборы, содержащие большинство компонентов, необходимых для выделения нуклеиновой кислоты, но большинство из них требует повторных этапов центрифугирования с последующим удалением супернатантов в зависимости от типа образца и дополнительная механическая обработка.Спрос на автоматизированные системы, предназначенные для средних и крупных лабораторий, в последние годы вырос. Это альтернатива трудоемким ручным методам. Технология должна обеспечивать высокую пропускную способность образцов; выход, чистота, воспроизводимость и масштабируемость биомолекул, а также скорость, точность и надежность анализа должны быть максимальными при минимальном риске перекрестного загрязнения.

Извлечение биомолекул, ДНК, РНК и белка - наиболее важный метод, используемый в молекулярной биологии [1].Это отправная точка для последующих процессов и разработки продуктов, включая диагностические комплекты. ДНК, РНК и белок можно выделить из любого биологического материала, такого как живые или консервативные ткани, клетки, вирусные частицы или другие образцы для аналитических или препаративных целей [1].

Две категории, которые участвуют в очистке ДНК, включают выделение рекомбинантных конструкций ДНК, таких как плазмиды или бактериофаги, и выделение хромосомной или геномной ДНК от прокариотических или эукариотических организмов [2].Как правило, для успешной очистки нуклеиновых кислот требовалось четыре важных этапа: эффективное разрушение клеток или тканей; денатурация нуклеопротеидных комплексов; инактивация нуклеаз, например, РНКазы для экстракции РНК и ДНКазы для экстракции ДНК; вдали от загрязнения [2]. Нуклеиновая кислота-мишень не должна содержать примесей, в том числе белков, углеводов, липидов или других нуклеиновых кислот, например ДНК без РНК или РНК без ДНК [3]. Качество, а также целостность выделенной нуклеиновой кислоты будут напрямую влиять на результаты всех последующих научных исследований [4].

С другой стороны, РНК является нестабильной молекулой и имеет очень короткий период полураспада после извлечения из клетки или тканей [5]. Существует несколько типов естественных РНК, включая рибосомную РНК (рРНК) (80–90%), информационную РНК (мРНК) (2,5–5%) и транспортную РНК (тРНК) [3]. Особая осторожность и меры предосторожности требуются для выделения РНК, поскольку она подвержена деградации [3, 6]. РНК особенно нестабильна из-за повсеместного присутствия РНКаз, которые представляют собой ферменты, присутствующие в крови, всех тканях, а также в большинстве бактерий и грибов в окружающей среде [3, 5] . Сильные денатуранты всегда использовались при выделении интактной РНК для ингибирования эндогенных РНКаз [2]. Экстракция РНК основана на хорошей лабораторной технике и методе без РНКазы. РНКаза термостабильна и повторно складывается после тепловой денатурации. Их сложно инактивировать, поскольку они не требуют кофакторов [2]. Наиболее распространенные методы выделения можно разделить на два класса: использование 4 M тиоцианата гуанидиния и использование фенола и SDS [2].

Очистка белков - одна из наиболее важных частей в исследованиях белков для понимания их функции, поскольку они могут частично или полностью участвовать в любой деятельности по синтезу ДНК.Очистка белка необходима для определения его уникальных характеристик, включая размер, заряд, форму и функцию [7]. Экстракция на основе клеток - это начальный этап почти любой очистки белка. Белок может быть извлечен несколькими методами, такими как лизис детергентом, усилие сдвига, обработка солью с низким содержанием ионов (высаливание) и быстрые изменения давления, которые направлены на ослабление и разрушение мембран, окружающих клетку, чтобы позволить белкам уйти [7 ]. При работе с белками следует учитывать некоторые факторы.Обычно экстракция белка выполняется при очень низкой температуре (), поскольку белки легко денатурируются, как только они высвобождаются из клеток. Состояние буфера - один из основных факторов, которые необходимо учитывать. Рекомендуется поддерживать определенные буферные условия из-за чувствительности белков к изменениям pH окружающей среды [4]. Чистота воды будет влиять на выход конечных продуктов, так как неочищенная вода содержит много микроорганизмов или протеаз, которые приводят к деградации белка [4].Ингибитор белка, который может существовать в растворе или буферах, вызывает гидролиз белков. Детергент, еще один важный фактор, которым нельзя пренебрегать при очистке белка, состоит из гидрофобной части линейного или разветвленного углеводородного «хвоста» и гидрофильной «головы» [4]. Они солюбилизируют мембранный белок и представляют собой амфифатические молекулы, которые образуют мицеллы с гидрофильной головкой белков [4]. Восстановители будут добавлены в раствор или буфер для экстракции и очистки белка, чтобы избежать потери активности белков или ферментов, вызванной окислением.Хранение белков важно, поскольку период полураспада белка обычно зависит от температуры хранения [4].

Для очистки белка требуется специальный анализ. Для очистки белка должен быть известен быстрый и простой метод анализа, чтобы можно было определить известную молекулярную массу, удельную аффинность или иммуноаффинность интересующего неферментативного белка с помощью соответствующего метода [7]. Есть несколько методов, обычно используемых для очистки белка. Это ионообменная хроматография, гель-фильтрация, аффинная хроматография и гель-электрофорез [4].

2. История
2.1. Экстракция нуклеиновой кислоты

Самое первое выделение ДНК было сделано швейцарским врачом Фридрихом Мишером в 1869 году [8] . Он надеялся разгадать фундаментальные принципы жизни, определить химический состав клеток. Он попытался выделить клетки из лимфатических узлов для своего эксперимента, но чистота лимфоцитов была трудной и невозможно было получить в достаточных количествах. Поэтому он переключился на лейкоциты, где получил их из гноя на собранных хирургических повязках.

Первоначально Мишер сосредоточился на различных типах белков, из которых состоят лейкоциты, и показал, что белки являются основными компонентами цитоплазмы клетки. Во время своих тестов он заметил, что при добавлении кислоты из раствора выпадало вещество, которое снова растворялось при добавлении щелочи. Это был первый раз, когда он получил неочищенный осадок ДНК.

Чтобы отделить ДНК от белков в экстрактах своих клеток, Мишер разработал новый протокол отделения ядер клеток от цитоплазмы, а затем выделил ДНК.Однако его первый протокол не дал достаточно материала для продолжения дальнейшего анализа. Ему пришлось разработать второй протокол для получения большего количества очищенного нуклеина, который позже его ученик Ричард Альтман назвал «нуклеиновой кислотой» [8].

2.2. Экстракция белка

В восемнадцатом веке белки были известны как отдельный класс биологических молекул Антуаном Фуркроем и другими. Они различали эту молекулу по ее способности коагулировать под действием тепла или кислоты.Однако первое описание белка было выполнено голландским химиком Герхардусом Йоханнесом Малдером в 1893 году [9]. Его исследования состава веществ животного происхождения, в основном фибрина, альбумина и желатина, показали присутствие углерода, водорода, кислорода и азота [9]. Более того, он признал, что сера и фосфор иногда присутствуют в животных веществах, состоящих из большого количества атомов, и установил, что эти «вещества» были макромолекулами [9].

Большинство ранних исследований было сосредоточено на белках, которые можно было очищать в больших количествах.Например, кровь, яичный белок и различные токсины. Большинство белков трудно очистить в количествах, превышающих миллиграммы, даже с помощью современных высокотехнологичных методов. Большинство методов очистки белков были разработаны в рамках проекта, возглавляемого Эдвином Джозефом Коном, ученым-белком, во время Второй мировой войны. Он отвечал за очистку крови и разработал методы выделения фракции сывороточного альбумина из плазмы крови, которая важна для поддержания осмотического давления в кровеносных сосудах, что помогает солдатам выжить [10].

