Выписка из протокола: Выписка из протокола общего собрания — образец 2020

Выписка из протокола: Выписка из протокола общего собрания — образец 2020

Выписка из протокола общего собрания — образец 2020

Скачать образец выписки из протокола общего собрания акционеров

Скачать образец выписки из протокола общего собрания ООО

Скачать образец выписки из решения общего собрания

Что такое протокол мероприятия

Протокол — это официальный документ, который ведется в письменном виде в ходе общего собрания людей, объединенных одним делом или проблемой. Общий сбор может быть у жильцов одного дома, акционеров или работников предприятия, а записывать результаты события сейчас требуют даже на родительских собраниях в школах. В резолюции отражают ход событий, перечень затрагиваемых вопросов и обсуждений, очередность выступлений и их основные тезисы, а также принятые решения.

Поскольку выписка из протокола общего собрания, образец которой представлен в статье, — это частичная копия стенограммы мероприятия, в которой содержатся краткие сведения и итог рассмотрения конкретного вопроса, в ней нужно указать полное наименование организации (юридического лица), дату проведения сбора, и сформулировать вопрос, который является основной темой фрагмента. При необходимости могут полностью копироваться абзацы текста, в которых приводятся принятые по вопросу решения. В юридических лицах такая форма документации используется для донесения новой информации. По сути она является основанием для изменений в производственных процессах организации и уточнения частностей. В этом случае делопроизводитель компании оформляет необходимое число копий и передает ответственным за исполнение лицам. Эти же копии впоследствии будут основным документом для контроля за исполнением принятых решений.

В отношении физических лиц фрагменты из документов, касающихся прав и законных интересов граждан, выдаются по их требованию, в порядке, установленном актуальным на сегодняшний день Указом Президиума ВС СССР от 04.08.1983 № 9779-X (ред. от 08.12.2003) «О порядке выдачи и свидетельствования предприятиями, учреждениями и организациями копий документов, касающихся прав граждан».

В каких случаях нужна

Чаще всего фрагменты резолюций требуются:

• для предоставления в финансовые организации;
• для ФНС или иных контролирующих органов;
• для предоставления информации участникам общества в части, их касающейся;
• при обращении заинтересованных лиц по вопросам, которые были рассмотрены.

Как написать выписку из протокола собрания

Составлением подобной документации занимается секретарь организации или сотрудник, ответственный за делопроизводство. Единого регламентированного порядка составления этого документа не разработано. Существуют лишь общепринятые правила оформления:

• начинаться она должна со слов «Выписка из протокола общего собрания…»;
• в вводной части текста указывают количество участников события и основные реквизиты протокола;
• указывается не только суть вопроса, но и его номер (пункт), под которым он фигурирует в основном документе;
• составитель — тот, кто подписывает выписку из протокола общего собрания, после текста пишет фразу «Выписка верна», расшифровывает свою подпись, должность и также указывает дату составления;
• подпись составителя и верификация дополняются печатью организации.

В документах для внутреннего пользования заверить документ может секретарь, а вот копия для внешних организаций заверяется обязательно руководством.

Копии выписок имеют разный срок хранения. В зависимости от важности затронутых во время заседания вопросов, они могут храниться от 5 до 75 лет (пункты 415 и 656 перечня, утвержденного Приказом Минкультуры России от 25.08.2010 № 558).

Выписка из протокола № 1

ВЫПИСКА

из протокола заседания Общественного совета

при министерстве имущественных отношений Ставропольского края от 17 мая 2017 г. № 1

г. Ставрополь

Вопросы повестки дня:	Проголосовали	Решили:
1. Определение председателя Общественного совета при министерстве имущественных отношений Ставропольского края и секретаря Общественного совета при министерстве имущественных отношений Ставропольского края	Единогласно	Избрать председателем Общественного совета при министерстве имущественных отношений Ставропольского края – Гурьянова В.М.; секретарем Общественного совета при министерстве имущественных отношений Ставропольского края – Кусакину О.Н.
2. Утверждение Плана основных мероприятий Общественного совета при министерстве имущественных отношений Ставропольского края на 2017 год	Единогласно	Утвердить План основных мероприятий Общественного совета при министерстве имущественных отношений Ставропольского края на 2017 год
3. Обсуждение проекта приказа министерства имущественных отношений Ставропольского края «Об утверждении требований к закупаемым отдельным видам товаров, работ, услуг в форме перечня»	Единогласно	Одобрить проект проекта приказа министерства имущественных отношений Ставропольского края «Об утверждении требований к закупаемым отдельным видам товаров, работ, услуг в форме перечня»

 

Выписка из протокола заседания конкурсной комиссии

Выписка из протокола

 

вакантной должности федеральной государственной гражданской службы в центральном аппарате Федерального агентства железнодорожного транспорта

(конкурсная комиссия)

__________________________________________________________________

27 января 2021 г.                             г. Москва                                         №_1  _

 

Решение комиссии:

1. Отказать в допуске к участию во втором этапе конкурса в связи с предоставлением документов не в полном объеме и с нарушением правил оформления: Кутикову В.В., Лятифову Ч.Н., Михайлову М.А., Терехову С.А., Онищенко М.В., Беликиной И.А., Камбулатову Г.М., Балаевой П.А.,                   Барсукову И.В., Глушкову А.А., Вавилову И.Г., Михрюкову А.Э., Помазуеву В.В.
2. Утвердить список кандидатов, допущенных к участию во втором этапе конкурса:

Наименование вакантной должности	Ф.И.О. кандидата
ведущий специалист-эксперт отдела бухгалтерского учета Управления экономики и финансов	Гудаев И.Б.
	Илясова Е.Ф.
	Миндзяк И.С.
	Хисаметдинова О.Ю.
главный специалист-эксперт отдела перевозок Управления инфраструктуры и перевозок	Великих В.Г.
	Гаджиев В.А.
	Мамичев Р.Н.
	Холиков Б.Б.
главный специалист-эксперт отдела кадров и государственной службы Административного управления	Апалькова Л.С.
	Гудаев И.Б.
	Косарев Р.А.
	Пасюк И.А.
	Петров А.А.
	Шахова В.Ю.
начальник отдела документационного обеспечения и архивов Административного управления	Гудаев И.Б.
	Дзагоев А.С.
	Каташов А.А.
	Мархель В.В.
	Олейник А.В.
	Пасюк И.А.
	Симонова С.В.
	Синюхин В.Н.
	Чабанов М.П.

3. Конкурсные процедуры оценки профессиональных и личностных качеств кандидата – тестирование, индивидуальное собеседование.

 

Второй этап конкурса состоится 12.02.2021 в 11 час.30 мин. по адресу:                г. Москва, ул. Старая Басманная д. 11/2 стр. 1, каб. № 213.

При себе иметь паспорт.

Контактный телефон: (499) 550-3436, доб.1074.

Выписка из протокола заседания Правления (2016 год) — Документы — Главная — Региональная энергетическая комиссия Свердловской области официальный сайт

1.	28 декабря 2016 Выписка из протокола заседания Правления (2016 год) Региональной энергетической комиссии Свердловской области от 28.12.2016 № 41 ПАО Т Плюс (ТЭ)  (274 Кб) Тип: Протоколы заседаний Правления
2.	28 декабря 2016 Выписка из протокола заседания Правления (2016 год) Региональной энергетической комиссии Свердловской области от 28.12.2016 № 41 ПАО «Т Плюс» (ТН)  (160 Кб) Тип: Протоколы заседаний Правления
3.	28 декабря 2016 Выписка из протокола заседания Правления (2016 год) Региональной энергетической комиссии Свердловской области от 28.12.2016 № 41 ПАО «Т Плюс» (ОГВС)  (173 Кб) Тип: Протоколы заседаний Правления
4.
5.
6.	26 декабря 2016 Выписка из протокола заседания Правления (2016 год) Региональной энергетической комиссии Свердловской области от 26.12.2016 № 40 Каменский ГО — ГАЗЭКС  (124 Кб) Тип: Протоколы заседаний Правления
7.
8.	26 декабря 2016 Выписка из протокола заседания Правления (2016 год) Региональной энергетической комиссии Свердловской области от 26.12.2016 № 40 ГО Ревда (перевозки)  (111 Кб) Тип: Протоколы заседаний Правления
9.	26 декабря 2016 Выписка из протокола заседания Правления (2016 год) Региональной энергетической комиссии Свердловской области от 26.12.2016 № 40 Нижний Тагил (перевозки)  (109 Кб) Тип: Протоколы заседаний Правления
10.

