СТАВКИ тарифов страховых взносов Социальный фонд Кыргызской Республики
№ п/п
Код
Наименование категории
Фонды
Размер СМЗ для определения суммы дополнительного ФОТ
Пенсионный фонд
ФОМС
ФОТ
ГНПФ
Работо-
датель
Работник
Работо-
датель
Работник
Работо-
датель
Работник
Работник
1. Тариф — основной (для юридических лиц)
1
001
Основной работник
15
8
2
0
0,25
0
2
40% от СМЗ
2
001-64/69
Основной работник
15
10
2
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
3
003
Пенсионер
15
8
2
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
4
010
Иностранный гражданин
3
0
0
0
0
0
0
40% от СМЗ
5
100
Инвалиды 1-2 группы
15
2
0
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
6
101
Инвалиды ВОВ 1-2 группы и лица, приравненные к ним
15
0
0
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
7
102
Участники ВОВ и лица, приравненные к ним
15
0
2
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
8
106
МОП
15
8
2
0
0,25
0
2
От фактической зарплаты
9
106-64/69
МОП
15
10
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
10
107
Пенсионер МОП
15
8
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
2. Тарифы для государственных предприятий, организаций или учреждений, организаций, финансируемых из государственного бюджета
1
001
Основной работник
15
8
2
0
0,25
0
2
От фактической зарплаты
2
001-64/69
Основной работник
15
10
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
3
003
Пенсионер
15
8
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
4
010
Иностранный гражданин
3
0
0
0
0
0
0
От фактической зарплаты
5
100
Инвалиды 1-2 группы
15
2
0
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
6
101
Участник/инвалид ВОВ
15
0
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
7
102
Лица, приравненные к участникам ВОВ
15
0
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
8
106
МОП
15
8
2
0
0,25
0
2
От фактической зарплаты
9
106-64/69
МОП
15
10
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
10
107
Пенсионер МОП
15
8
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
3. Тарифы для Кыргызского общества слепых и глухих
1
001
Основной работник
15
7,5
2
0
0,25
0
2
От фактической зарплаты
2
101-64/69
Основной работник
15
9,5
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
3
003
Пенсионер
15
2
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
4
100
Инвалиды 1-2 группы
15
2
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
5
101
Участник/инвалид ВОВ
15
0
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
6
102
Лица, приравненные к участникам ВОВ
15
0
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
7
106
МОП
15
7,5
2
0
0,25
0
2
От фактической зарплаты
8
06-64/69
МОП
15
9,5
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
9
107
Пенсионер МОП
15
2
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
4. Тарифы для некоммерческих, религиозных и общественных организаций
1
001
Основной работник
15
8
2
0
0,25
0
2
От фактической зарплаты
2
001-64/69
Основной работник
15
10
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
3
003
Пенсионер
13
2
0
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
4
010
Иностранный гражданин
3
0
0
0
0
0
0
От фактической зарплаты
5
100
Инвалиды 1-2 группы
13
2
0
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
6
101
Участник/инвалид ВОВ
13
0
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
7
102
Лица, приравненные к участникам ВОВ
13
0
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
8
106
МОП
15
8
2
0
0,25
0
2
От фактической зарплаты
9
106-64/69
МОП
15
10
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
10
107
Пенсионер МОП
13
2
0
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
5. Тарифы для организаций, созданных в соответствии с международными соглашениями, и лиц, работающих в международных проектах
1
001
Основной работник
15
8
2
0
0,25
0
2
40% от СМЗ
2
001-64/69
Основной работник
15
10
2
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
3
003
Пенсионер
15
8
2
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
4
010
Иностранный гражданин
3
0
0
0
0
0
0
40% от СМЗ
5
100
Инвалиды 1-2 группы
15
2
0
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
6
101
Участник/инвалид ВОВ
15
0
2
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
7
102
Лица, приравненные к участникам ВОВ
15
0
2
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