3. Текущая тенденция

После судьбоносного события, когда Мишеру удалось получить ДНК из клетки, многие другие последовали его примеру, что привело к дальнейшему развитию протокола выделения и очистки ДНК. Первоначальные рутинные лабораторные процедуры экстракции ДНК были разработаны на основе стратегий центрифугирования в градиенте плотности. Мезельсон и Шталь использовали этот метод в 1958 г., чтобы продемонстрировать полуконсервативную репликацию ДНК [3]. В более поздних процедурах использовались различия в растворимости больших хромосомных ДНК, плазмид и белков в щелочном буфере [3].

В настоящее время существует множество специализированных методов извлечения чистой ДНК, РНК или белка. Как правило, они делятся на протоколы на основе решений или на основе столбцов. Большинство из этих протоколов были преобразованы в коммерческие наборы, которые упрощают процессы экстракции биомолекул.

3.1. Тип экстракции нуклеиновой кислоты
3.1.1. Стандартный метод

Экстракция тиоцианата гуанидиния, фенола и хлороформа
Соль является обычной примесью в образцах нуклеиновых кислот.Всегда требовалось удалить его из образцов нуклеиновой кислоты до того, как можно будет проводить какие-либо последующие процессы и анализ. Следовательно, для обессоливания образца, содержащего нуклеиновую кислоту, необходимы однократные или многократные стадии разделения и / или очистки [11]. Общие этапы очистки нуклеиновых кислот включают лизис клеток, который разрушает клеточную структуру с образованием лизата, инактивацию клеточных нуклеаз, таких как ДНКаза и РНКаза, и отделение желаемой нуклеиновой кислоты от клеточного мусора [2].Органический растворитель - экстракция фенол-хлороформ является одним из примеров, который широко используется для выделения нуклеиновой кислоты.
Хотя фенол, легковоспламеняющаяся, коррозионная и токсичная карболовая кислота, может быстро денатурировать белки, он не полностью подавляет активность РНКазы [12]. Эту проблему можно решить, используя смесь фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1). Белки, липиды, углеводы и остатки клеток удаляются путем экстракции водной фазы органической смесью фенола и хлороформа [12, 13].При добавлении фенола и хлороформа образуется двухфазная эмульсия. Затем гидрофобный слой эмульсии осаждается на дне, а гидрофильный слой - наверху путем центрифугирования [3]. Собирают верхнюю фазу, содержащую ДНК, и ДНК можно осаждать из супернатанта путем добавления этанола или изопропанола в соотношении 2: 1 или 1: 1 и высокой концентрации соли [3]. Осадок ДНК собирают центрифугированием, избыток соли промывают 70% этанолом и центрифугируют, чтобы удалить этанольный супернатант.Затем осадок ДНК растворяют в буфере ТЕ или стерильной дистиллированной воде [3].
Использование изотиоцианата гуанидиния для экстракции РНК впервые было упомянуто Ulrich et al. (1977). Метод был трудоемким. Поэтому он был заменен одностадийным методом, известным как экстракция гуанидиния тиоцианат-фенол-хлороформ, Хомчински и Сакки (1987) [12], при котором гомогенат экстрагируется фенолом / хлороформом при пониженном pH. Тиоцианат гуанидиния - это хаотропный агент, используемый при расщеплении белков.Принцип этого одностадийного метода заключается в том, что РНК отделяется от ДНК после экстракции кислотным раствором, состоящим из тиоцианата гуанидиния, ацетата натрия, фенола и хлороформа [13]. В кислых условиях общая РНК будет оставаться в верхней водной фазе всей смеси, в то время как ДНК и белки останутся в межфазной или нижней органической фазе. Затем проводят восстановление общей РНК путем осаждения изопропанолом [12].

Метод щелочной экстракции
Щелочной лизис использовали для выделения плазмидной ДНК и E.coli [12]. Он хорошо работает со всеми штаммами E. coli
и с бактериальными культурами размером от 1 мл до более 500 мл в присутствии додецилсульфата натрия (SDS). Принцип метода основан на селективной щелочной денатурации высокомолекулярной хромосомной ДНК, в то время как ковалентно замкнутая кольцевая ДНК остается двухцепочечной [14]. Бактериальные белки, разрушенные клеточные стенки и денатурированная хромосомная ДНК объединены в большие комплексы, покрытые додецилсульфатом.Плазмидную ДНК можно выделить из супернатанта после удаления денатурированного материала центрифугированием.

CTAB Extraction Method
Для экстракции растений первым шагом, который необходимо сделать, является измельчение образца после его замораживания жидким азотом. Цель выполнения этого шага - разрушить материал клеточной стенки образца и предоставить доступ к нуклеиновой кислоте, в то время как вредные клеточные ферменты и химические вещества остаются инактивированными. После измельчения образца его можно ресуспендировать в подходящем буфере, таком как CTAB.
Бромид цетилтриметиламмония (CTAB) представляет собой неионный детергент, который может осаждать нуклеиновые кислоты и кислые полисахариды из растворов с низкой ионной силой [15]. Между тем в этих условиях белки и нейтральные полисахариды остаются в растворе. В растворах с высокой ионной силой CTAB не осаждает нуклеиновые кислоты и образует комплексы с белками. Таким образом, CTAB полезен для очистки нуклеиновой кислоты от организмов, которые продуцируют большие количества полисахаридов, таких как растения и некоторые грамотрицательные бактерии [15].
В этом методе также используются органические растворители и осаждение спиртом на более поздних этапах [12]. Нерастворимые частицы удаляют центрифугированием для очистки нуклеиновой кислоты. Растворимые белки и другие материалы разделяются путем смешивания с хлороформом и центрифугирования. После этого нуклеиновую кислоту необходимо осадить из надосадочной жидкости и тщательно промыть для удаления загрязняющих солей. Затем очищенную нуклеиновую кислоту ресуспендируют и хранят в буфере ТЕ или стерильной дистиллированной воде.

Бромид этидия () -хлорид цезия () Градиентное центрифугирование
Градиентное центрифугирование - это сложный, дорогой и трудоемкий метод по сравнению с другими протоколами очистки.Это требует крупномасштабного бактериального культивирования. Следовательно, он не подходит для минипрепаратов плазмидной ДНК [4]. Нуклеиновые кислоты можно концентрировать центрифугированием в градиенте после осаждения спиртом и ресуспендирования. Интеркаляция изменяет плавающую плотность молекулы в высокомолярные ковалентно замкнутые круговые молекулы, которые будут накапливаться при более низких плотностях градиента, поскольку они включают меньше на пару оснований по сравнению с линейными молекулами. После экстракции гидрофобные вещества удаляют соответствующими гидрофобными растворителями.Очищенную нуклеиновую кислоту переосаждают спиртом [1].

Очистка поли РНК с помощью хроматографии Oligp (dT) -целлюлозы
Поли РНК является матрицей для трансляции белка, и большинство эукариотических мРНК несут ее участки на своих 3’-концах [4, 15]. Он составляет от 1 до 2% от общей РНК и может быть разделен с помощью аффинной хроматографии на олиго (dT) -целлюлозе. Поли (A) хвосты образуют стабильные гибриды РНК-ДНК с короткими цепями олиго (dT), которые прикрепляются к различным поддерживающим матрицам [4, 15].В хроматографический буфер необходимо добавить большое количество соли для стабилизации дуплексов нуклеиновых кислот, поскольку образуются только несколько пар оснований dT-A. Буфер с низким содержанием соли используется после того, как неполиаденилированные РНК были отмыты от матрицы. Этот буфер помогает дестабилизировать двухцепочечные структуры и элюировать поли РНК из смолы [15].
Существует два метода, обычно используемых при выборе поли РНК - колоночная хроматография на олиго (dT) колонках и периодическая хроматография. Колоночная хроматография обычно используется для очистки больших количеств (> 25 г) нерадиоактивной РНК поли (А) + , выделенной из клеток млекопитающих.При работе с небольшими количествами (<50 г) тотальной РНК млекопитающих предпочтительным методом является периодическая хроматография. Его можно использовать, когда нужно обработать много образцов РНК, радиоактивных или нет. Периодическая хроматография проводится с мелкодисперсной олиго (dT) целлюлозой при оптимальных температурах для связывания и элюирования [15].