ВЫПИСКА ИЗ ПРОТОКОЛА заседания Совета по учебной и производственной практике № 5 :: КГПУ им. В.П. Астафьева

ВЫПИСКА ИЗ ПРОТОКОЛА заседания Совета по учебной и производственной практике № 5 от 23.12.2010г.      Присутствовали: Дроздова И.А. — начальник отдела практики, председатель заседания; Гавро М.И. — методист отдела практики, секретарь заседания, исторический факультет; Авдеева Т.Г. — заведующий педпрактикой;  Адольф В.А. — зав. кафедрой педагогики; Алисова Г.П. — факультет иностранных языков; Антипова Е.М. — факультет естествознания; Арнольд Е.В. — факультет естествознания; Бережная О.В. — факультет естествознания; Бочарова Ю.Ю. — факультет педагогики и психологии детства; Верхотурова Н.Ю. — институт специальной педагогики; Вдовин А.С. — исторический факультет; Дамова Л.В. — факультет иностранных языков; Дубовик Е.Ю. — факультет педагогики и психологии детства; Дурова И.А. — институт специальной педагогики; Жуков У.В. — кафедра ТП; Залезная Т.А. — факультет физики, информатики и ВТ; Захарова Т.К. — факультет естествознания; Карнаухова Н.Ю. — факультет начальных классов; Карпова С.В. — факультет начальных классов; Корнилова Ю.В. — факультет физики, информатики и ВТ; Крипан О.И. — сотрудник центра трудоустройства и сопровождения карьеры студентов и выпускников; Куркотова Е.А. — ИППУО; Ларикова Л.В. — зав. кабинетом кафедры ТП; Латынцев С.В. — факультет физики, информатики и ВТ; Луценко Е.В. — ФФКиС; Люлина Н.В. — ФФКиС;  Маланчук И.Г. — зав. кафедрой психологии; Мельникова В.И. — факультет начальных классов; Мясникова Н.И. — ФФКиС; Новобранцев А.С. — начальник центра трудоустройства и сопровождения карьеры студентов и выпускников; Симонова А.Л. — факультет информатики и ВТ; Ситничук С.С. — ФФКиС; Смолина Л.Н. — факультет начальных классов;  Смолина Н.А. — институт специальной педагогики; Тумашева О.В. — факультет математики и информатики; Шандыбо С.В. — методист центра управления качеством образования; Шкерина Т.А. — ИППУО.      Повестка: Влияние педагогической практики на выбор будущего места работы студентами КГПУ им В.П. Астафьева. Обсуждение проекта стандарта учебно-методического комплекса практики в связи с переходом на ФГОС ВПО третьего поколения. Подведение итогов аудита УМКП на факультетах/институтах. Подведение промежуточных итогов второго тура конкурса педагогического мастерства среди студентов «Учитель, которого ждут!». Разное.          1 вопрос:      Постановили: Составить более корректные вопросы совместно с кафедрой педагогики, психологии и социологическим центром КГПУ им В.П. Астафьева.      2 вопрос:      Постановили: Принять информацию к сведению. Внести предложения от факультетов/институтов до 15 января 2011 года.      3 вопрос:      Постановили: Принять информацию к сведению.      4 вопрос      Постановили: Принять информацию к сведению.      5 вопрос (1. о сдаче отчетов; 2. о работе с документацией):      Постановили: Сдать перечисленные отчеты по практике до 31 декабря 2010 года. Принять информацию к сведению.     Председатель заседания Совета по учебной и производственной практики                                                                                             И.А. Дроздова      Секретарь заседания                                                                                                                                  М.И. Гавро

Официальный интернет-портал Администрации Томской области — Ошибка

array
(
    'code' => 404
    'type' => 'CHttpException'
    'errorCode' => 0
    'message' => 'Невозможно обработать запрос \"anticorruption/front/viewfile/id/1699\".'
    'file' => '/var/www/production/yii/framework/yiilite.php'
    'line' => 1803
    'trace' => '#0 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1719): CWebApplication->runController(\'anticorruption/...\')
#1 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1236): CWebApplication->processRequest()
#2 /var/www/production/public/index.php(72): CApplication->run()
#3 {main}'
    'traces' => array
    (
        0 => array
        (
            'file' => '/var/www/production/yii/framework/yiilite.php'
            'line' => 1719
            'function' => 'runController'
            'class' => 'CWebApplication'
            'type' => '->'
            'args' => array
            (
                0 => 'anticorruption/front/viewfile/id/1699'
            )
        )
        1 => array
        (
            'file' => '/var/www/production/yii/framework/yiilite.php'
            'line' => 1236
            'function' => 'processRequest'
            'class' => 'CWebApplication'
            'type' => '->'
            'args' => array()
        )
        2 => array
        (
            'file' => '/var/www/production/public/index.php'
            'line' => 72
            'function' => 'run'
            'class' => 'CApplication'
            'type' => '->'
            'args' => array()
        )
    )
) Официальный интернет-портал Администрации Томской области — Ошибка | Администрация Томской области

404

Просим прощения, ведутся технические работы

/var/www/production/yii/framework/yiilite.php at line 1803

#0 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1719): CWebApplication->runController('anticorruption/...')
#1 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1236): CWebApplication->processRequest()
#2 /var/www/production/public/index.php(72): CApplication->run()
#3 {main}

Extract Protocol Refactoring (Swift) — Повышение общего поведения

Extract Protocol позволяет нам обобщать наши типы.

Контекст: у вас есть класс (или другая сущность), и в некоторых случаях вы хотите, чтобы его место занял другой класс.

Другой класс можно сделать подклассом. Но это очень тесно связывает два класса. Кроме того, если есть только несколько общих методов, может даже не иметь смысла быть подклассом.

Или вы можете ввести протокол, который будут реализовывать оба класса.Протокол определяет методы (и, возможно, свойства), которые должен реализовывать тип.

Механика

(Описание «Extract Protocol» основано на подходе, аналогичном «Extract Interface», описанному Мартином Фаулером в Refactoring .)

1. Создать пустой протокол:

 протокол P {} 

или, если вы хотите ограничить его реализациями классов (в отличие от структур или перечислений):

 протокол P: AnyObject {} 

Можно запускать тесты, но проблем быть не должно.

2. Орудие марки A P:

 класс A: P {…} 

или (если у него уже есть родители):

 класс A: существующие протоколы родительского или родительского контроля, P {…} 

Вы можете запускать тесты; проблем быть не должно.

3. Скопируйте все необходимые переменные из класса в протокол

 var v: Введите {get set} 

и методы

 функция f (аргументы) -> ReturnType 

Вы можете запускать тесты после перемещения любого из них.

4. Преобразование использования A в тип P.

Пример:

 func f (что-то: A)
     =>
func f (что-то: P) 

Вы можете запускать тесты после перевода любого клиента на новый протокол.

• Одновременно можно работать с одним сайтом для звонков. Если вы получили какие-либо предупреждения об отсутствующих (полях или) методах, вернитесь к шагу 3 и добавьте недостающее объявление в протокол.
• У вас могут быть некоторые клиентские сайты, которым все еще нужно сохранить тип A, но внимательно подумайте, может ли протокол что-то упустить.

5. Запустите тесты и убедитесь, что все в порядке.

Этот рефакторинг «опирается на компилятор», чтобы сообщить вам, пропустили ли вы что-нибудь в интерфейсе вашего протокола.

Пример

SortedTable — это двумерный массив, который можно сортировать. (Обрезано из более крупного примера.)

  class SortedTable {
    init ([[Строка]]) {…}
    func rows () -> Int {…}
    func columns () -> Int {…}
    подстрочный индекс (r: Int, c: Int) -> String {…}
    func sort () {…}
}  

Нам нужны новые версии этого класса, например.g., тот, который читает из базы данных, или тот, который обертывает этот класс дополнительными функциями.

1. Создать пустой протокол

 протокол SortableTable {} 

2. Заставьте класс реализовать это.

 class SortedTable: SortableTable {
    // отдыхаем как раньше
} 

3. Скопируйте определения методов из класса в протокол:

Протокол

 SortableTable {
    func rows () -> Int
    func columns () -> Int
    func sort ()
} 

Мы «случайно» опустили нижний индекс.

4. Поменяйте местами, которые относятся к классу, чтобы вместо этого использовать протокол:

 var model = SortedTable (array2d)
    =>
модель var: SortableTable = SortedTable (array2d) 

Мы видим синтаксическую ошибку ниже:

Модель

 [r, c] <---- нет такого метода 

Вернитесь к шагу 3 и добавьте индекс в протокол.

 протокол SortingTable {
    . . .
    подстрочный индекс (r: Int, c: Int) -> String
} 

Теперь все работает и работает правильно.Если у вас есть новый класс, поддерживающий этот интерфейс, вы можете добавить его, не меняя ничего, кроме вызова конструктора.

Метод извлечения ядер и объяснение того, как он работает

Вы когда-нибудь покупали набор в биотехнологической компании и следовали инструкциям только для того, чтобы понять, что вы даже не уверены в , почему вы делаете определенные шаги предписанным способом?

Я обычно использую специальный комплект для извлечения ядер.Быстрый поиск в Google по запросу «извлечение ядер» даст множество наборов для этой задачи. Неудивительно, что во многих наборах нет информации о составе реагентов. В результате многие ученые слепо следуют инструкциям набора, не зная, почему выполняются определенные действия.

Ядерная добыча? Что это?

Итак, что же такое извлечение ядер? Ядерная экстракция - это процесс разделения ядерной и цитоплазматической фракций клетки. Эта процедура используется вместо протоколов лизиса целых клеток [например, с использованием буфера для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA)], потому что лизис целых клеток просто разрушает всю клетку, в результате чего образуется смесь цитоплазмы и ядра.Ядерная экстракция может быть полезна для изучения молекул, которые специфически взаимодействуют с ядром, например факторов транскрипции, связывающих ДНК.

В старые добрые времена, до появления серийных наборов, ядерная экстракция выполнялась путем смешивания нескольких стандартных лабораторных ингредиентов. Конечно, процедура все еще может быть выполнена таким образом (просто нажмите Google еще раз, и должны появиться некоторые домашние рецепты!). Мы надеемся, что эта статья поможет вам понять причину шагов по извлечению ядер.

Пошаговое руководство по экстракции ядер

Сначала клетки собирают путем трипсинирования или соскабливания, а затем промывают фосфатно-солевым буфером (PBS). Это делается так же, как вы обычно собираете клетки для лизиса целых клеток. Как и во всех протоколах экстракции клеток, экстракцию необходимо проводить на льду и с ингибиторами протеаз и фосфатаз.