8
106
МОП
15
8
2
0
0,25
0
2
От фактической зарплаты
9
06-64/69
МОП
15
10
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
10
107
Пенсионер МОП
15
8
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
6. Тарифы для индивидуальных предпринимателей
1
001
Основной работник
15
8
2
0
0,25
0
2
40% от СМЗ
2
001-64/69
Основной работник
15
10
2
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
3
003
Пенсионер
15
8
2
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
4
010
Иностранный гражданин
3
0
0
0
0
0
0
40% от СМЗ
5
100
Инвалиды 1-2 группы
15
2
0
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
6
101
Участник/инвалид ВОВ
15
0
2
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
7
102
Лица, приравненные к участникам ВОВ
15
0
2
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
8
106
МОП
15
8
2
0
0,25
0
2
От фактической зарплаты
9
06-64/69
МОП
15
10
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
10
107
Пенсионер МОП
15
8
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
7. Тарифы для наемных работников, занятых в текстильном и швейном производствах
1
001
Основной работник (швейник)
4,75
4
1
0
0,25
0
2
40% от СМЗ
2
001-64/69
Основной работник (швейник)
4,75
6
1
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
3
003
Пенсионер (швейник)
4,75
4
1
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
4
010
Иностранный гражданин
3
0
0
0
0
0
0
40% от СМЗ
5
100
Инвалиды 1-2 группы
4,75
2
1
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
6
101
Участник/инвалид ВОВ
4,75
0
1
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
7
102
Лица, приравненные к участникам ВОВ
4,75
0
1
0
0,25
0
0
40% от СМЗ
8
106
МОП
15
8
2
0
0,25
0
2
От фактической зарплаты
9
106-64/69
МОП
15
10
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
10
107
Пенсионер МОП
15
8
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
8. Тарифы для работников Парка высоких технологий и его дирекции
1
001
Основной работник
0
10
0
0
0
0
2
СМЗ
2
101-64/69
Основной работник
0
12
0
0
0
0
0
СМЗ
3
003
Пенсионер
0
10
0
0
0
0
0
СМЗ
4
100
Инвалиды 1-2 группы
0
2
0
0
0
0
0
СМЗ
5
106
МОП
15
8
2
0
0,25
0
2
От фактической зарплаты
6
06-64/69
МОП
15
10
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
7
107
Пенсионер МОП
15
8
2
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
9. Тарифы для сельскохозяйственных кооперативов
1
001
Основной работник
0
8
1,75
0
0,25
0
2
От фактической зарплаты
2
001-64/69
Основной работник
0
10
1,75
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
3
003
Пенсионер
0
8
1,75
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
4
010
Иностранный гражданин
3
0
0
0
0
0
0
От фактической зарплаты
5
100
Инвалиды I и II группы
0
2
1,75
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
6
101
Участник/инвалид ВОВ
2
0
0
0
0
0
0
От фактической зарплаты
7
102
Лица, приравненные к участникам ВОВ
2
0
0
0
0
0
0
От фактической зарплаты
8
106
МОП
0
8
1,75
0
0,25
0
2
От фактической зарплаты
9
106-64/69
МОП
0
10
1,75
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
10
107
Пенсионер МОП
0
8
1,75
0
0,25
0
0
От фактической зарплаты
10. Тарифы для общих категорий
1
103
ИП, уплачивающие налоги на основе общего налогового режима и/или специальных налоговых режимов путем приобретения обязательного патента по упрощенной системе налогообложения на основе единого налога или на основе налогового контракта
8,75
0
1
0
0,25
0
0
10% от СМЗ
2
104
Арендодатель
8,75
0
1
0
0,25
0
0
10% от СМЗ
3
103
ИП, уплачивающие налоги на основе специального налогового режима путем приобретения добровольного патента (за исключением ИП, получающих доход от сдачи в аренду движимого и недвижимого имущества), а также осуществляющие деятельность на рынках путем реализации товара с контейнера, в павильонах, в киосках
0
89,75
0
10
0,25
0
0
Не менее 6% от СМЗ
4
103
ИП, осуществляющие предпринимательскую деятельность на рынках путем реализации товара с лотков, торговых мест
0
89,75
0
10
0,25
0
0
Не менее 3% от СМЗ
Что нужно знать о пенсионных накоплениях
Сегодня работодатели платят страховые взносы в обязательную пенсионную систему по тарифу 22% от фонда оплаты труда работника. Из них 6% тарифа могут идти на формирование пенсионных накоплений, а 16% – на формирование страховой пенсии, а могут, по выбору гражданина, все 22% идти на формирование страховой пенсии.