3.1.2. Твердофазная экстракция нуклеиновых кислот

Твердофазная очистка нуклеиновых кислот можно найти в большинстве имеющихся на рынке коммерческих наборов для экстракции.Он позволяет производить быструю и эффективную очистку по сравнению с традиционными методами [16]. Многие проблемы, связанные с жидкостно-жидкостной экстракцией, такие как неполное разделение фаз, можно предотвратить. Твердофазная система будет поглощать нуклеиновую кислоту в процессе экстракции в зависимости от pH и содержания соли в буфере. Процесс абсорбции основан на следующих принципах: связывающее водород взаимодействие с гидрофильной матрицей в хаотропных условиях, ионный обмен в водных условиях посредством анионита, а также механизмы сродства и исключения по размеру.

Твердофазную очистку обычно проводят с использованием спин-колонки, работающей под действием центробежной силы [17]. Этот метод позволяет быстро очистить нуклеиновую кислоту по сравнению с обычными методами. Матрицы из диоксида кремния, частицы стекла, диатомовая земля и анионообменные носители являются примерами, которые использовались в методе твердофазной экстракции в качестве твердого носителя. Четыре ключевых этапа твердофазной экстракции - это лизис клеток, адсорбция нуклеиновых кислот, промывка и элюция [6].

Первым шагом в процессе твердофазной экстракции является подготовка колонки для адсорбции пробы.Кондиционирование колонки может быть выполнено с использованием буфера при определенном pH для преобразования поверхности или функциональных групп твердого вещества в определенную химическую форму. [17]. Затем образец, который был разрушен с использованием буфера для лизиса, наносится на колонку. Желаемая нуклеиновая кислота будет абсорбироваться колонкой с помощью высокого pH и концентрации соли связывающего раствора [17]. Другие соединения, такие как белок, также могут иметь прочную специфическую связь с поверхностью колонки. Эти загрязнения могут быть удалены на стадии промывки с использованием промывочного буфера, содержащего конкурентный агент [17].На стадии элюирования вводится ТЕ-буфер или вода, чтобы высвободить нужную нуклеиновую кислоту из колонки, чтобы ее можно было собрать в очищенном состоянии [17]. Обычно на этапах промывки и элюирования в процессе очистки требуется быстрое центрифугирование, вакуумная фильтрация или разделение колонок.

Были описаны твердофазная экстракция нуклеиновой кислоты в смешанном слое и ее использование для выделения нуклеиновой кислоты [18]. Твердые фазы смешанного слоя по настоящему изобретению представляют собой смеси по меньшей мере двух различных твердых фаз, могут быть твердыми или полутвердыми, пористыми или непористыми.Каждая твердая фаза может связываться с нуклеиновой кислотой-мишенью в различных условиях раствора и высвобождать нуклеиновую кислоту в аналогичных условиях элюирования [18].

Матрицы из диоксида кремния
В основе большинства продуктов, связанных с очисткой нуклеиновых кислот, лежат уникальные свойства матриц из диоксида кремния по избирательному связыванию ДНК. Типы материалов из диоксида кремния, включая частицы стекла, такие как стеклянный порошок, частицы диоксида кремния и стеклянные микроволокна, полученные путем измельчения фильтровальной бумаги из стекловолокна, включая диатомит [19].Матрица из гидратированного диоксида кремния, которую получали кипячением с обратным холодильником диоксида кремния в гидроксиде натрия или гидроксиде калия при молярном соотношении примерно от 2: 1 до 10: 1 в течение по меньшей мере примерно 48 часов, была введена в процесс очистки ДНК. ДНК связывается с неорганической матрицей и выделяется в нагретой воде [20].
Принцип очистки матриц кремнезема основан на высоком сродстве отрицательно заряженной основной цепи ДНК к положительно заряженным частицам кремнезема [21]. Натрий играет роль катионного мостика, который притягивает отрицательно заряженный кислород в фосфатном остове нуклеиновой кислоты [22].Катионы натрия разрывают водородные связи между водородом в воде и отрицательно заряженными ионами кислорода в кремнеземе в условиях высокой концентрации соли (pH ≤7) [22]. ДНК прочно связана, и тщательная промывка удаляет все загрязнения. Очищенные молекулы ДНК можно элюировать при низкой ионной силе (pH ≥7) позже с использованием буфера ТЕ или дистиллированной воды [21].
Известно, что помимо матриц кремнезема нитроцеллюлозные и полиамидные мембраны, такие как нейлоновые матрицы, связываются с нуклеиновыми кислотами, но с меньшей специфичностью.Эти материалы часто используются в качестве твердофазных матриц для переноса нуклеиновых кислот и гибридизации [23]. Полиамидные матрицы более долговечны, чем нитроцеллюлоза, и, как известно, необратимо связывают нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты можно иммобилизовать на полиамидных матрицах в буфере с низкой ионной силой [23].

Стеклянная частица
Стеклянные частицы, порошок и шарики пригодны для очистки нуклеиновых кислот. Например, выделение ДНК из агарозных гелей включает использование хаотропных солей для облегчения связывания ДНК с обычным силикатным стеклом, бесцветным стеклом и боросиликатным стеклом (стекловолоконный фильтр).Адсорбция нуклеиновой кислоты на стеклянную подложку, скорее всего, происходит по механизму и принципу, аналогичному адсорбционной хроматографии [24]. Очистку нуклеиновых кислот можно также проводить на смеси силикагеля и стекла [19]. Это изобретение обнаружило, что смесь силикагеля и стеклянных частиц может быть использована для отделения нуклеиновой кислоты от других веществ в присутствии раствора хаотропных солей.

Диатомовая земля
Диатомовая земля, также известная как кизельгур или диатомит, содержит до 94% кремнезема [25].Он использовался для фильтрации и в хроматографии, и он полезен для очистки плазмид и другой ДНК путем иммобилизации ДНК на ее частицах в присутствии хаотропного агента. Затем полученная ДНК, связанная с диатомовой землей, промывается спиртосодержащим буфером. Затем спиртосодержащий буфер удаляется, и ДНК элюируется малосолевым буфером или дистиллированной водой [25].