1. Приостановить осадок клеток в гипотоническом буфере. Это разрушает клеточную стенку, но сохраняет неповрежденной ядерную мембрану (см. Cytoplasmic Extraction Buffer в таблице ниже).
2. Добавьте детергент (например, NP40) и встряхните, чтобы отделить ядра от цитоплазматической фракции. SDS не рекомендуется, так как он денатурирует, и экстрагированные белки не будут в своей нативной форме.
3. Центрифугируйте раствор и соберите супернатант (который должен содержать цитоплазму).
4. Ресуспендируйте осадок (содержащий ядра) в буфере для ядерной экстракции (см. Таблицу Nuclear Extraction Buffer ниже), который разрывает ядерную мембрану. Глицерин часто включается в этот буфер, поскольку он помогает сохранить замороженные экстракты для функциональных экспериментов (например, анализов сдвига электрофоретической подвижности, которые оценивают способность ядерного белка связываться с ДНК).
5. Центрифугируйте на высокой скорости и соберите надосадочную жидкость (ядерную фракцию). Теоретически конечный осадок должен состоять только из остатков клеточной мембраны, которые можно выбросить.

Вот примеры рецептов буферов для начала.

Буфер для экстракции цитоплазмы

Реактив	Назначение
10 мМ HEPES	Буфер
1,5 мМ MgCl 2	Соль для лизиса клеток
10 мМ KCl	Соль, для лизиса клеток.В качестве альтернативы концентрацию KCl можно увеличить до 60 мМ, а MgCl 2 опустить.
0,5 мМ DTT	Антиоксидант
1 мМ ЭДТА	Буфер. Исключено в некоторых рецептах
0,05% NP40	Моющее средство. Заменители: 0,05% IGEPAL® или Tergitol ™
pH 7,9

Буфер для ядерной экстракции

Реактив	Назначение
5 мМ HEPES	Буфер.Заменитель: TrisCl *
1,5 мМ MgCl 2	Соль, для лизиса клеток. Заменитель: KCl *
300 мМ NaCl	Соль, для лизиса клеток
0,2 мМ ЭДТА	Буфер. Исключено в некоторых рецептах.
0,5 мМ DTT	Антиоксидант
26% глицерин	Сохраняет функциональность белка во время замораживания
pH 7,9

* См. Рецепты в ссылках ниже для получения информации о рекомендуемых концентрациях.

А теперь несколько советов!

• На этапах, связанных с разрывом мембран (№1 и №4), для облегчения лизиса часто используется встряхивание. Однако иногда одного взбалтывания недостаточно. Для разрезания клеточного материала можно использовать тонкую иглу (например, 25G).
• На этапе извлечения ядра (№4) ядро ​​может быть трудно лизировать. Многие протоколы рекомендуют перемешивать на вортексе каждые несколько минут в течение от 30 минут до часа. По моему опыту, увеличение времени встряхивания и времени инкубации приводит к более высокому выходу ядерного белка.
• Не всегда соблюдайте объемы реагентов, рекомендуемые наборами. Уменьшение объема буфера для ядерной экстракции увеличит концентрацию ядерного белка. Это необходимо, если вы хотите получить ядерные и цитоплазматические экстракты сравнимых концентраций, поскольку общего ядерного белка почти всегда меньше, чем цитоплазматического белка.

Проверка результатов

После того, как вы выполнили экстракцию ядра, как вы узнаете, что у вас действительно есть ядро ​​в ядерной фракции и цитоплазма в цитоплазматической фракции? Вы можете определить чистоту ваших экстрактов с помощью вестерн-блоттинга для маркеров, которые, как известно, находятся в каждой из фракций.

Общие ядерно-специфические маркеры включают гистоны (те молекулы, которые ДНК любит обволакивать) и ТАТА-связывающий белок (который, как вы догадались, связывается с общей последовательностью ДНК, блоком ТАТА). Маркеры, специфичные для цитоплазмы, включают белки теплового шока (которые обычно находятся в митохондриях и не должны присутствовать в ядерных фракциях) и виментин (компонент цитоскелета).

Надеюсь, эта статья напомнит вам подумать о причинах, лежащих в основе ваших научных методов, удачи в извлечении ядер! Вы использовали ядерную добычу в своей работе? Делитесь своими советами в комментариях ниже!

Список литературы

Первоначально опубликовано 9 июля 2016 г.Проверено и обновлено 24 июля 2020 г.

Вам это помогло? Тогда поделитесь, пожалуйста, со своей сетью.

Оптимизированный протокол

для экстракции белков из митрального клапана человека

Белковый состав митрального клапана человека до сих пор частично неизвестен, поскольку его анализ затруднен из-за низкой клеточности и, следовательно, из-за низкого биосинтеза белка.Эта работа обеспечивает протокол для эффективного извлечения белка для анализа протеома митрального клапана.

Общая цель этой процедуры - эффективное извлечение белков из митрального клапана сердца человека, пригодных для протеомного анализа. Этот метод потенциально может помочь раскрыть патогенные механизмы в области сердечного клапана, что позволит идентифицировать новые диагностические и прогностические маркеры заболевания и, будем надеяться, терапевтические цели.Основное преимущество этого протокола заключается в том, что он обеспечивает эффективный рабочий процесс извлечения, совместимый со многими аналитическими приложениями.

Результаты представляют собой более исчерпывающую характеристику протеума сердечного митрального клапана. Более того, этот протокол также может быть применен к другим системам, таким как митральный клапан свиньи, который очень похож на человеческий клапан и используется в экспериментальной модели для оценки функции клапана. Экспериментальную процедуру продемонстрирует Стефания Гиларди, техник из моей лаборатории.

Чтобы подготовить митральный клапан человека, начните с эксплантированного сердца, которое находилось в условиях холодовой ишемии в течение 4–12 часов. В чистой комнате выньте сердце из транспортной сумки и поместите его в стерилизованное ведро. Затем перенесите сердце в шкаф биобезопасности.

Там с помощью одноразового скальпеля разрезают перпендикулярно большой оси на уровне левого и правого желудочков, примерно в четырех сантиметрах от верхушки. Затем положите сердце на стерильную салфетку. Затем отодвиньте восходящую аорту и легочную артерию, чтобы получить доступ к крыше левого предсердия.

На крыше левого предсердия с помощью пинцета и пинцета прорежьте левое предсердие, чтобы обнажить митральный клапан. Митральный клапан полностью находится в левом желудочке. Таким образом, обнажите большую митральную створку и малую митральную створку.

Переднебоковая и заднемедиальная комиссур определяют границу передней и задней области. Теперь с помощью ножниц и нетравматических щипцов рассеките левое предсердие и толщину стенки желудочка, которая окружает митральный клапан.Во время этого рассечения определите целостность митрального аортального клапана.

Затем отделите переднюю створку митрального клапана от задней створки митрального клапана, разрезая спайки, граничащие с задней створкой. По окончании процедуры продезинфицируйте стол в шкафу 70% раствором изопропилового спирта и 6% раствором перекиси водорода. Теперь промойте заднюю створку митрального клапана в физиологическом растворе.

Затем разрежьте клапан на маленькие кусочки, каждый меньше квадратного сантиметра.Оберните детали по отдельности в алюминиевую фольгу и быстро заморозьте их жидким азотом. Чтобы начать экстракцию белка, с помощью щипцов извлеките образец из жидкого азота и немедленно поместите его на сухой лед.

Не позволяйте образцу оттаивать. Затем в колбу Дьюара, наполненную жидким азотом, поместите ступку, соответствующие пестики и образец. Очень важно, чтобы жидкий азот использовался для замораживания образца и охлаждения системы измельчения.

Этот шаг предотвращает биологическое разложение и обеспечивает эффективное измельчение, но требует технической подготовки для безопасного обращения.После быстрой заморозки поместите ступку и пестики в пенополистироловую коробку с сухим льдом. Также поместите лопатку на сухой лед.

Затем снимите образец с фольги и погрузите его в ступку. И поместите над ним пест побольше. Используя отвертку, вращая пестик, измельчите образец от 15 до 20 раз.

При измельчении перемешайте образец кончиком охлажденного шпателя. После использования большого пестика повторите процесс измельчения с меньшим пестиком. Получение мелкодисперсного порошка имеет решающее значение для эффективного извлечения белка.

Теперь перелейте порошкообразный образец в 15-миллилитровую центрифужную пробирку известной массы. Затем смажьте оставшийся материал в растворе с помощью холодного шпателя. Держите пробирку с образцом на сухом льду и быстро определите массу образца.

Затем перелейте образец в стеклянную трубку гомогенизатора. Затем добавьте 200 микролитров буфера мочевины на каждые 10 миллиграммов образца. При этом удалите остатки, оставшиеся в пробирке, промыв их аликвотой буфера мочевины.

Теперь гомогенизируйте образец, используя моторизованный пестик из PFTE, работающий при 1500 об / мин.Медленно прижмите пестик к образцу 10 раз вращающими движениями. Затем перенесите вязкий желтый супернатант в чистую центрифужную пробирку на 1,7 миллилитра с помощью стеклянной пипетки.

Теперь повторите гомогенизацию оставшегося образца, используя вдвое меньше мочевины. Соберите супернатант и объедините его с предыдущим сбором. Затем поместите пробирку на вращатель пробирок на 30 минут.

Через 30 минут поместите пробирку в холодную центрифугу и замедлите вращение образца при 13 000 G в течение получаса.Затем соберите супернатант. И измерьте концентрацию белка с помощью анализа белка Брэдфорда.

После выполнения предписанного протокола белковый экстракт исследовали с помощью различных методов после дополнительных обработок. Всего 422 белка были идентифицированы в ткани митрального клапана с помощью двумерного электрофореза, жидкофазного изоэлектрического фокусирования, жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии и 2D жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. 422 белка были классифицированы с использованием анализа генной онтологии.

Внеклеточные области содержали несколько ожидаемых белков и других внутриклеточных белков и белков клеточной поверхности. Многие из них были впервые обнаружены в митральных клапанах. Наличие четырех таких белков, ранее не идентифицированных в митральных клапанах, было подтверждено антителами в трех уникальных образцах.