У граждан 1966 года рождения и старше формирование пенсионных накоплений может происходить только за счет добровольных взносов в рамках Программы государственного софинансирования формирования пенсионных накоплений, а также за счет направления средств материнского (семейного) капитала на накопительную пенсию. Если гражданин работает, страховые взносы на обязательное пенсионное страхование направляются только на формирование страховой пенсии. Пенсионные накопления также есть у мужчин 1953-1966 года рождения и женщин 1957-1966 года рождения, в пользу которых в период с 2002 по 2004 гг. включительно уплачивались страховые взносы на накопительную пенсию. С 2005 года эти отчисления были прекращены в связи с изменениями в законодательстве.
Если же гражданин родился в 1967 году и позднее, до 31 декабря 2015 года ему предоставлялась возможность выбора собственного варианта пенсионного обеспечения в отношении своих будущих пенсионных накоплений:
формировать только страховую пенсию
формировать страховую и накопительную пенсию одновременно
Гражданам 1966 года рождения и старше выбор варианта пенсионного обеспечения не предоставлялся.
В настоящее время право выбора варианта пенсионного обеспечения сохраняют лица 1967 года рождения и моложе, в отношении которых с 1 января 2014 года впервые начисляются страховые взносы на обязательное пенсионное страхование.
До 1 декабря года, в котором истекает пятилетний период с момента первого начисления страховых взносов на обязательное пенсионное страхование, указанные граждане вправе:
заключить договор об обязательном пенсионном страховании и обратиться с заявлением о переходе (досрочном переходе) в негосударственный пенсионный фонд;
либо до 31 декабря года, в котором истекает пятилетний период с момента первого начисления страховых взносов на обязательное пенсионное страхование, обратиться с заявлением о выборе инвестиционного портфеля управляющей компании, расширенного инвестиционного портфеля государственной управляющей компании или инвестиционного портфеля государственных ценных бумаг государственной «управляющей компании».
При внесении изменений в единый реестр застрахованных лиц по обязательному пенсионному страхованию либо при удовлетворении Пенсионным фондом Российской Федерации заявления о выборе инвестиционного портфеля с установлением варианта пенсионного обеспечения, предусматривающего направление на финансирование накопительной пенсии 6,0 процента индивидуальной части тарифа страхового взноса, для указанных застрахованных лиц устанавливается вариант пенсионного обеспечения, предусматривающий направление страховых взносов на накопительную пенсию.
До реализации данного права выбора, а также для лиц не воспользовавшихся указанным правом, устанавливается вариант пенсионного обеспечения, предусматривающий направление на финансирование страховой пенсии страхового взноса в полном объеме.
В случае, если по истечении пятилетнего периода с момента первого начисления страховых взносов на обязательное пенсионное страхование данные застрахованные лица не достигли возраста 23 лет, указанный период продлевается до 31 декабря года, в котором лицо достигнет возраста 23 лет (включительно).
Если гражданин принял решение отказаться от дальнейшего формирования накопительной пенсии, все ранее сформированные пенсионные накопления будут по-прежнему инвестироваться выбранным им страховщиком (ПФР или НПФ) и будут выплачены в полном объеме при обращении гражданина за назначением и последующей выплатой пенсии. Кроме того, застрахованное лицо по-прежнему вправе распоряжаться указанными пенсионными накоплениями и выбирать, кому доверить управление ими.
Корпоративным клиентам | Пенсионные программы
АО «НПФ ГАЗФОНД» приглашает к сотрудничеству
Внедрение корпоративной пенсионной программы позволяет компании позиционировать себя как социально ответственного работодателя, заботящегося о своих работниках не только в период трудовой деятельности, но и после их выхода на пенсию.
Работник получает гарантию социальной защищенности после ухода на заслуженный отдых, а работодатель приобретает инструмент для привлечения и мотивации персонала, удержания высококвалифицированных специалистов или ротации кадров.