Очистка нуклеиновых кислот с помощью магнитных шариков
Магнитное разделение - это простой и эффективный способ, который используется в настоящее время для очистки нуклеиновых кислот.Многие магнитные носители сейчас коммерчески доступны. Частицы, имеющие магнитный заряд, могут быть удалены с помощью постоянного магнита в приложении магнитного поля. Часто для процесса выделения используются магнитные носители с иммобилизованными аффинными лигандами или полученные из биополимера, демонстрирующего сродство к целевой нуклеиновой кислоте. Например, магнитные частицы, которые производятся из различных синтетических полимеров, биополимеров, пористого стекла или магнитных частиц на основе неорганических магнитных материалов, таких как оксид железа с модифицированной поверхностью.Для связывания нуклеиновых кислот предпочтительно использовать материалы с большой площадью поверхности. Материалы с магнитными частицами, такие как шарики, более предпочтительны в качестве подложки в процессе изоляции из-за их большей связывающей способности. Процесс связывания нуклеиновой кислоты может поддерживаться нуклеиновой кислотой, «обертывающей» носитель. Магнит может быть приложен к стороне сосуда, который содержит смесь образцов для агрегирования частиц у стенки сосуда и выливания остатка образца [26].
Частицы, обладающие магнитными или парамагнитными свойствами, используются в изобретении, где они заключены в полимер, такой как намагничивающаяся целлюлоза [27]. В присутствии определенных концентраций соли и полиалкиленгликоля намагничивающаяся целлюлоза может связываться с нуклеиновыми кислотами. Небольшая нуклеиновая кислота требует более высоких концентраций соли для прочного связывания с намагничивающимися частицами целлюлозы. Следовательно, концентрацией соли можно выборочно управлять для высвобождения нуклеиновой кислоты, связанной с намагничивающейся целлюлозой, в зависимости от размера.Намагничивающаяся целлюлоза, связанная с нуклеиновой кислотой, будет промыта подходящим промывочным буфером перед их контактом с подходящим элюирующим буфером для отделения желаемой нуклеиновой кислоты от целлюлозы. Отделение намагничивающейся целлюлозы от надосадочной жидкости во время всех стадий очистки может быть выполнено путем приложения магнитного поля, которое притягивает или притягивает их к стенке сосуда [27]. Намагничивающаяся целлюлоза, используемая в этом изобретении, имеет содержание оксида железа примерно до 90% по массе от общей массы целлюлозы.Магнитный компонент целлюлозы также может быть заменен другими магнитными соединениями, такими как оксид железа или оксид никеля [27].
Набор для экстракции, основанный на принципе очистки нуклеиновых кислот с помощью магнитных шариков, коммерчески доступен на рынке [28]. Особенностью этого набора является то, что поставляемые реагенты предназначены для использования с магнитными инструментами. Этот магнитный инструмент рекомендуется использовать при работе в формате микропробирки. Это практичное устройство для разделения на основе технологии магнитных частиц.Набор не требует каких-либо органических растворителей и исключает необходимость повторного центрифугирования, вакуумной фильтрации или разделения колонок. Протокол основан на модифицированной процедуре щелочного лизиса с последующим связыванием нуклеиновой кислоты с магнитными частицами. Магнитный инструмент используется для захвата магнитных частиц со связанной нуклеиновой кислотой, а загрязнения удаляются промывкой с помощью предусмотренного промывочного буфера. Затем нуклеиновая кислота элюируется с магнитных частиц буфером для элюции [28].
Другой набор для экстракции работает по тому же принципу, что и описанная выше экстракция, в которой для очистки нуклеиновых кислот использовалась технология магнитных частиц [29]. Он сочетает в себе скорость и эффективность очистки ДНК на основе диоксида кремния с удобством работы с магнитными частицами. Магнитный стержень, защищенный крышкой стержня, используется для захвата магнитных частиц. Он попадает в сосуд с образцами и притягивает магнитные частицы. Затем крышка магнитного стержня помещается над другим сосудом, и магнитные частицы высвобождаются [29].
Очистка нуклеиновой кислоты с использованием гранул диоксида циркония - это еще один тип очистки на основе магнитных гранул. Эти микросферические парамагнитные шарики имеют большую доступную поверхность связывания и могут быть диспергированы в растворе. Эта характеристика позволяла тщательно связывать, промывать и элюировать нуклеиновые кислоты. Набор для выделения полной нуклеиновой кислоты, в котором используется эта технология для очистки нуклеиновой кислоты, использует механическое разрушение образцов гранулами диоксида циркония в растворе на основе тиоцианата гуанидиния, который не только высвобождает нуклеиновую кислоту, но и инактивирует нуклеазу в матрице образца [ 30].После стадии лизиса образцы разбавляются изопропанолом. Парамагенетические гранулы добавляют к образцам для связывания нуклеиновых кислот. Смесь гранул и нуклеиновой кислоты иммобилизуют на магнитах и ​​промывают для удаления белка и загрязнений. Удаление остаточного связывающего раствора выполняется вторым промывочным раствором, и, наконец, нуклеиновая кислота элюируется буфером с низким содержанием соли [30].
Твердофазная технология на основе парамагенетических шариков с обратимой иммобилизацией была использована в системе очистки ПЦР для получения качественной ДНК.Это требует простого протокола без центрифугирования и фильтрации. Ампликоны ПЦР связываются с парамагенетическими частицами, которые вытягивают их из раствора, позволяя смывать такие загрязнители, как dNTP, праймеры и соли [31].
Магнитный олиго (dT) шарик является альтернативой другим олиго (dT) матрицам для очистки поли РНК из образца тотальной РНК [4]. Поли РНК можно экстрагировать путем введения магнитных шариков, покрытых олиго (dT). РНК с поли-А-хвостом присоединяется к олиго (dT). Затем шарики будут вытягиваться на дно пробирки, удаляя мРНК непосредственно из общей РНК.Специально обработанные магнитные шарики минимизируют неспецифическое связывание других нуклеиновых кислот и обеспечивают чистоту мРНК [32].

Анионообменный материал
Анионообменная смола - один из популярных примеров, в котором используется принцип анионного обмена [33]. Он основан на взаимодействии между положительно заряженными группами диэтиламиноэтилцеллюлозы (DEAE) на поверхности смолы и отрицательно заряженными фосфатами основной цепи ДНК. Анионообменная смола состоит из гранул диоксида кремния с большим размером пор, гидрофильного поверхностного покрытия и высокой плотности заряда [34].Большая площадь поверхности смолы позволяет плотно связывать группы DEAE. Смола работает в широком диапазоне условий pH (pH 6–9) и / или концентрации соли (0,1–1,6 M), что может оптимизировать отделение ДНК от РНК и других примесей [34]. Следовательно, концентрация соли и условия pH буферов являются одними из основных факторов, определяющих, связана ли нуклеиновая кислота или элюируется из колонки. ДНК может связываться с группой DEAE в широком диапазоне концентраций соли. Примеси, такие как белок и РНК, отмываются от смолы с использованием буферов со средним содержанием соли, в то время как ДНК остается связанной до тех пор, пока не будет элюирована буфером с высоким содержанием соли [34].
Способ использования анионообменных материалов для выделения нуклеиновой кислоты был раскрыт в изобретении [35], где использовались коммерчески доступные сильные или слабые положительно заряженные анионообменные материалы с выбранными растворами с известной ионной силой для адсорбции и элюирования. Большинство водорастворимых компонентов, таких как белок, можно промыть через колонку, используя раствор с известной ионной силой для связывания нуклеиновых кислот с материалами анионообменной колонки.Ионная сила для элюирования генерируется с использованием известной концентрации соли, которая смешивается с буфером для контроля силы pH, в идеале соответствующей самой низкой ионной силе, при которой нуклеиновые кислоты будут полностью элюироваться [35].

3.2. Тип экстракции белка Метод

Первым этапом очистки белка является лизис клеток. Чтобы эффективно очищать и анализировать белок, они должны быть сначала высвобождены из клетки-хозяина в растворимой форме. Плазматическая мембрана клеток млекопитающих, состоящая из фосфолипидов и белков, легко разрушается [36].Для сравнения, экстракция белка из грибов и бактерий кажется более сложной задачей из-за их стабильной клеточной стенки, которая прочнее плазматической мембраны.