Белки - это септин-11, четыре с половиной домена LIM, белок один, дерматопонин и альфа-кристаллический B. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как извлекать белки из сердечного митрального клапана для их идентификации и количественная оценка.После освоения этого протокола можно выполнить почти два часа при правильном выполнении. При выполнении этой процедуры для получения максимального выхода белков с высокой целостностью белка жизненно важно, чтобы образцы не таяли во время переноса.

Быстрый и эффективный метод извлечения ДНК из костного порошка

Основные моменты

•

Новый протокол, который позволяет извлекать ДНК из костного порошка в течение часа.

•

Процесс полуавтоматический.

•

Выявлены ключевые элементы процесса.

•

Требуются небольшие начальные количества костного порошка.

•

Особенно ценно для больших наборов образцов приемлемого качества, как в случае DVI.

Abstract

После стихийного бедствия останки костей и зубов часто представляют собой лучший ресурс для идентификации жертвы, поскольку ДНК лучше сохраняется в кальцинированном матриксе. Быстрая идентификация жертв стихийных бедствий (DVI) имеет первостепенное значение для быстрого предоставления точных ответов родственникам, но профилирование ДНК по костям - это трудоемкий процесс.Как правило, наилучшие результаты профилирования достигаются при использовании протоколов деминерализации, направленных на полное растворение костного матрикса и высвобождение ДНК. Эти протоколы часто занимают 12 часов и более. Здесь мы описываем разработку быстрого полуавтоматического метода выделения ДНК, основанного на частичной деминерализации. ДНК извлекается из тонко измельченного костного порошка в течение часа. Ручная обработка минимальна, а процесс экстракции автоматизирован, как только образцы загружаются в прибор Promega Maxwell FSC.Мы оценили, насколько важны различные этапы протокола: очень мелкое гранулирование и полное разделение остатков костного порошка и ДНК-содержащего супернатанта были определены как наиболее важные. Это полное разделение было достигнуто за счет использования пробирок Hamilton AutoLys перед загрузкой в ​​прибор Maxwell FSC. Несмотря на то, что протокол не полностью растворяет костный матрикс и, следовательно, не извлекает всю ДНК, присутствующую в образце кости, хорошие результаты были получены с образцами кости до 44 погребальных лет.

Ключевые слова

Криминалистика

Идентификация жертв стихийного бедствия

Кость

ДНК

Извлечение

Деминерализация

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

© 2020 Автор (ы). Опубликовано Elsevier B.V.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Протокол экстракции дрожжевых метаболитов, оптимизированный для анализа временных рядов

Abstract

Все чаще требуется абсолютная количественная оценка данных метаболитов с временным разрешением.Однако существует ряд технических проблем, таких как изменение / разложение метаболитов химическим или ферментативным путем в процессе экстракции. Кроме того, масс-спектрометрия с капиллярным электрофорезом (CE-MS) несовместима с высокими концентрациями соли, часто используемыми в протоколах экстракции. В микробных системах выход метаболитов зависит от используемого протокола экстракции и скорости разрушения клеток. Здесь мы представляем метод, который быстро гасит метаболизм с использованием этанольной ванны со льдом и раствора метанола N -этилмалеимида (таким образом стабилизируя тиолы), эффективно разрушает клетки с помощью взбивания шариков и позволяет избежать артефактов, создаваемых гранулированием живых клеток.Быстрая обработка образцов сводит к минимуму выщелачивание метаболитов. Вес, количество и распределение клеток по размерам использовали для расчета метаболитов до уровня аттомола / клетки. Мы применяем этот метод к образцам, полученным в результате дыхательных колебаний, возникающих при непрерывном выращивании дрожжей.

Образец цитирования: Sasidharan K, Soga T, Tomita M, Murray DB (2012) Протокол экстракции дрожжевого метаболита, оптимизированный для анализа временных рядов. PLoS ONE 7 (8): e44283. https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0044283

Редактор: Mick F. Tuite, Кентский университет, Соединенное Королевство

Поступила: 25.06.2012; Одобрена: 31 июля 2012 г .; Опубликовано: 29 августа 2012 г.

Авторские права: © Sasidharan et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Авторы благодарны городу Цуруока и префектуре Ямагата за поддержку этой работы. Частично эта работа финансировалась совместным грантом JST-BBSRC. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Для всестороннего in vivo понимания динамики основных структур реакций метаболитов, кинетики ферментов и передачи сигналов требуется точная характеристика внутриклеточных метаболитов в определенные моменты времени.Последние достижения в области масс-спектрометрии с высокой пропускной способностью позволяют проводить подробный анализ всего метаболома с высокой точностью [1] - [4]. Однако разработка протоколов экстракции метаболитов в целом отставала от методов обнаружения. Эти протоколы часто страдают от сложной экспериментальной конструкции (затрудняющей анализ временных рядов), утечки метаболитов во время обработки, окисления метаболитов во время отбора проб / экстракции [5], [6] и специфичности метаболитов (кислотоустойчивые или щелочно-стабильные метаболиты).Кроме того, на урожайность влияют состояние метаболизма (фаза и скорость роста) и свойства используемых видов и / или штаммов [7] - [10]. Это приводит к парадоксальной ситуации, когда протокол экстракции диктует условия эксперимента. Идеальный протокол экстракции метаболитов должен быстро отбирать образцы и подавлять основные метаболические процессы, то есть сводить к минимуму деградацию и модификацию метаболитов и иметь высокий и воспроизводимый выход [7], [10], [11].

Скорость оборота промежуточных продуктов метаболизма изменяется в течение нескольких секунд и очень чувствительна к изменениям внешних условий, поэтому требуется быстрое тушение [10], [12], [13].Поэтому следует избегать прямого центрифугирования или фильтрации живых клеток перед гашением, поскольку они могут изменить профиль метаболитов [7], [10]. Однако удаление и последующий анализ культуральной среды очень желательны и должны выполняться быстро, чтобы избежать влияния на внутриклеточные концентрации метаболитов [5], [7], [10]. Кроме того, культуральная среда может содержать достаточно высокую концентрацию солей, которые могут подавлять сигналы или мешать стадии хроматографии / электрофореза.

Существует несколько методов, широко используемых для извлечения метаболитов из дрожжевых клеток, таких как замораживание-оттаивание, обработка ультразвуком, горячая вода, кипячение этанола, проницаемость с использованием хлороформа и обработка при экстремальных значениях pH. Однако эти методы в основном оптимизированы и тестируются только на быстрорастущих лабораторных штаммах с низкой плотностью [9], [11] - [13], а в экстракционных буферах часто используются соли, несовместимые с масс-спектрометрией с капиллярным электрофорезом (CE-MS ). Более того, нелабораторные штаммы обычно ограничены питательными веществами, медленно растут и не поддаются лизису.Это сопротивление возникает из-за изменений в структуре клеточной стенки [14], [15]. Эти физиологические изменения приводят к различиям в эффективности экстракции метаболитов и воспроизводимости, которые являются критическими факторами для анализа культур, выращенных в разных условиях.

Комбинированное химико-механическое разрушение путем взбивания шариков из диоксида циркония / диоксида кремния имеет высокую и стабильную эффективность разрушения клеток, независимо от состояния дыхания и цикла клеточного деления [16]. Также было замечено, что метаболические реакции Saccharomyces cerevisiae могут быть эффективно гасятся в метаноле (конечная концентрация метанола> 50% об. / Об.) При -40 ° C и с очень низким выщелачиванием метаболитов при удалении среды [5] , [12].Кроме того, экстракция смесью хлороформ-метанол использовалась для количественной экстракции метаболитов быстрорастущих, подавленных глюкозой лабораторных штаммов S. cerevisiae [9], [11], [12], [17]. Используемая методика проницаемости отнимала много времени (45 мин), и известно, что многие лабораторные штаммы были отобраны из-за их способности легко разрушаться. Любых модификаций метаболитов, происходящих во время процедуры экстракции, можно частично избежать, поддерживая низкую температуру (<-20 ° C) на протяжении всего процесса экстракции [10].Однако окисление метаболитов остается проблемой, например, точное количественное определение окислительно-восстановительного состояния тиоловых групп имеет решающее значение для понимания окислительно-восстановительной биохимии in vivo [18]. Однако окисление тиоловых групп во время экстракции обычно затрудняет точное определение окислительно-восстановительного состояния [6].

Ранее мы разработали эффективные методы разрушения почкующихся дрожжей на мРНК, белки и ДНК [16]. Мы оптимизировали эти методы для анализа метаболитов, которые быстро извлекают и фракционируют внутриклеточные и внеклеточные метаболиты.Наш метод был основан на быстром тушении клеточных культур раствором метанола -80 ° C и N, -этилмалеимида (NEM). Здесь NEM использовался для защиты тиолов от окисления путем связывания с группами -SH (рисунок 1) [19]. Гашающий раствор (который содержит внеклеточные метаболиты) был быстро удален и лиофилизирован. Осадки клеток измельчали ​​в растворе хлороформ / метанол / внутренний стандарт (IS). Внутриклеточные и внеклеточные метаболиты анализировали с помощью CE-MS. Параллельно мы фиксировали образец в этаноле для определения массы сухих клеток и количества клеток.Мы протестировали наш метод на непрерывно выращиваемых промышленных культурах S. cerevisiae , и он превзошел другие протестированные методы экстракции (замораживание-оттаивание и обработка ультразвуком), защитил окислительно-восстановительное состояние клетки, имеет потенциал покрыть большую часть известного метаболома дрожжей. , и дала выходы, сопоставимые с указанными значениями для экстрагированных метаболитов из клеток, выращенных в аналогичных условиях.

Рис. 1. Общая схема реакции N -этилмалеимида на биологические тиолы.