Участие в корпоративных программах негосударственного пенсионного обеспечения АО «НПФ ГАЗФОНД» это:
Конкурентоспособный социальный пакет, позволяющий привлекать и удерживать высококвалифицированных работников
Социальное партнерство работодателя и работника
Налоговые льготы для работодателя – возможность отнесения пенсионных взносов к расходам на оплату труда до 12% от ФОТ, пенсионные взносы не облагаются страховыми взносами
Повышение трудовой мотивации и производительности работников
Обеспечение эффективной кадровой политики
Возможность применять пенсионные программы для разных категорий работников и определять порядок, размер и периодичность пенсионных взносов
Ассоциация операторов фитнес-индустрии просит снизить страховые взносы для всей отрасли — Экономика и бизнес
МОСКВА, 19 февраля. /ТАСС/. Фитнес-индустрия попросила Госдуму рассмотреть возможность снижения страховых взносов для работников всех субъектов фитнес-бизнеса как представителей социально-ориентированной отрасли на 2021-2022 годы. Об этом говорится в документах Ассоциации операторов фитнес-индустрии (АОФИ), подготовленных по итогам встречи представителей отрасли с депутатами Госдумы и ФНС (есть в распоряжении ТАСС).
«Страховые взносы (пенсионное, медицинское и социальное страхование) на выплаты работникам сейчас составляют 30%, для субъектов МСП эта цифра снижена до 15% по ФЗ 102-ФЗ от 01.04.2020, что все равно составляет значительную сумму в расходах фитнеса, поскольку доля ФОТ в расходах компании достигает 45-50% и объем страховых взносов представляет значительную величину в расходах, что существенно усложняет выход компаний из кризиса. Кроме того, крупные фитнес-сети совсем не попали под действие этого ФЗ, хотя численность сотрудников, работающих в сетях, очень велика, и ФОТ, и взносы на него составляет серьезные цифры в бюджете клубов. Все это существенно затрудняет восстановление отрасли», — сообщила ТАСС президент АОФИ Ольга Киселева.
В материалах также указывается, что деятельность игроков фитнес-индустрии предполагает большой штат сотрудников, непосредственно оказывающих услуги. Снижение социальных отчислений даст толчок для развития отрасли и выведет из серой зоны часть находящихся там операторов, что увеличит поступления в бюджет, считают представители индустрии.
На встрече представители фитнес-сообщества подняли вопрос о возможности снижения арендной платы для фитнес-клубов до 50% до конца 2021 года. АОФИ называет вопрос выплат по аренде «одним из ключевых для отрасли» и указывает, что аренда в расходной части фитнес-клуба составляет от 25% до 30%.
Представители отрасли просят ввести мораторий на расторжение договора аренды по инициативе арендодателя до конца 2021 года, продлить права арендатора на расторжение договора без штрафных санкций до 1 октября 2021 года, предоставить отсрочки по выплатам кредитов, полученных в рамках реализации мер господдержки, на 2021 год. Арендодателей, снизивших плату не менее чем на 50%, АОФИ предлагает освободить от налога на имущество и земельного налога.
О чем еще попросила фитнес-индустрия
На встрече в Госдуме представители фитнес-сообщества также попросили внедрить налоговый вычет для компаний-работодателей, оплачивающих фитнес-абонементы для своих сотрудников, и учесть замечания к закону о налоговом вычете для граждан, занимающихся фитнесом, для применения вычета уже в 2021 году. «Произвести законодательное закрепление понятия «физкультурно-оздоровительная услуга», рекомендовать Минспорта РФ при формировании перечня организаций и критериев отнесения к этому перечню провести расширенные обязательные консультации с представителями отраслевого бизнес-сообщества на официальной законодательной основе, распространить действие закона после его принятие на весь период 2021 года», — говорится в документе.