Ткани растений содержат широкий спектр белков, которые различаются по своим свойствам. Некоторые специфические факторы необходимо учитывать при разработке протокола экстракции белка для растений [37]. Например, наличие жесткой клеточной стенки из целлюлозы необходимо разрезать, чтобы высвободить содержимое клетки. Конкретные загрязняющие соединения, такие как фенольные соединения и ряд протеиназ, могут приводить к деградации или модификации белка.Поэтому для экстракции и очистки белка из растений требуются особые условия [38].

Для удаления клеточной стенки используются методы механического разрушения, такие как French Press или стеклянные шарики, с последующей экстракцией общего белка на основе детергента [39].

3.2.1. Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография разделяет белки на основе их поверхностного ионного заряда с использованием смол, которые модифицированы положительно или отрицательно заряженными химическими группами [4, 7].Большинство белков имеют общий отрицательный или положительный заряд в зависимости от их изоэлектрической точки (pI) при заданном pH, что позволяет им взаимодействовать с противоположно заряженной хроматографической матрицей [7]. Если чистый заряд белка положительный при pH ниже значения pI, белок будет связываться с катионитом; при pH выше значения pI чистый заряд белка отрицательный, и белок будет связываться с анионообменником [38].

Белки, которые слабо взаимодействуют со смолами, например, слабый положительно заряженный белок, пропущенный через смолу, модифицированную отрицательно заряженной группой, элюируются в буфере с низким содержанием соли.С другой стороны, белки, которые сильно взаимодействуют, требуют для элюирования большего количества соли. Белки с очень похожими зарядовыми характеристиками могут быть разделены на разные фракции по мере их элюирования из колонки путем увеличения концентрации соли в элюирующем буфере [7].

Ионообменная колонка - одна из технологий, использующих принцип ионообменной хроматографии [33]. Он использует мембранно-абсорбционную технологию в качестве хроматографической матрицы для разделения белков. Мембранные абсорбенты в колоннах изготовлены на основе стабилизированной целлюлозы с высокопористой структурой, которая обеспечивает легкий доступ белков к заряженной поверхности.Взаимодействие между молекулами и активными центрами на мембране происходит в конвективных сквозных порах. Следовательно, адсорбционные мембраны могут поддерживать высокую эффективность при очистке больших биомолекул с низкой диффузией [33].

3.2.2. Гель-фильтрационная хроматография

Гель-фильтрационная хроматография, также называемая эксклюзионной или гель-проникающей хроматографией, разделяет белки в соответствии с размером и формой молекул, при этом молекулы не связываются с хроматографической средой [39].Это процесс, при котором большие молекулы проходят через колонку быстрее, чем маленькие. Маленькие молекулы могут проникать во все крошечные отверстия матрицы и получать доступ к большей части столбца. Белки небольшого размера будут проходить через эти отверстия, и им потребуется больше времени, чтобы вытечь из колонки, по сравнению с белками большого размера, которые не могут попасть в эти отверстия, но выходят непосредственно из колонки через пустое пространство в колонке [4, 7].

Набор для гель-фильтрационной хроматографии использует принцип гель-фильтрационной хроматографии [40].Целевой образец наносят поверх столбца, который содержит пористые шарики, пример матрицы в столбце. Молекулы разделяются, когда молекулы проходят через столбик пористых шариков. Разделение молекул можно разделить на три основных типа: полное исключение, избирательная проницаемость и общий предел проникновения. Полное исключение - это та часть, из-за которой большие молекулы не могут проникать в поры и быстро элюироваться. Для области селективного проникновения промежуточные молекулы могут проникать в поры и могут иметь среднее время пребывания в частицах в зависимости от их размера и формы.Что касается предела общего проникновения, то маленькие молекулы имеют наибольшее время пребывания после того, как они попадают в поры колонки [40]. Преимущество хроматографии на основе гель-фильтрации заключается в том, что она подходит для биомолекул, которые могут быть чувствительны к изменениям pH, концентрации ионов металлов и суровым условиям окружающей среды [39].

3.2.3. Аффинная хроматография

Аффинная хроматография зависит от конкретного взаимодействия между белком и твердой фазой, которое влияет на отделение от примесей.Он состоит из тех же этапов, что и ионообменная хроматография [38]. Он позволяет очищать белок на основе его биологической функции или индивидуальной химической структуры [41]. Белки, которые имеют высокое сродство к определенным химическим группам, таким как лиганды, будут ковалентно присоединяться и связываться с матрицей столбца, в то время как другие белки проходят через столбец [38]. Электростатические или гидрофобные взаимодействия, силы Ван-дер-Ваальса и водородные связи - это биологические взаимодействия между лигандами и белками-мишенями [41].Связанные белки будут элюированы из колонки раствором, содержащим высокую концентрацию растворимой формы лиганда [36].

Биоспецифический лиганд, который может ковалентно присоединяться к хроматографической матрице, является одним из требований для успешной аффинной очистки. Связывание между лигандом и молекулами белка-мишени должно быть обратимым, чтобы белки могли быть удалены в активной форме [41]. После смывания загрязнений связанный лиганд должен сохранять свое специфическое сродство связывания с целевыми белками.Некоторые примеры биологических взаимодействий, которые обычно используются в аффинной хроматографии, перечислены в таблице 1 (см. [41]).

906 906, кофактор 906 906

Типы лигандов Целевые молекулы

Фермент Субстратный аналог клетки
Лектин Полисахарид, гликопротеин, рецептор клеточной поверхности, клетка
Нуклеиновая кислота Комплементарная последовательность оснований, гистоны, полимераза нуклеиновой кислоты, белок, связывающий нуклеиновую кислоту
Рецептор гормона 906, рецептор витамина 906
Глутатион Слитые белки глутатион-S-трансферазы или GST
Ионы металлов Слитые белки поли (his), нативные белки с гистидином, цистеином и / или остатками триптофана на их поверхности 9
900 02 Хроматографическое разделение по дифференциальному сродству к лигандам, иммобилизованным на гранулированной пористой смоле, является фундаментальным для исследования белков [42].На рынок выпущен полный набор, который содержит шариковые колонки с аффинной смолой, основанный на принципе аффинной хроматографии [42]. Аффинную смолу можно использовать в формате периодической или микроцентрифужной спин-колонки в зависимости от масштаба и типа проводимого эксперимента. Кроме того, он может быть упакован в какую-либо более крупную гравитационную колонну [42].

3.2.4. Гель-электрофорез

Гель-электрофорез - это метод разделения белков в соответствии с их размером и зарядовыми свойствами.Частично очищенный белок из хроматографических разделений можно дополнительно очистить с помощью неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) или электрофореза в нативном геле [4]. В PAGE белки управляются приложенным током через гелеобразную матрицу [43]. Движение белка через этот гель зависит от плотности заряда (заряда на единицу массы) молекул. Молекулы с зарядом высокой плотности быстро мигрируют. Размер и форма белка - еще два важных фактора, влияющих на фракционирование в ПААГ [43].Размер пор акриламида играет роль молекулярного сита для разделения белков разного размера [4]. Чем больше белок, тем медленнее он мигрирует, поскольку он больше запутывается в геле [43]. Форма также является одним из факторов, поскольку компактные глобулярные белки перемещаются быстрее, чем удлиненные волокнистые белки сопоставимой молекулярной массы [43].