Образованный продукт представляет собой конъюгат N -этилсукцинимидо, и моноизотопная масса реагента увеличивается на 125,048. Например, конъюгат глутатиона (m / z 308.0911) представляет собой N -этилсукцинимидо-S-глутатион (m / z 433,1391).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044283.g001

Методы

Штамм и условия культивирования

Если не указано иное, все химические вещества были поставлены Wako Chemicals, Япония или Fisher Chemicals, UK.В данном исследовании мы использовали диплоидный штамм IFO 0233 Saccharomyces cerevisiae . Колонии поддерживали при 4 ° C на чашках с агаром с дрожжевым экстрактом, пептон-декстрозой (YEPD), содержащим 10 г / л дрожжевого экстракта (Becton Dickinson, Япония / Великобритания), 20 г / л моногидрата глюкозы, 20 г / л микологического пептона (Becton Дикинсон, Япония / Великобритания) и 30 г / л агара (Becton Dickinson, Япония / Великобритания). Предварительные культуры (10 мл; 0,5 × бульон YEPD) инокулировали дрожжевыми колониями и инкубировали (30 ° C) в орбитальном инкубаторе (250 об / мин) в течение 48 часов.Используемая основная среда состояла из 5 г / л (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 2 г / л KH ₂ PO ₄ , 0,5 г / л MgSO ₄ . 7H ₂ O, 0,1 г / л CaCl ₂ .2H ₂ O, 0,02 г / л FeSO ₄ .7H ₂ O, 0,01 г / л ZnSO ₄ .7H ₂ O, 0,005 г / л CuSO ₄ .5H ₂ O, 0,001 г / л MnCl ₂ .4H ₂ O, 0,5 мл / л 70% H ₂ SO ₄ , 1 г / л дрожжевого экстракта (Becton Dickinson, Япония), 0.2 мл / л Antifoam A (Sigma, США) и 20 мл / л этанола [20]. Клетки выращивали, как описано ранее, в модифицированном варианте биореактора MBF-250 (Eyela, Япония) при 30 ° C (± 0,02 ° C), pH 3,4 (± 0,03), скорости аэрации 0,150 л / мин (± 0,02 Л / мин), рабочий объем 650 мл, скорость перемешивания 750 об / мин (± 3 об / мин) и давление в реакторе поддерживали ниже 375 Па, выше атмосферного [21]. Перед запуском режима непрерывного культивирования периодические культуры выдерживали в ферментерах не менее 6 часов. Стабильные автономные респираторные колебания возникали через 16-48 ч после начала непрерывной культуры (степень разведения при 0.087 ч ^-1 ), а дыхание контролировали путем измерения содержания растворенного кислорода (DO) в культуре с использованием погруженного полярографического электрода (InPro6800, Mettler Toledo, Япония / Великобритания). Поскольку мы не могли измерить изменение биомассы или количества клеток во время непрерывного роста (биомасса была в стабильном состоянии), эта скорость разведения соответствует времени удвоения клеток, равному 8,1 ч [22].

Экстракция метаболита (рисунок 2)

Отбор проб и закалка.

Для исследования воспроизводимости (таблица 1) все пробы были взяты при минимальной концентрации растворенного кислорода во время колебаний.Принимая во внимание, что образцы временного ряда были получены с 4-минутными интервалами в течение двух циклов колебаний. Чтобы избежать мертвого объема в игле для отбора проб, 200 мкл удаляли за 5 с до получения 0,7 мл образца (газ и жидкость), а конец иглы шприца закрывали. Для быстрой дегазации образца поршень быстро удаляли и 500 мкл образца быстро переносили пипеткой в ​​1 объем свежеприготовленного раствора метанола NEM (4 мМ), хранимого в пробирках с завинчивающейся крышкой (1,5 мл; Simport, Канада), уравновешенных до -70 ° C. с использованием бани сухой лед / этанол.Затем образцы осаждали флэш-центрифугированием (20000 g; -9 ° C), и супернатант переносили в свежие 1,5-мл пробирки для измерения внеклеточных метаболитов (добавлены соответствующие стандарты; лиофилизировали и хранили при -80 ° C перед анализом). Процесс отбора фиксированных образцов занял около 10 с. Чтобы контролировать утечку метаболитов, эти образцы сравнивали с лиофилизированными образцами, которые быстро фильтровались через шприцевые фильтры с размером пор 0,2 мкм через 30 секунд. Через 30 с отбирали еще 1 мл культуры, дегазировали и добавляли к 1 мл этанола в предварительно взвешенных центрифужных пробирках на 2 мл.Образцы подвергали флэш-центрифугированию (20000 g; комнатная температура) и супернатант удаляли. Затем образцы клеточного осадка и внеклеточного метаболита были лиофилизированы, и образцы клеточного осадка были взвешены для определения биомассы, хотя здесь не определено, биомасса может быть дополнительно переработана для измерения состава биомассы. Еще 30 мкл культуры фиксировали 70 мкл этанола (комнатная температура) для определения количества и размера клеток.

Определение массы сухих клеток и количества клеток.

Вес сухих клеток рассчитывали путем взвешивания пробирки и лиофилизированного осадка от массы пробирки с использованием точных весов (+/- 0,1 мг, HR-202i, AND, Япония). Количество клеток и их объемное распределение измеряли с использованием счетчика частиц (отверстие 50 мкм, CDA-500, Sysmex, Япония) путем встряхивания фиксированных этанолом образцов в течение 30 с и внесения 2,5 мкл из пипетки в 19,9975 мл Manoresh ™ (Sysmex, Япония). Количество и объем клеток использовали для расчета средней концентрации метаболита (аттомол / клетка) для каждого образца.

Рисунок 3. Электрофореграммы глутатиона (GSH) и гомоцистеина (Hcys) и их производных NEM (ESG и ESHcys) в репрезентативных образцах с (красная линия) и без (зеленая линия) добавлением 2 мМ NEM.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044283.g003

Метод взбивания шариков из N-этилмалеимида.

Осадки клеток ресуспендировали в растворе внутреннего стандарта в метаноле (300 мкл; -70 ° C). Внутренние стандарты включали 2-морфолиноэтансульфоновую кислоту (MES; 10 нмоль), метионинсульфон (10 нмоль) и D-камфор-10-сульфоновую кислоту (CSA; 10 нмоль).Поскольку объем анализа составлял 50 мкл, конечное количество добавленного каждого стандарта доводили до 200 мкМ раствора при регидратации перед анализом. Затем добавляли хлороформ и деионизированную воду (конечное соотношение 1∶1∶0,5). Затем добавляли смесь охлажденных кислотно-промытых гранул диоксида циркония / диоксида кремния (∼300 мкл; 0,1 мм и 0,5 мм; 1-1; Tomy Seiko Co., Ltd., Япония) и образцы разрушали в шариках из нескольких пробирок. взбиватель (5500 об / мин; Micro Smash ™ MS-100, Томи, Япония), используя 12 циклов по 10 секунд, 30 секунд отдыха (для охлаждения) и 120 секунд отдыха после каждого третьего цикла, при включенном встроенном холодильном агрегате.Затем образцы центрифугировали (12000 g; 10 мин; -9 ° C), и водную фазу (если четкое разделение фаз не было получено, можно добавить больше воды и образцы смешать, а затем повторно центрифугировать) переносили на фракцию 5 кДа. сняли фильтровальные пробирки (Ultrafree®-MC, Millipore, США) и центрифугировали (20000 g; -9 ° C, пока супернатант не прошел через фильтр). На стадии фильтрации удаляются многие белки, а затем фильтрат лиофилизируется и хранится при -80 ° C перед анализом CE-MS. Для сравнения мы также экстрагировали метаболиты с использованием различных методов и условий разрушения клеток: (1) обработка ультразвуком, 20 мин, с гашением и без него (2) замораживание-оттаивание с использованием жидкого азота, оттаивание при -30 ° C, 10 раз (3) - избиение без обработки NEM (4) Обработка NEM после обработки шариками, с закалкой и без нее.Перед анализом образцы внутриклеточных метаболитов регидратировали в 50 мкл, а внеклеточные образцы регидратировали в 500 мкл воды Milli-Q, содержащей 200 мкМ 1,3,5-бензолтрикарбоксилата (анион) и дигидрохлорид 3-аминопирролидина (катион).

Аналитические методы капиллярного электрофореза

Во всех экспериментах CE-TOFMS мы использовали систему капиллярного электрофореза Agilent CE (Agilent Technologies, Вальдбронн, Германия), систему Agilent G3250AA LC / MSD TOF (Agilent Technologies, Пало-Альто, Калифорния), насос для бинарной ВЭЖХ серии Agilent 1100, адаптер G1603A Agilent CE-MS и комплект распылителя Agilent CE-ESI-MS G1607A.Сбор данных осуществлялся с помощью программного обеспечения G2201AA Agilent ChemStation для CE и программного обеспечения Analyst QS для Agilent TOFMS (Agilent technologies, Япония). Для определения профиля анионных метаболитов оригинальная игла ESI Agilent из нержавеющей стали была заменена платиновой иглой Agilent G7100–60041 [23].

Рис. 4. Тепловая карта калиброванных временных рядов внутриклеточных метаболитов во время респираторных колебаний (A) и временных рядов для АТФ (B), глутатиона (C) и аспартата (D) в S. cerevisiae .

Катионные и анионные данные показаны красным и синим (линии или заштрихованные области) соответственно. Соответствующее колебание растворенного кислорода (DO) представлено серой линией.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0044283.g004

CE-TOFMS условия для определения профиля катионных метаболитов.