По словам председателя комитета Госдумы по физической культуре, спорту, туризму и делам молодежи Бориса Пайкина, потребительский спрос на услуги сейчас снижен, фитнес-индустрия понесла существенные убытки в связи с ограничениями в 2020 году, это направление нуждается в дополнительной поддержке. «Мы как законодатели готовы оказать поддержку в этом деле, проработать механизмы, которые бы позволили реализовать эти намерения. Например, это могли бы быть стимулирующие меры для предприятий, чтобы те направляли своих сотрудников на занятия фитнесом, а также меры, которые сделали бы фитнес более доступными для граждан. В частности, закон о налоговом вычете на спорт, который сейчас находится в Госдуме, — как раз один из шагов в этом направлении», — сказал Пайкин, его слова приводит пресс-служба.
По данным АОФИ, к настоящему моменту более 25% фитнес-клубов не смогли пережить кризис. «Если эти меры поддержки и стимулирования спроса не будут приняты, по нашим прогнозам, фитнес-рынок в ближайшее время может сократиться еще более чем на 20% — часть клубов не сможет избежать банкротства, что повлечет за собой в том числе сокращение выплачиваемых бизнесом налогов, сокращение рабочих мест с сопровождающей его нагрузкой на бюджет в виде выплат пособий по безработице и социальной напряженностью», — отмечают в организации.
Переход с ЕНВД на общую систему налогообложения
Оператор электронной отчётности и ЭДО Такском провёл вебинар на тему «Отмена ЕНВД с 1 января 2021 года и выбор альтернативного режима налогообложения». Эксперт компании Сергей Анисимов рассказал плюсах и минусах перехода с ЕНВД на общую систему налогообложения (ОСН или ОСНО).
ОСН это самый непростой, но при этом не предполагающий никаких ограничений по прибыли и числу сотрудников режим налогообложения. Сдавать отчётность на этом режиме придётся в гораздо большем объёме, чем на спецрежимах. Причём сдавать потребуется не только в ФНС, но и в другие контролирующие органы (ПФР, ФСС и т. д.). Что у организаций, что у ИП возникает обязанность уплаты сразу нескольких налогов, а также страховых взносов. Организации платят:
— Налог на прибыль организаций 20 % = (доходы–расходы)*20 % суммы без НДС;
— Страховые взносы в фонд оплаты труда, если есть работники: ПФР – 22 %, ФОМС – 5,1 %, ФСС – 2,9 %;
— Страховые взносы за себя.
Плюсы и минусы ОСН
ОСН
Преимущества
Недостатки
Нет никаких ограничений по числу сотрудников, прибыли и остаточной стоимости ОС, площади торговых точек, наличию филиалов и т. д.
При низкой затратной части сумма налога будет высокой
Возможность не платить налог при ведении убыточной деятельности
Необходимо выставлять счета-фактуры и вести налоговые регистры по НДС. НДС платится не зависимо от того, получили вы деньги за проданные товары или нет
Возможность работать с крупными предприятиями – плательщиками НДС
Высокая налоговая нагрузка, большое количество уплачиваемых налогов и предоставляемых отчетов, строгие требования к ведению бухгалтерских документов и их хранению
Учитываются расходы
Важна благонадежность контрагентов
Если вы решите, что данная система налогообложения подходит вам более всего, то никаких заявлений о переходе на другой режим подавать до 31 декабря 2020 года не нужно. 1 января 2021 года налоговая служба автоматически переведет вас на ОСН. При этом важно помнить, что ОСН нельзя совмещать с упрощёнкой.
Если же вы остановились на одном из спецрежимов – ПСН или УСН, – то соответствующие заявления (уведомления) о переходе вы легко сможете подать через сервисы компании Такском для отчётности.
Отправить
Запинить
Твитнуть
Поделиться
Поделиться
Как происходит начисление страховых взносов в 1С 8.3 Бухгалтерия
Маргарита Матевосова
Методист отдела 1С Scloud
В конфигурации 1С 8.3 Бухгалтерия имеется встроенная возможность по начислению и расчету всех необходимых страховых взносов по зарплате работников, которые уплачиваются и отражаются в отчетности. Для правильного отражения нужно настроить некоторые параметры.