ПААГ обычно проводят в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) [44]. Белок, обработанный SDS, обычно устраняет вторичную, третичную и четвертичную структуру белка [4, 7].Белки разворачиваются в подобную стержнеобразную форму из-за электростатического отталкивания между связанными молекулами SDS. Количество молекул SDS, которые связываются с белком, приблизительно пропорционально молекулярной массе белка (около 1,4 г SDS / г белка) [43]. Каждый вид белка имеет эквивалентную плотность заряда и проходит через гель с одинаковой силой [43]. Кроме того, PAGE может минимизировать денатурацию белков. Многие белки все еще сохраняют свою биологическую активность после выполнения PAGE [7].Однако более крупные белки удерживаются в большей степени, чем более мелкие белки, потому что полиакриламид сильно сшит [43]. Следовательно, белки разделяются с помощью SDS-PAGE на основе их молекулярной массы. SDS-PAGE можно использовать для определения молекулярной массы смеси белков путем сравнения положений полос с полосами, продуцируемыми белками известного размера [43]. SDS, используемый в электрофорезе, разрешает смесь белков в соответствии с длиной отдельных полипептидных цепей [7].

Метод, называемый двумерным гель-электрофорезом, был разработан Патриком О’Фарреллом в 1975 году. Он используется для фракционирования сложных смесей белков с использованием двух различных методов - изоэлектрического фокусирования и SDS-PAGE [43]. Сначала белки разделяются в соответствии с их изоэлектрической точкой в ​​трубчатом геле. После этого разделения гель удаляют и помещают на пластину из полиакриламида, насыщенного SDS. Белки перемещаются в пластинчатый гель и разделяются в соответствии с их молекулярной массой [43].Двумерный гель-электрофорез подходит для обнаружения изменений белков, присутствующих в клетке в различных условиях, на разных стадиях развития или клеточного цикла или в разных организмах [43].

3.2.5. Юго-западный блоттинг (иммуноблоттинг)

Юго-западный блоттинг - это метод, который используется для выделения, идентификации и характеристики ДНК-связывающих белков по их способности связываться со специфическими олигонуклеотидными зондами [44, 45]. Многие ДНК-связывающие белки в клетке необходимо выделить индивидуально и охарактеризовать, чтобы определить функцию гена [44].Этот метод состоит из трех этапов. Сначала экстракты ядерных белков разделяют электрофорезом в SDS-PAGE. Затем разделенные белки переносятся на нитроцеллюлозный фильтр, поливинилидендифторид (ПВДФ) или катионную нейлоновую мембрану [12]. Затем фильтр будет инкубирован с олигонуклеотидными зондами для анализа адсорбированных белков [44, 45]. Однако этот метод сопряжен с такими проблемами, как необходимость в больших количествах ядерных белков (обычно 50–100 мг), деградация белка во время выделения, трудности в достижении эффективного электрофоретического разделения и переноса белков в широком диапазоне молекулярных размеров [45]. .

3.3. Экстракция биомолекул «все в одном»

Как правило, доступные на рынке методы экстракции или очистки или наборы позволяют извлекать только один тип нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, или белка из целевого организма. Когда клеточный материал ограничен, желательно извлекать ДНК, РНК и белок из одного источника.

Вариант одностадийного метода выделения Chomczynski and Sacchi (1987), в котором гомогенат тицианата гуанидиния экстрагируется фенолом: хлороформом при пониженном pH, позволяет получать ДНК, РНК и белок из ткани или клеток.Этот метод включает лизис клеток изотиоцианатом гуанидина и фенолом в однофазном растворе. Вторая фаза образуется после добавления хлороформа, где ДНК и белки экстрагируются, оставляя РНК в водном супернатанте. ДНК и белки могут быть выделены из органической фазы осаждением этанолом или изопропанолом, а РНК осаждена из водной фазы изопропанолом [15].

В настоящее время на рынке представлено несколько комплектов для экстракции «все в одном».Например, набор для экстракции на колонке, предназначенный для одновременной очистки геномной ДНК, общей РНК и общего белка из одного биологического образца без использования токсичных веществ, таких как фенол или хлороформ, и осаждения спиртом [46]. Он совместим с небольшими количествами широкого спектра культивируемых клеток и собранных тканей животного и человеческого происхождения. Целевой образец не нужно разделять на 3 части перед очисткой ДНК, РНК и белка [46].

Набор для экстракции 3-в-1 на основе раствора, доступный на рынке, является еще одним примером набора для неорганических растворов, который может извлекать и очищать ДНК, РНК и белок из различных организмов любых типов и размеров [47] .Его протокол из трех простых шагов, который занимает от 15 до 30 минут, обеспечивает быстрый и простой способ извлечения различных биомолекул. Следовательно, можно ожидать более высокого выхода, поскольку меньшее количество шагов приводит к меньшим потерям [47].

3.4. Автоматическая система экстракции

Автоматизированная система экстракции, большая, дорогая и сложная аппаратура, предназначенная для высокопроизводительной обработки образцов, помогла упростить выделение нуклеиновых кислот [48]. Эта система была разработана для средних и крупных лабораторий, количество которых выросло за последние годы [49].Автоматизация процесса экстракции нуклеиновых кислот потенциально выгодна по ряду причин, в том числе для сокращения рабочего времени, снижения затрат на рабочую силу, повышения безопасности труда, а также дает возможность повышения воспроизводимости и качества результатов [50]. Кроме того, это ключевое решение для повышения эффективности лаборатории [48] .

В клинических лабораториях очистка высококачественных биомолекул, таких как ДНК, РНК и белок, от различных исходных материалов будет использоваться в последующих испытаниях.Очень важно получить очищенные образцы достаточного качества и чистоты [48]. Следовательно, автоматические экстракции должны быть более последовательными и воспроизводимыми. Скорость, точность и надежность всего процесса экстракции должны быть максимальными и в то же время минимизировать риск перекрестного загрязнения [49]. Необходимо найти решение для повышения эффективности пробоподготовки без ущерба для качества. Возможность перекрестного загрязнения должна быть уменьшена, и системы должны быть приспособлены для отслеживания образцов со штрих-кодом [51].

Система экстракции, доступная на рынке, удовлетворяет указанным выше требованиям. Он предлагает лабораториям судебной экспертизы быструю и надежную обработку образцов наряду с высококачественной автоматической очисткой ДНК [52]. Это система обработки парамагнитных частиц для обработки проб и обеспечения постоянного выхода и чистоты, поскольку нет обнаруживаемого перекрестного загрязнения между пробами. Весь процесс экстракции занимает около 20 минут от начала до конца, потому что нужно всего три простых шага: добавить жидкие образцы в картридж с реактивами; поместите картриджи с реактивами в аппарат; нажмите кнопку Пуск.В конце процесса ДНК элюируется в буфер для элюирования [52].

Был представлен еще один пример автоматизированной системы, которая является гибкой и эффективной для экстракции нуклеиновых кислот и белков [53]. С помощью этой системы можно обрабатывать различные исходные материалы, которые предназначены для малых и средних проб. Он использовал функционализированные на поверхности парамагнитные частицы для адсорбции выделенной нуклеиновой кислоты [53]. Гибкость этой системы позволяет извлекать нуклеиновую кислоту из двенадцати образцов одновременно.Процесс экстракции занимает от 20 до 40 минут в зависимости от области применения. Наборы, оптимизированные для этой системы, могут извлекать геномную ДНК, клеточную РНК, вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты [53].

4. Возможное направление в будущем

Извлечение биомолекул - это первый шаг, который необходимо выполнить для последующего анализа или процесса манипуляции. Требование обращения с жидкостью - самый сложный аспект. Следовательно, любая автоматическая система должна включать в себя не только автоматическое оборудование для каждой стадии экстракции, но и оборудование для автоматизации передачи жидкости между машинами.Автоматизация помогла увеличить производительность и повысить надежность процесса, но эти системы по-прежнему предназначены для использования только в лабораторных условиях. Некоторые системы экстракции нуклеиновых кислот, доступные на рынке, имеют большие размеры и требуют предварительной обработки вручную персоналом лаборатории с техническими знаниями [54]. Таким образом, роботизированные рабочие станции для экстракции нуклеиновых кислот должны выполнять настоящую автоматизацию «от руки», что означает полностью автоматизированный процесс [49].Комбинация универсального раствора и метода экстракции биомолекул с полностью автоматизированной системой экстракции может стать перспективным изобретением в будущем. Очистка ДНК, РНК или белка от различных организмов может выполняться одновременно с использованием этого типа экстракционной системы с помощью всего лишь одного метода экстракции.