Метаболиты разделяли в капилляре из плавленого кварца (внутренний диаметр 50 мкм x 100 см), заполненном 1 М муравьиной кислотой в качестве электролита [4]. Перед первым использованием новый капилляр промывали текущим электролитом (1 М муравьиной кислоты) в течение 20 мин.Раствор образца вводили при 5 кПа в течение 3 с (3 нл) и прикладывали напряжение 30 кВ. Температура капилляров и лоток для образцов были установлены на 20 ° C и ниже 5 ° C соответственно. Метанол: вода (50% об. / Об.), Содержащая 0,1 мкМ гексакис (2,2-дифторэтокси) фосфазена, подавалась в виде жидкости для оболочки со скоростью 10 мкл / мин. ESI-TOFMS работал в режиме положительных ионов, а капиллярное напряжение было установлено равным 4 кВ. Скорость потока нагретого сухого газообразного азота (температура нагревателя 300 ° C) поддерживалась на уровне 170 кПа. В режиме TOFMS напряжения фрагментатора, скиммера и Oct RFV были установлены на уровне 75, 50 и 125 В соответственно.Автоматическая повторная калибровка каждого полученного спектра проводилась с эталонными массами эталонных стандартов ([ ¹³ C изотопный ион протонированного димера метанола (2MeOH + H)] ⁺ ; m / z 66.0632) и ([гексакис (2,2-дифторэтокси ) фосфазен + H] ⁺ ; m / z 622.0290). Точные данные о массе получали со скоростью 1,5 спектров в секунду в диапазоне от 50 до 1000 m / z [24].

CE-TOFMS условия для определения профиля анионных метаболитов.

Покрытый катионным полимером капилляр COSMO (+) (50 мкм i.d. x 110 см) (Nacalai Tesque, Киото, Япония) использовали в качестве разделительного капилляра. 50 мМ раствор ацетата аммония (pH 8,5) использовали в качестве электролита для капиллярного разделения. Перед первым использованием новый капилляр последовательно промывали проточным электролитом, 50 мМ уксусной кислотой (pH 3,4), а затем снова электролитом в течение 20 мин. Перед каждой инъекцией капилляр уравновешивали в течение 2 минут промывкой 50 мМ уксусной кислоты (pH 3,4), а затем в течение 5 минут проточным электролитом.Раствор образца (30 нл) вводили при 5000 кПа в течение 30 с и приложенном напряжении -30 кВ. 5 мМ ацетат аммония в 50% (об. / Об.) Смеси метанол-вода, содержащей 0,1 мкМ гексакис (2,2-дифторэтокси) фосфазена, подавали в виде жидкости оболочки со скоростью 10 мкл / мин. ESI-TOFMS проводился при отрицательной ионизации; капиллярное напряжение было установлено на уровне 3500 В. При TOFMS напряжения фрагментера, скиммера и Oct RFV были установлены на уровне 100 В, 50 В и 200 В, соответственно. Автоматическая перекалибровка каждого полученного спектра была выполнена с использованием эталонных масс эталонных стандартов ([ ¹³ C изотопный ион депротонированного димера уксусной кислоты (2CH ₃ COOH-H)] ^-, m / z 120.03841) и ([гексакис (2,2-дифторэтокси) фосфазен + депротонированная уксусная кислота (CH ₃ COOH-H)] ^-, m / z 680.03554). Остальные условия были идентичны тем, которые использовались при анализе катионных метаболитов [23].

Анализ данных.

Сначала мы визуализировали необработанные данные в Analyst QS, чтобы проверить наличие проблем в CE-MS. Затем данные были преобразованы в формат mzXML с использованием mzWiff [25] для Agilent «.wiff» и trapper [26] для форматов Agilent «.d» с использованием следующих параметров:

mzWiff.exe -z -c1 -v –mzXML <имя файла>

trapper.exe -c -v –mzXML <имя файла>

Данные были затем загружены в пакет xcms [27] компании Bioconductor для дальнейшей обработки. Спектры КЭ-МС имеют тенденцию к значительному дрейфу, поскольку свойства колонки меняются со временем [28]. Из-за этого встроенные алгоритмы выравнивания в XCMS работают плохо. Поэтому пики были предварительно выровнены с использованием регрессионного анализа внутренних стандартов. Затем выравнивание было выполнено с использованием XCMS для наборов данных, где мы использовали метод matchedFilter и установили следующие параметры, bw = 8, mzwid = 0.25, fwhm = 6, snthresh = 5 и step = 0,1. Концентрации рассчитывали с использованием внешних стандартов, которые готовили и лиофилизировали еженедельно, а затем восстанавливали свежими перед каждым запуском. Этот свежеприготовленный высококачественный набор был подмножеством (61 анионный и 59 катионный) всего стандартного набора (272 анионных и 318 катионных; готовился и лиофилизировался ежемесячно), который также использовался (данные не показаны).

Результаты и обсуждение

Метаболом

Общая скорость восстановления внутреннего стандарта (средняя для всех взятых образцов) для 2- (N-морфолино) этансульфоната (анионного) составляла 89.2% ± 2,32% и метионинсульфон (катионный) 93,8% ± 3,8%. Эти стандарты были добавлены до измельчения, поэтому дают представление о выходе из протокола экстракции. Мы использовали три метода для извлечения метаболитов из дрожжевых клеток. Из них взбивание шариков показало лучшие результаты (таблица 1) с более высоким выходом большинства метаболитов. Замораживание-оттаивание, хотя и ограничивало количество этапов обработки, давало очень низкий, переменный выход. Ярким примером этого был выход АТФ и аминокислот, который был, по крайней мере, на порядок выше при взбивании шариков.Известно, что гашение метанолом перед экстракцией вызывает вымывание метаболитов [8], однако удаление клеток из среды с помощью центрифугирования и, в меньшей степени, фильтрации вызывает быстрые изменения в физиологии [29]. Поэтому любой метод закалки - это компромисс. Мы исследовали эффект гашения и обнаружили, что метаболиты, которые увеличивались между отфильтрованными образцами и супернатантом метанол-NEM, были глутаматом (5,03%), цитратом (2,85%), сукцинатом (8,34%) и пируватом (12,34%), и это были в пределах ошибки остаточных уровней отфильтрованных образцов.Что еще более важно, мгновенное центрифугирование (процесс 10 с) культур вызывало очень быстрые изменения всего метаболома (таблица 1). Например, [АТФ] снизился с 10,5 до 3,1 аттомоль / клетка, [АМФ] показал обратную тенденцию к увеличению с 1,3 до 6,8 аттомоль / клетку, предполагая, что АТФ быстро утилизируется при центрифугировании образцов. Были также значительные изменения в промежуточных продуктах цикла TCA, где содержание сукцината увеличивалось, цитрата уменьшалось, и НАДН становился обнаруживаемым при сравнении образцов с гашением и без гашения.Это указывает на то, что осаждение живых клеток может подавлять дыхательную цепь, возможно, ограничивая перенос кислорода.

Тиоловый анализ

Тиолы имеют решающее значение для понимания окислительно-восстановительной биохимии, и все протестированные методы не смогли измерить тиолы согласованным образом и дали гораздо более низкие концентрации, чем ожидалось. Поэтому мы использовали NEM, который связывается с группой -SH тиолов, таким образом защищая ее от окисления (рис. 1; цистеин, гомоцистеин, L-γ-глутамил-L-цистеин и восстановленный глутатион) [19].Спектры сравнивали для идентификации пиков, которые соответствовали NEM-конъюгированным тиолам (+125,048 масс; фиг. 3). Все тиоловые соединения можно было измерить с небольшой ошибкой (таблица 1), кроме того, пики также имели тенденцию перемещаться медленнее. Цистеин и L-γ-глутамил-L-цистеин могли быть обнаружены, а гомоцистеин и глутатион присутствовали в ~ 70 раз более высоких концентрациях по сравнению с образцами, обработанными ультразвуком или образцами, не обработанными NEM. NEM не взимается, поэтому избыток NEM не влияет на работу CE-MS.После экстракции образцы окисляли, поскольку концентрации тиоловых метаболитов были аналогичными для добавления NEM до или после взбивания гранул (таблица 1).

Анализ временных рядов

Затем мы проверили наши методы экстракции в экспериментальных условиях. При непрерывном росте почкующиеся дрожжи синхронизируют свою дыхательную активность, чтобы сформировать устойчивые дыхательные колебания [20], [30], период которых колеблется от 35 минут до 8 часов [31]. Мы измерили внутриклеточные метаболиты в течение двух циклов для S.cerevisiae (рисунок 4). Мы выделяем три метаболита, АТФ, глутатион и аспартат, концентрации которых ранее были определены другими методами в S. cerevisiae в аналогичных условиях [20], [32], [33]. Наш протокол экстракции позволил получить воспроизводимые временные ряды для всех откалиброванных метаболитов (рис. 4A), многие из которых имели устойчивые колебания. АТФ колебался (рис. 4B) с амплитудой 7–20 аттомоль / клетку (0,6–1,5 мМ), что находилось в диапазоне (1–2 мМ) недавних онлайн-измерений с использованием онлайн-наносенсоров [34].Конъюгат глутатион-NEM колебался (рисунок 4C) с амплитудой 120–205 аттомоль / клетку (8,4–14,2 мМ), что на порядок выше, чем ранее сообщаемые значения для GSH (0,6–1,2 мМ), экстрагированного хлорной кислотой во время колебания [35]. Мы утверждаем, что это увеличение выхода было связано с усилением разрушения, быстрым гашением и тиоловой защитой во время процесса экстракции. Аспартат представляет собой интересный пример кроссплатформенной репликации, поскольку он является кислой аминокислотой, поэтому его можно обнаружить в режимах анионного и катионного детектирования CE-MS (рис. 4D).Он колебался в диапазоне 37–56 аттомоль / клетка (2–4 мМ), что вдвое превышает ранее сообщаемые значения для экстракции горячей водой 1–2 мМ [33], [36]. Возможно, это увеличение урожайности было связано с отказом от стадий центрифугирования живых клеток.