По учету взносов настройка осуществляется в разделе «Зарплата и кадры» пункт «Настройки учета зарплаты». Проходим в раздел «Классификаторы» на вкладку «Страховые взносы»:
Здесь есть перечень установленных параметров: список с действующими скидками, виды доходов по взносам, значение предельной величины базы, тарифы и другое. Их можно дополнить или скорректировать в ручном режиме:
Чтобы настроить учет взносов переходим на вкладку «Главное», «Учетная политика» и открываем форму «Настройка налогов и отчетов». Далее открываем вкладку «Налоги и взносы с ФОТ».
Заполняем поля:
Вид тарифа страховых взносов;
Параметры начисления дополнительных взносов – при необходимости отмечаем галочками профессии, которые предусмотрены в штате;
Взносы от НС и ПЗ – указывается процентная ставка, утвержденная органами ФСС.
По каждому сотруднику производятся начисления зарплаты, больничных или отпускных. Данные видны, если пройти на вкладку меню «Зарплата и кадры», далее раздел «Справочники и настройки» пункт «Начисления».
Параметр по обложению взносами указывается непосредственно по каждому начислению в пункте «Вид дохода»:
Для осуществления правильного учета взносов в БУ необходимо указывать статью затрат. В программе 1С присутствуют внесенные в конфигурацию такие статьи, как:
Хочется обратить внимание, что статья затрат по взносам имеет прямую зависимость от статьи затрат по начислениям.
Для ознакомления проходим на вкладку «Зарплата и кадры», далее раздел «Справочники и настройки» пункт «Статьи затрат по страховым взносам»:
Возможно добавление новых статей с привязкой к статье по начислению.
Начисление страховых взносов осуществляется в автоматическом режиме по документу «Начисление зарплаты» вместе с начислением зарплаты:
После чего на вкладке «Взносы» будут отображены все данные по рассчитанным страховым взносам на основании тарифа по данной организации и виду начисления дохода. Аналогичную информацию можно просмотреть в проводках документа:
Если проследовать на вкладку меню программы «Зарплата и кадры» раздел «Зарплата» и открыть пункт «Отчеты по зарплате», то можно увидеть подробную аналитику всех начисленных взносов за выбранный период по всем сотрудникам:
Через отчет «Анализ взносов в фонды» можно просмотреть также детальные начисления в виде аналитической таблицы, где будут отображены необлагаемые начисления и превышения предельной базы (если присутствуют):
Из раздела «Отчеты по зарплате» можно пройти в отчет «Карточка учета страховых взносов», который возможно сформировать прямо из документа «Начисление зарплаты» на вкладке «Взносы».
Перекрывающаяся функция белков Pht в гомеостазе цинка Streptococcus pneumoniae
Infect Immun. 2014 Октябрь; 82 (10): 4315–4324.
А. Камилли, редактор
Исследовательский центр инфекционных заболеваний, Школа молекулярных и биомедицинских наук, Университет Аделаиды, Аделаида, Австралия
Автор, отвечающий за переписку.
Поступило 4 июня 2014 г .; Изменения запрошены 3 июля 2014 г .; Принято 23 июля 2014 г.
Streptococcus pneumoniae — патоген мирового значения, вызывающий ряд заболеваний, включая пневмонию, сепсис, менингит и средний отит. Его способность вызывать заболевания зависит от получения питательных веществ из окружающей среды, включая ионы переходных металлов, таких как цинк. Для достижения этой цели пневмококк использует ряд поверхностных белков, среди которых четыре очень похожих белка полигистидиновой триады (Pht).Ранее было установлено, что эти белки в совокупности способствуют доставке цинка к связывающему субстрату белку ABC-транспортера AdcAII. Здесь мы исследовали вклад каждого отдельного белка Pht в пневмококковый гомеостаз цинка путем анализа мутантных штаммов, экспрессирующих только один из четырех генов pht . В условиях низкой доступности цинка каждый из этих мутантов показал лучшие профили роста и накопления цинка по сравнению с мутантным штаммом, лишенным всех четырех генов, что указывает на то, что любой из четырех белков Pht способен облегчить доставку цинка к AdcAII. Однако для оптимального роста и накопления цинка in vitro и выживания и пролиферации пневмококков in vivo требовалось продуцирование всех четырех белков Pht, что указывает на то, что, несмотря на их перекрывающуюся функциональность, эти белки нельзя обойтись без затрат на приспособленность. Мы также показываем, что поверхностно-прикрепленные формы белков Pht необходимы для рекрутирования цинка и что они не вносят вклад в защиту от внеклеточного цинкового стресса.