Часто бывает неудобно отправлять образец целевых биомолекул животного, растения или даже клинический образец в лабораторию для его извлечения и анализа [54].Образцы, особенно клинические образцы, такие как кровь, необходимо охладить и передать в ближайшую лабораторию для извлечения и анализа. Следовательно, портативная система экстракции биомолекул, которая дает несколько преимуществ, таких как сокращение трудозатрат, уменьшение количества отходов и повышение скорости процесса экстракции, может стать потенциальной разработкой в ​​будущем [54]. Комбинация портативной системы экстракции с анализатором ДНК, РНК или белков может быть создана в будущем, чтобы помочь исследователям сократить рабочее время и повысить эффективность работы.

Дальнейшее совершенствование миниатюризации станет будущей тенденцией роботизированной автоматизации в лаборатории [28]. Многие клинические лаборатории проводят анализ рабочего процесса и обнаруживают, что системы меньшего размера с меньшей пропускной способностью больше соответствуют рабочей нагрузке клинических лабораторий. Кроме того, эта система автоматизации может быть реализована с относительно низкими затратами, что сокращает время выполнения работ, а также снижает трудозатраты [55].

5. Заключение

Поскольку первое выделение ДНК было успешно выполнено Фридрихом Мишером в 1869 году, а первоначальная экстракция ДНК была разработана Мезельсоном и Шталем на основе стратегий центрифугирования в градиенте плотности в 1958 году, было разработано множество методов очистки биомолекул.От экстракции тиоцианат-фенол-хлороформ гуанидиния до колоночной технологии, которая широко используется при экстракции ДНК и РНК, и метода очистки хроматографии до иммуноблоттинга, который используется для экстракции белков, экстракция биомолекул помогла исследователям и ученым в манипулировании последующим анализом молекулярной биологии, чтобы чтобы лучше понимать биологические материалы Земли.

Автоматизированная система экстракции нуклеиновых кислот была разработана благодаря влиянию быстрого роста технологий автоматизации в настоящее время.Автоматизация процесса экстракции нуклеиновых кислот потенциально выгодна по ряду причин, в том числе для сокращения рабочего времени, снижения затрат на рабочую силу, повышения безопасности труда и в то же время дает возможность повышения воспроизводимости и качества результатов. Однако устранение недостатков некоторых инструментов необходимо проводить постоянно. Между тем, универсальная система экстракции биомолекул или изобретение миниатюрной и портативной системы экстракции может стать перспективным развитием в будущем.

Действие 1 - Экстракция ДНК


Действие 1 - Экстракция ДНК

Мы извлечем ДНК из фруктов, чтобы исследовать, как они выглядят и ощущаются. Эта процедура похожа на то, что должны сделать ученые, прежде чем они смогут использовать информацию, содержащуюся в этой ДНК. Эту информацию можно использовать для улучшения сельскохозяйственных культур, чтобы они были более устойчивыми к болезням, нашествию насекомых или изменениям климата.

Рисунок 1

Рисунок 2

Цели

  • Экстракт ДНК из растительных клеток
  • Понять общую структуру ячеек

Подготовка учителя к эксперименту

Требуемое время: ~ 20 минут

* Накануне вечером положите 95% этанол в морозильную камеру *

  1. Приготовьте раствор для экстракции (см. Ниже).
  2. Запуск нагрева воды до 60 ° C.
  3. Приготовьте ледяную баню.
  4. Подготовьте кусочки фруктов.
  5. Соберите материалы для каждой группы студентов, как указано ниже.


Раствор для экстракции

Материалы (100 мл)

  • 10 мл прозрачного шампуня (ежедневный очищающий шампунь Suave)
  • 1,5 г поваренной соли
  • Дистиллированный H 2 O

Процедура (изменить количество в зависимости от размера класса)

  1. Смешайте 90 мл дистиллированной воды и 1.5 г соли.
  2. Добавьте шампунь, пока объем раствора не станет 100 мл. Помешивайте медленно, чтобы шампунь не вспенился.
  3. Отмерьте 20 мл раствора в пакеты на молнии объемом 1 л (по 1 на студенческую пару).


Студенческая деятельность - Извлечение ДНК


Материалы

Требуемое время: ~ 45 минут

  • 1-литровый пакет на молнии (по одному на студенческую пару) с 20 мл буфера для экстракции
  • Очищенные и свежесрезанные фрукты киви (каждый фрукт нарезан на 12 частей) или одна большая клубника (каждый дает ~ 30 г на ученическую пару)
  • Стакан 500 мл (класс)
  • Тарелка с горячей водой со стаканом или кастрюлькой с водой, настроенной на постоянную температуру 60 ° C (класс)
  • Сырная салфетка (разрезанная по размеру небольшого стакана)
  • Лента
  • Большой холодильник с ледяной баней (класс)
  • Ледяной 95% этанол (2 мл на студенческую пару)
  • 1 маленькая пробирка (1 на студенческую пару)
  • 1 аппликатор для дерева (1 на студенческую пару)
  • Пипетки для переноса


Процедуры
  1. Добавьте киви / клубнику в раствор для экстракции в пакет с застежкой-молнией.Закройте пакет и выдавите воздух.
  2. Тщательно измельчите киви / клубнику в течение 5 минут. ОСТОРОЖНО, не ломайте сумку!
  3. Поместите пакеты в баню с горячей водой примерно на 10-15 минут, убедившись, что фруктовый раствор полностью ниже уровня воды. Время от времени встряхивайте пакет, чтобы равномерно распределить тепло.
  4. Поместите «размятые» пакеты с раствором киви / клубники в ледяную баню на 1 минуту. Удалите и снова тщательно перемешайте раствор киви / клубники. Повторите эту процедуру 5 раз.
  5. Обмотайте мензурки марлевой тканью. Процедите фруктовую смесь через марлю. На этом этапе объедините решения от всех студенческих групп. Дайте раствору стечь 5 минут.
  6. Используя большие пипетки для переноса, перенесите аликвоту примерно 2 мл раствора киви / клубники в пробирку, по одной на каждую пару учеников.
  7. Добавьте примерно 2 мл ледяного этанола в каждую пробирку, медленно опустив его по стенке пробирки, чтобы он оставался на поверхности смеси плодов киви и клубники.Не размешивайте раствор.
  8. Дайте раствору постоять две минуты, не мешая ему. ДНК будет выглядеть как прозрачная слизистая белая слизь, которую можно намотать деревянной палочкой-аппликатором.


Вопросы по процедуре
  1. Почему мы «давим» киви / клубнику?
  2. Почему мы используем шампунь?
  3. Что делает соль?
  4. Зачем нужно охлаждать смесь?
  5. Что делает холодный этанол?
  6. Почему нельзя использовать этанол комнатной температуры?


Вопросы для обсуждения
  1. Чтобы извлечь ДНК из клеток, от чего ее нужно выделить в случае такого растения, как клубника?
  2. Какие шаги мы использовали для извлечения ДНК?
  3. Для чего используется ДНК при ее извлечении?