Из данных временного ряда (рис. 4) видно, что ошибка между выборками и методами обнаружения CE-MS очень мала. Действительно, никакие из представленных здесь данных не были нормализованы по внутренним стандартам CE-MS (они использовались только для выравнивания хроматограмм).Как ни парадоксально, когда эта нормализация выполняется, данные становятся немного более шумными, возможно, из-за ошибок, вносимых во время операций дозирования малых объемов или интеграции.

Выводы

Здесь мы представляем протокол экстракции метаболитов дрожжей, который быстро подавляет метаболизм с использованием метанола-NEM при температурах ниже –40 ° C из небольшого объема культуры (0,5 мл). Было показано, что NEM защищает биологические тиолы от окисления на последующих этапах обработки образцов.Метод был протестирован на образцах, взятых во время респираторных колебаний, и было обнаружено, что он воспроизводим и дает эквивалентный или более высокий выход, чем предыдущие данные, в которых использовались другие протоколы экстракции и аналитические методы. Ни одна аналитическая платформа не может охватить весь объем метаболома, но наш метод удаляет ионное загрязнение из среды (что делает его совместимым с CE-MS), и, хотя он не протестирован, наш метод может быть расширен для анализа состава биомассы кислотный гидролиз биомассы с последующей ЖХ / ГХ-МС) и неполярные метаболиты (в фазе хлороформа экстракции с помощью ЖХ / ГХ-МС).Мы полагаем, что наши методы могут быть легко применены для надежного извлечения метаболитов из других микробных систем.

Благодарности

Мы благодарны Мартину Роберту (Университет Кейо) и Кену Хейнсу (Университет Эксетера) за их вклад в извлечение метаболитов и анализ данных. Мы также в долгу перед Казутакой Икедой, Маки Сугавара и Хироко Уэда за их техническую помощь и советы.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: KS TS DBM.Проведены эксперименты: KS DBM. Проанализированы данные: KS DBM. Внесенные реагенты / материалы / инструменты анализа: TS MT DBM. Написал статью: КС ТС ДБМ.

Ссылки

1. 1. Ban E, Park SH, Kang MJ, Lee HJ, Song EJ и др. (2012) Тенденция роста CE на уровне omics: граница системной биологии - обновление. Электрофорез 33: 2–13. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22139583. По состоянию на 12 января 2012 г.
2. 2. Buchholz A, Takors R, Wandrey C (2001) Количественная оценка внутриклеточных метаболитов в Escherichia coli K12 с использованием тандемных масс-спектрометрических методов жидкостной хроматографии и электрораспылительной ионизации.Аналитическая биохимия 295: 129–137. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11488613. По состоянию на 12 января 2012 г.
3. 3. Ohta D, Kanaya S, Suzuki H (2010) Применение масс-спектрометрии с ионным циклотронным резонансом с преобразованием Фурье для метаболического профилирования и идентификации метаболитов. Современное мнение в области биотехнологии 21: 35–44. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20171870. По состоянию на 12 января 2012 г.
4. 4. Сога Т., Охаши Ю., Уэно Ю., Нараока Х., Томита М. и др.(2003) Количественный анализ метаболома с использованием масс-спектрометрии с капиллярным электрофорезом. Журнал протеомных исследований 2: 488–494. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14582645. По состоянию на 3 октября 2011 г.
5. 5. Canelas AB, Ras C, Pierick A, Dam JC, Heijnen JJ, et al. (2008) Метод быстрого тушения без утечек для метаболомики дрожжей. Метаболомика 4: 226–239. Доступно: http://www.springerlink.com/content/n4w4117132644470/. По состоянию на 18 июня 2011 г.
6. 6. Sporty JL, Kabir MM, Turteltaub KW, Ognibene T., Lin S-J, et al.(2008) Протокол экстракции одного образца для количественной оценки окислительно-восстановительных состояний НАД и НАДН в Saccharomyces cerevisiae . Журнал науки о разделении 31: 3202–3211. Доступно: http: //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi? Artid = 2640230 & tool = pmcentrez & rendertype = abstract. По состоянию на 13 января 2012 г.
7. 7. Gonzalez B, François J, Renaud M (1997) Быстрый и надежный метод экстракции метаболитов из дрожжей с использованием кипящего забуференного этанола. Дрожжи (Чичестер, Англия) 13: 1347–1355.Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9392079. По состоянию на 5 сентября 2011 г.
8. 8. Виллас-Боас С.Г., Хойер-Педерсен Дж., Акессон М., Смедсгаард Дж., Нильсен Дж. (2005) Глобальный анализ метаболитов дрожжей: оценка методов подготовки проб. Дрожжи (Чичестер, Англия) 22: 1155–1169. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16240456. По состоянию на 29 ноября 2011 г.
9. 9. Bolten CJ, Kiefer P, Letisse F, Portais J-C, Wittmann C (2007) Отбор проб для анализа метаболомов микроорганизмов.Аналитическая химия 79: 3843–3849. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17411014. По состоянию на 26 июля 2011 г.
10. 10. de Koning W, van Dam K (1992) Метод определения изменений гликолитических метаболитов в дрожжах в субсекундной временной шкале с использованием экстракции при нейтральном pH. Аналитическая биохимия 204: 118–123. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1514678. По состоянию на 13 января 2012 г.
11. 11. Canelas AB, ten Pierick A, Ras C, Seifar RM, van Dam JC и др.(2009) Количественная оценка методов экстракции внутриклеточных метаболитов для метаболомики дрожжей. Аналитическая химия 81: 7379–7389. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19653633. По состоянию на 13 января 2012 г.
12. 12. Faijes M, Mars AE, Smid EJ (2007) Сравнение методологий тушения и экстракции для анализа метаболома Lactobacillus plantarum. Фабрики микробных клеток 6: 27. Доступно: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi? Artid = 2031893 & tool = pmcentrez & rendertype = abstract.По состоянию на 13 января 2012 г.
13. 13. Теобальд У., Майлинджер В., Балтес М., Рицци М., Ройсс М. (1997) Анализ метаболической динамики in vivo в Saccharomyces cerevisiae : I. Экспериментальные наблюдения. Биотехнология и биоинженерия 55: 305–316. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18636489. По состоянию на 13 января 2012 г.
14. 14. Эллиотт Б., Футчер Б. (1993) Стрессоустойчивость дрожжевых клеток в значительной степени не зависит от фазы клеточного цикла. Дрожжи (Чичестер, Англия) 9: 33–42.Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8442385. По состоянию на 22 декабря 2011 г.
15. 15. Klosinska MM, Crutchfield CA, Bradley PH, Rabinowitz JD, Broach JR (2011) Дрожжевые клетки могут получать доступ к различным состояниям покоя. Гены и развитие 25: 336–349. Доступно: http: //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi? Artid = 3042157 & tool = pmcentrez & rendertype = abstract. По состоянию на 27 ноября 2011 г.
16. 16. Sasidharan K, Amariei C, Tomita M, Murray DB (2012) Протоколы быстрой экстракции ДНК, РНК и белка, оптимизированные для медленно растущих культур дрожжей.Дрожжи. Доступно: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/yea.2911/abstract. По состоянию на 20 июня 2012 г.
17. 17. Bolten CJ, Wittmann C (2008) Соответствующий отбор образцов для анализа внутриклеточных аминокислот у пяти филогенетически разных дрожжей. Письма о биотехнологии 30: 1993–2000. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18604477. По состоянию на 13 января 2012 г.
18. 18. Murray DB, Haynes K, Tomita M (2011) Редокс-регуляция в дыхании Saccharomyces cerevisiae .Biochimica et biophysica acta 1810: 945–958. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21549177. По состоянию на 25 июля 2011 г.
19. 19. Д’Агостино Л.А., Лам К.П., Ли Р., Бритц-МакКиббин П. (2011) Комплексное определение окислительно-восстановительного статуса тиолов в плазме для метаболомики. Журнал протеомных исследований 10: 592–603. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21053925. По состоянию на 22 декабря 2011 г.
20. 20. Сатрутдинов А.Д., Курияма Х., Кобаяши Х. (1992) Колебательный метаболизм Saccharomyces cerevisiae в непрерывной культуре.Письма FEMS по микробиологии 77: 261–267. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1334018. По состоянию на 9 ноября 2011 г.
21. 21. Murray DB, Beckmann M, Kitano H (2007) Регулирование колебательной динамики дрожжей. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 104: 2241–2246. Доступно: http: //www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi? Artid = 1794218 & tool = pmcentrez & rendertype = abstract. По состоянию на 9 ноября 2011 г.
22. 22. Monod J (1950) Техника непрерывной культуры.Энн Инст Пастер 79: 390–410. Доступно: http://www.cabdirect.org/abstracts/19522202986.html. По состоянию на 27 июля 2012 г.
23. 23. Сога Т., Игараси К., Ито С., Мизобучи К., Циммерманн Х.-П и др. (2009) Метаболомное профилирование анионных метаболитов методом масс-спектрометрии с капиллярным электрофорезом. Аналитическая химия 81: 6165–6174. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19522513. По состоянию на 21 июня 2012 г.
24. 24. Сога Т., Баран Р., Суэмацу М., Уэно Ю., Икеда С. и др.(2006) Дифференциальная метаболомика показывает, что глазная кислота является биомаркером окислительного стресса, указывающим на потребление глутатиона в печени. Журнал биологической химии 281: 16768–16776. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16608839. По состоянию на 9 марта 2012 г.
25. 25. Программное обеспечение: mzWiff - SPCTools. Доступно: http://tools.proteomecenter.org/wiki/index.php? Title = Программное обеспечение: mzWiff. По состоянию на 21 июня 2012 г.
26. 26. Программное обеспечение: траппер - SPCTools. Доступно: http: // tools.proteomecenter.org/wiki/index.php?title=Software:trapper. По состоянию на 21 июня 2012 г.
27. 27. Tautenhahn R, Böttcher C, Neumann S (2008) Высокочувствительное обнаружение признаков для ЖХ / МС с высоким разрешением. BMC bioinformatics 9: 504. Доступно: http://www.biomedcentral.com/1471-2105/9/504. По состоянию на 15 марта 2012 г.
28. 28. Баран Р., Кочи Х., Сайто Н., Суэмацу М., Сога Т. и др. (2006) MathDAMP: пакет для дифференциального анализа профилей метаболитов. BMC биоинформатика 7: 530.Доступно: http://www.biomedcentral.com/1471-2105/7/530. По состоянию на 2 марта 2012 г.
29. 29. Barri T, Holmer-Jensen J, Hermansen K, Dragsted LO (2012) Метаболическая дактилоскопия образцов плазмы с высоким содержанием жира, обработанных осаждением белков на основе центрифугирования и фильтрации, выявляет значительные различия в охвате информацией о метаболитах. Analytica chimica acta 718: 47–57. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22305897. По состоянию на 21 июня 2012 г.
30. 30. Murray DB, Engelen F, Lloyd D, Kuriyama H (1999) Участие глутатиона в регуляции дыхательных колебаний во время непрерывного культивирования Saccharomyces cerevisiae .Микробиология 145: 2739–2745. Доступно: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi? Cmd = Retrieve & db = PubMed & dopt = Citation & list_uids = 10537195.
31. 31. Murray DB, Lloyd D (2006) Настраиваемый аттрактор лежит в основе респираторной динамики дрожжей. Биосистемы 90: 287–294. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17074432.
32. 32. Machné R, Murray DB (2012) Инь и Ян дрожжевой транскрипции: элементы глобальной системы обратной связи между метаболизмом и хроматином.PLoS ONE 7: e37906. Доступно: http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0037906. По состоянию на 8 июня 2012 г.
33. 33. Sohn HY, Kum EJ, Kwon GS, Jin I, Kuriyama H (2005) Регулирование метаболизма разветвленных и серосодержащих аминокислот с помощью глутатиона во время ультрадианных метаболических колебаний Saccharomyces cerevisiae . J Microbiol 43: 375–380. Доступно: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi? Cmd = Retrieve & db = PubMed & dopt = Citation & list_uids = 16145554.
34. 34. Ozalp VC, Pedersen TR, Nielsen LJ, Olsen LF (2010) Измерения с временным разрешением внутриклеточного АТФ в дрожжах Saccharomyces cerevisiae с использованием нового типа нанобиосенсора. Журнал биологической химии 285: 37579–37588. Доступно: http://www.jbc.org/cgi/content/abstract/285/48/37579. По состоянию на 13 марта 2012 г.
35. 35. Sohn H-Y, Kum E-J, Kwon G-S, Jin I, Adams CA и др. (2005) GLR1 играет важную роль в гомеодинамике глутатиона и регуляции продукции h3S во время респираторных колебаний Saccharomyces cerevisiae .Биология, биотехнология и биохимия 69: 2450–2454. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16377908.
36. 36. Sohn HY, Kuriyama H (2001) Роль аминокислот в регуляции выработки сероводорода во время ультрадиановых респираторных колебаний Saccharomyces cerevisiae . Архив микробиологии 176: 69–78. Доступно: <Перейти к ISI>: // 000170363300009.