ВВЕДЕНИЕ
Streptococcus pneumoniae вызывает широкий спектр заболеваний человека, включая пневмонию, сепсис, менингит и средний отит, и эти заболевания приводят к огромной заболеваемости и смертности во всем мире (1).Среди множества поверхностных белков, которые способствуют патогенности пневмококков, есть белки полигистидиновой триады (Pht), семейство, состоящее из четырех членов (PhtA, PhtB, PhtD и PhtE) (2). Этим белкам приписывают ряд функций, включая связывание с регуляторным фактором комплемента H (3) и прикрепление к эпителиальным клеткам хозяина (4, 5). Однако на сегодняшний день основное внимание сосредоточено на их вкладе в гомеостаз ионов металлов.
Определяющей особенностью белков Pht является наличие множественных копий мотива гистидиновой триады (HXXHXH).Каждый мотив в каждом из белков Pht потенциально способен связывать один ион Zn 2+ , в зависимости от конформационных соображений белка (6). Приобретение цинка имеет решающее значение для выживания S. pneumoniae во время инфекции и происходит через транспортер AdcBC, связывающий АТФ-кассету (ABC), после доставки металла через субстрат-связывающие белки (SBP) AdcA и / или AdcAII (7, –11). В настоящее время имеются существенные доказательства, подтверждающие гипотезу о том, что важная роль белков Pht заключается в облегчении приобретения Zn 2+ через AdcAII (6, 9, 12).Гены phtD и adcAII котранскрибируются, и их экспрессия координируется изобилием клеточного Zn 2+ . В экспериментах по перекрестному связыванию и иммунопреципитации in vitro было показано, что два белка взаимодействуют друг с другом (6, 12). Недавно мы показали, что рост мутанта Δ phtABDE Δ adcA был сильно ослаблен в средах, содержащих низкую концентрацию доступного Zn 2+ , по сравнению с ростом штамма Δ adcA и штамма in vivo. Фитнес мутанта Δ phtABDE Δ adcA был значительно ниже, чем у штамма Δ phtABDE Δ adcAII (9).В совокупности эти данные согласуются с тем, что AdcA может приобретать Zn 2+ независимо, тогда как AdcAII требует присутствия белков Pht для оптимальной функциональности (9).
Однако важный, но пока не решенный вопрос заключается в том, способен ли каждый из четырех белков Pht способствовать доставке Zn 2+ в AdcAII или эта функция ограничена только некоторыми членами семейства белков. Этот вопрос имеет значение для нашего понимания гомеостаза пневмококка Zn 2+ , а также имеет значение для разработки вакцины.Белки Pht и, в частности, PhtD, являются мишенями для нескольких новых пневмококковых вакцин на белковой основе, которые в настоящее время разрабатываются. Эффективность этих составов может зависеть от стимуляции опсонофагоцитарного ответа антител против этих поверхностных антигенов, а также от блокады их функции связыванием антител (13, –16). Как следствие, если белки Pht являются избыточными, потребуется перекрестно-реактивные антитела, которые связываются со всеми четырьмя белками, чтобы вызвать защиту, основанную на блокаде функции (функций) белков, тогда как, если они не являются избыточными, такая защитная эффект может быть получен из отдельных антител, специфичных к белку Pht.Хотя белки Pht обладают высоким сходством последовательностей, что позволяет предположить, что все они могут выполнять одну и ту же функцию, только phtD котранскрибируется с adcAII . Таким образом, вполне вероятно, что только PhtD может способствовать приобретению Zn 2+ . Ограниченное количество предыдущих исследований пролили некоторый свет на проблему избыточности в семействе белков. Огунний и др. обнаружили, что делеция всех четырех генов pht приводит к увеличению отложения комплемента на поверхности пневмококка и увеличению времени выживания после внутрибрюшинного заражения на мышиной модели заболевания по сравнению с диким типом (3). Однако штаммы с одним или двумя удаленными генами pht не показали значительных отличий от дикого типа, что позволяет сделать вывод о функциональной избыточности белков Pht (3). Однако тройные мутанты pht (т.е. штаммы только с одним геном pht ) не тестировались в этом исследовании, что ограничивает силу выводов, которые можно было сделать. В другом исследовании Rioux et al. сообщили, что делеция всех четырех генов pht была необходима для наблюдения фенотипа нарушения роста в химически определенной среде с дефицитом катионов, тогда как одиночные, двойные или тройные (Δ phtBDE ) мутанты вели себя аналогично дикому типу (17) .Однако было показано, что делеция отдельных генов pht вызывает значительное снижение адгезии пневмококков к линиям клеток носоглотки и легких, что позволяет предположить, что белки Pht не полностью дублируют эту роль (4, 5).