Ответы на вопросы процедуры
  1. Почему мы «давим» киви / клубнику? Измельчение киви / клубники физически разрушает клеточные стенки.
  2. Почему мы используем шампунь? После того, как клеточные стенки были разрушены во время механического затирания фруктов, детергент в шампуне разрушает клеточные и ядерные мембраны каждой клетки, высвобождая ДНК. Это достигается за счет растворения липидов и белков, удерживающих мембраны вместе.
  3. Что делает соль? Соль нейтрализует отрицательные заряды на ДНК и, таким образом, позволяет цепям ДНК слипаться. Это также вызывает осаждение белков и углеводов.
  4. Зачем нужно охлаждать смесь? ДНКазы или рестрикционные ферменты, разрушающие ДНК, присутствуют в цитоплазме клетки. Они существуют для защиты клетки от заражения вирусами. Как только ядерная мембрана разрушается мылом, ДНК становится восприимчивой к ДНКазам и быстро разрушается. Однако эти ферменты чувствительны к температуре, и охлаждение раствора замедляет процесс разложения.
  5. Что делает холодный этанол? Все, кроме ДНК, растворяется в этаноле.Этанол вытягивает воду из молекулы ДНК, так что она затем разрушается сама по себе и выпадает в осадок. ДНК станет видимой в виде белых слизистых нитей, которые можно намотать деревянной палочкой-аппликатором.
  6. Почему нельзя использовать этанол комнатной температуры? Чем холоднее этанол, тем больше осаждается ДНК. (Вы можете попробовать попросить некоторых учеников использовать этанол комнатной температуры и посмотреть, будет ли количество ДНК, которое они могут намотать, таким же или меньшим, чем у групп, использующих ледяной этанол.)


Обсуждение вопросов и ответов
  1. Чтобы извлечь ДНК из клеток, от чего ее нужно выделить в случае такого растения, как клубника? Все остальные части клетки - клеточная стенка, клеточная мембрана, ядерная мембрана, митохондрии, вакуоли, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы и т. Д.
  2. Какие шаги мы использовали для извлечения ДНК? Сначала мы разрушили клеточные стенки, физически раздавив плод. Химический (детергентный) процесс разрушает клеточные стенки, клеточные мембраны и ядерные мембраны.Смесь фруктов охлаждали, чтобы ДНКазы, высвобождаемые из цитоплазмы, не разрушали ДНК клетки. Смесь фильтровали, чтобы отделить большие части ячеек, которые не нужны. Затем ДНК осаждали химическим путем (этанолом).
  3. Для чего используется ДНК при ее извлечении? ДНК может использоваться для идентификации лиц, причастных к преступлениям, для определения происхождения людей, а также растений и животных, а также для проверки генетических дефектов.Например, ДНК этих плодов киви / клубники можно сравнить с другими образцами, чтобы определить, был ли один из них изменен каким-либо образом, например, изменения, которые могут быть внесены, чтобы сделать урожай более питательным. ДНК одного организма, несущего ген, кодирующий конкретный признак, также может использоваться для трансформации. Часть ДНК, содержащую этот конкретный ген, можно вставить в другой организм, так что измененный организм теперь имеет особую черту, которой он раньше не нес.

(по материалам http://www.ctbiobus.org)


Список литературы

www.accessexcellence.org
www.biotech.iastate.edu
www.biology.arizona.edu

Следующий веб-сайт предоставляет протокол для извлечения вашей собственной ДНК! http://www.nature.ca/genome/05/051/pdfs/DNAextract_e.pdf

Протокол CTAB для выделения ДНК из тканей растений

Посетители из США и Канады, запросите БЕСПЛАТНЫЙ ОБРАЗЕЦ нашей SYNERGY ™ 2 на основе CTAB.0 Набор для экстракции ДНК растений ЗДЕСЬ.

Выделение ДНК из тканей растений может быть очень сложной задачей, поскольку биохимия между различными видами растений может быть очень сложной. крайний. В отличие от тканей животных, где один и тот же тип ткани разных видов обычно имеет сходные характеристики, растения могут иметь различные уровни метаболитов и структурных биомолекул. Полисахариды и полифенолы - это два класса биомолекул растений, которые сильно различаются между видами и очень проблематичны при выделении ДНК.Загрязняющие полисахариды и полифенолы могут мешать манипуляции с ДНК после выделения.

Доступны методы, которые эффективно удаляют полисахариды и полифенолы из препаратов ДНК растений. Использование CTAB (бромид цетилтриметиламмония), катионного детергента, облегчает разделение полисахаридов во время очистки, в то время как добавки, такие как поливинилпирролидон, могут способствовать удалению полифенолов. Буферы экстракции на основе CTAB широко используются, когда очистка ДНК из тканей растений.

Один из вариантов очистки ДНК с использованием CTAB основан на том, что полисахариды и ДНК имеют разную растворимость в CTAB в зависимости от концентрации хлорида натрия. При высшей соли концентрациях полисахариды нерастворимы, в то время как при более низких концентрациях ДНК нерастворима. Следовательно, регулируя концентрацию соли в лизатах, содержащих CTAB, полисахариды и ДНК могут быть дифференциально осаждается.

Полифенолы - это соединения, содержащие более одного фенольного кольца (например,g., танин), структура, которая очень эффективно связывается с ДНК. Они естественным образом встречаются в растениях, но также образуются при повреждении тканей растений (потемнение). При гомогенизации растительных тканей полифенолы синтезируются освобожденной полифенолоксидазой. Добавление поливинила пирролидон предотвращает взаимодействие ДНК и фенольных колец, связывая полифенолы.

Протоколы на основе

CTAB, как правило, работают очень хорошо, но одним существенным недостатком является то, что экстракция хлороформом обычно используется для отделения растворимых органических молекул от ДНК. Поскольку хлороформ канцерогенен, многие учреждения не одобряют его использование. Таким образом, OPS Diagnostics разработала альтернативный метод, исключающий использование хлороформа; его можно найти на Страница набора для экстракции ДНК растений Synergy ™.


Материалы

  • Буфер CTAB: 2% бромид цетилтриметиламмония, 1% поливинилпирролидон, 100 мМ трис-HCl, 1,4 М NaCl, 20 мМ ЭДТА или Буфер для экстракции CTAB
  • Центрифуга (до 14000 x g)
  • Раствор РНКазы А
  • Изопропанол
  • 70% этанол
  • Центрифужные пробирки 2 мл
  • SpeedVac
  • TE Buffer (10 мМ Трис, pH 8, 1 мМ ЭДТА)

Метод

Образцы растений можно приготовить путем криогенного измельчения ткани в ступке пестиком после охлаждения в жидком азоте.Сублимированные растения можно измельчать при комнатной температуре. В любом случае для извлечения ДНК лучше всего подходит мелкий порошок.

  1. На каждые 100 мг гомогенизированной ткани используйте 500 мкл буфера для экстракции CTAB. Смешайте и тщательно перемешайте. Перенести гомогенат в ванну с температурой 60 ° C на 30 минут.
  2. По окончании инкубационного периода центрифугируйте гомогенат в течение 5 минут. при 14000 х г.
  3. Перенесите супернатант в новую пробирку.Добавьте 5 мкл раствора РНКазы A и инкубируйте при 37 ° C в течение 20 минут.
  4. Добавьте равный объем хлороформа / изоамилового спирта (24: 1). Перемешивайте на вортексе в течение 5 секунд, затем центрифугируйте образец в течение 1 минуты при 14000 g, чтобы разделить фазы. Перенесите верхнюю водную фазу в новую пробирку. Повторяйте эту экстракцию, пока верхняя фаза не станет прозрачной.
  5. Перенести верхнюю водную фазу в новую пробирку. Осаждают ДНК, добавляя 0.

Об авторе

alexxlab administrator

Оставить ответ