Страница не найдена - PacBio

Соглашение об использовании изображения

Загружая, копируя или используя изображения, размещенные на этом веб-сайте («Сайт»), вы подтверждаете, что прочитали, поняли и согласны с условиями настоящего Соглашения об использовании изображений, а также с условиями, приведенными на веб-страницу Юридические уведомления, которые вместе регулируют использование вами изображений, как указано ниже.Если вы не согласны с такими условиями, не загружайте, не копируйте и не используйте изображения каким-либо образом, если у вас нет письменного разрешения, подписанного уполномоченным представителем Pacific Biosciences.

В соответствии с условиями настоящего Соглашения и условиями, приведенными на веб-странице Юридических уведомлений (в той степени, в которой они не противоречат условиям настоящего Соглашения), вы можете использовать изображения на Сайте исключительно для (а) редакционного использования в прессе. и / или отраслевых аналитиков, (б) в связи с обычной, рецензируемой, научной публикацией, книгой или презентацией и т.п.Вы не можете изменять или модифицировать любое изображение, полностью или частично, по любой причине. Вы не можете использовать какое-либо изображение таким образом, чтобы искажать представление о связанных продуктах, услугах или технологиях Pacific Biosciences или о любых связанных с ними характеристиках, данных или свойствах. Вы также не можете использовать какое-либо изображение таким образом, который обозначает какое-либо представление или гарантию (явную, подразумеваемую или установленную законом) от Pacific Biosciences в отношении продукта, услуги или технологии. Права, предоставляемые настоящим Соглашением, являются личными для вас и не могут быть переданы вами другой стороне.

Вы, а не Pacific Biosciences, несете ответственность за использование изображений. Вы признаете и соглашаетесь с тем, что любое неправильное использование изображений или нарушение настоящего Соглашения нанесет компании Pacific Biosciences непоправимый вред. Pacific Biosciences является владельцем или лицензиатом изображения, но не агентом владельца. Вы соглашаетесь предоставить Pacific Biosciences следующую кредитную линию: «Предоставлено Pacific Biosciences of California, Inc., Menlo Park, CA, USA», а также включаете любые другие кредиты или благодарности, отмеченные Pacific Biosciences.Вы должны включить любое уведомление об авторских правах, изначально включенное в изображения, на всех копиях.

ИЗОБРАЖЕНИЙ ПРЕДОСТАВЛЯЮТСЯ Pacific Biosciences "КАК ЕСТЬ". Pacific Biosciences ОТКАЗЫВАЕТСЯ ОТ ВСЕХ ЗАЯВЛЕНИЙ И ГАРАНТИЙ, ЯВНЫХ, ПОДРАЗУМЕВАЕМЫХ ИЛИ ЗАКОНОДАТЕЛЬНЫХ УСЛОВИЙ, ВКЛЮЧАЯ, НО НЕ ОГРАНИЧИВАЯСЬ ​​НАРУШЕНИЕМ, СОБСТВЕННОСТЬЮ, КОММЕРЧЕСКОЙ ЦЕННОСТЬЮ И ПРИГОДНОСТЬЮ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕННОЙ ЦЕЛИ. НИ ПРИ КАКИХ ОБСТОЯТЕЛЬСТВАХ Pacific Biosciences НЕ НЕСЕТ ОТВЕТСТВЕННОСТИ ЗА ЛЮБЫЕ ПРЯМЫЕ, КОСВЕННЫЕ, СЛУЧАЙНЫЕ, КОСВЕННЫЕ ИЛИ КОСВЕННЫЕ УБЫТКИ ЛЮБОГО ТИПА, КАКИЕ-ЛИБО В ОТНОШЕНИИ ИЗОБРАЖЕНИЙ.

Вы соглашаетесь с тем, что Pacific Biosciences может прекратить ваш доступ и использование изображений, размещенных на веб-сайте PacificBiosciences.com, в любое время и без предварительного уведомления, если компания сочтет, что вы нарушили какое-либо из условий настоящего Соглашения об использовании изображений. Вы соглашаетесь возмещать, защищать и оградить Pacific Biosciences, ее должностных лиц, директоров, сотрудников, агентов, лицензиаров, поставщиков и любых сторонних поставщиков информации на Сайт от всех убытков, расходов, убытков и издержек, включая разумные гонорары адвокатам. в результате любого нарушения вами условий настоящего Соглашения об использовании изображений или прекращения Pacific Biosciences вашего доступа к Сайту или его использования.Прекращение действия не повлияет на права Pacific Biosciences или ваши обязательства, возникшие до прекращения.

Подготовка проб для ПЦР

Принцип экстракции нуклеиновой кислоты

Геномная ДНК (гДНК) и общая РНК часто являются генетическими элементами, предназначенными для экспериментов по молекулярной биологии, поскольку они являются основными источниками генетической информации в организме.

Геномная ДНК и общая РНК экстракция имеет простую методологию, требующую только лизиса клеток для выполнения задачи.Однако рекомендуется учитывать тип организмов, которые вы используете в своих лабораторных исследованиях. Некоторые клетки организма имеют клеточную стенку структура, которая обеспечивает дополнительную защиту клеток. Это касается большинства видов дрожжей, растений и бактерий. Для этих организмов рекомендуется включить дополнительный этап лизиса клеток перед разрушением плазматической мембраны. Этот этап обычно представляет собой ферментативный или механический процесс разрушения клеточной стенки. Очистка молекул ДНК и РНК необходима, чтобы избежать загрязнения другими внутриклеточными компонентами, такими как белки и метаболиты.Немного Обычно используемые методы очистки ДНК и РНК представляют собой осаждение фенол-хлороформом или изопропанолом, или с помощью спин-колонок с мембраной из диоксида кремния.

Если ваше исследование сосредоточено на анализе экспрессии генов, то вам следует общая РНК. Та же процедура, что и для извлечения и очистки гДНК, может использоваться для очистки общей РНК, хотя требуются некоторые дополнительные шаги, как вы увидите в следующем протоколе экстракции и очистки РНК. Boster рекомендует следующие протоколы для подготовки проб в зависимости от исходного источника пробы.

Как отделить плазмидную ДНК от геномной ДНК

Если ваша целевая ДНК является плазмидой, вам следует адаптировать процедуру, чтобы убедиться, что плазмидная ДНК (пДНК) отделена от гДНК. Щелочной лизис - это самый последний протокол, используемый в лабораториях.