Целью этого исследования было дальнейшее изучение потенциальной функциональной избыточности в семействе белков Pht с особым акцентом на их роли в гомеостазе Zn 2+ . Чтобы разрешить ранее противоречивые данные относительно избыточности белка Pht, мы оценили их функциональность более комплексно, чем это было выполнено ранее, путем создания и изучения фенотипов всех четырех возможных тройных мутантов pht (Δ phtBDE , Δ phtADE , Δ phtABE и Δ phtABD ), что позволяет исследовать способность каждого белка Pht вносить вклад в приобретение Zn 2+ в отсутствие трех других белков Pht.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы и питательные среды.
Определенная неполярная делеционная замена или немаркированные пневмококковые мутанты штамма Streptococcus pneumoniae D39, лишенные phtA , phtB , phtD , phtE или adcA , были получены ранее (3, 9). Комбинированные мутанты, использованные в этом исследовании, были получены путем амплификации соответствующих локусов из ранее существовавших мутантов с помощью ПЦР и использования этих локусов для трансформации соответствующего фонового штамма с использованием установленных методов (18, 19). ПЦР, секвенирование ДНК и иммуноблоттинг были использованы для подтверждения того, что желаемые мутации были внесены. Полный список штаммов, использованных в этом исследовании, приведен в. Варианты непрозрачной фазы использовались во всех экспериментах. Бактерии обычно выращивали при 37 ° C в атмосфере, обогащенной CO 2 , на колумбийском агаре с добавлением 5% (об. / Об.) Лошадиной крови. Если бактерии использовались для заражения мышей, их выращивали в сывороточном бульоне (10% инактивированной нагреванием лошадиной сыворотки в питательном бульоне). В качестве альтернативы использовали среду с определением катионов (CDM) (приготовленную, как описано ранее [9, 20]).Чтобы оценить эффект Zn 2+ голодания, хелатирующий агент N , N , N ‘, N ‘ -тетракис (2-пиридилметил) этилендиамин (TPEN) был добавлен в эквимолярной концентрации до Zn 2+ определено как находящийся в CDM с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) для получения CDM-TPEN. Одна партия CDM использовалась для всех экспериментов в этом исследовании, и она была дополнена 13 мкМ TPEN для получения CDM-TPEN, когда это необходимо.
D39 Δ phtABDE мутант, дополненный phtD с аминокислотными заменами R26A, h37A и Q28A; adcA заменен геном хлорамфениколацетилтрансферазы
19
PhtE 3 Ala Δ adcA мутант
D39 Δ phtABDE мутант, дополненный phtE и R29A с аминокислотными заменами Q38; adcA заменен геном хлорамфениколацетилтрансферазы
19
Δ adcAII мутант
9
Анализ роста.
Для измерения кривой роста S. pneumoniae D39 дикого типа и мутантные штаммы выращивали в CDM с 1 мкМ MnSO 4 до тех пор, пока они не достигли оптической плотности 0,4 при 600 нм (OD 600 ). Затем их субкультивировали в 200 мкл CDM, CDM-TPEN или CDM с добавлением ZnSO 4 . Бактерии инкубировали при 37 ° C, и рост контролировали путем измерения OD 600 с 30-минутными интервалами.
Накопление ионов металла во всей клетке.
Штаммы S. pneumoniae выращивали в CDM-TPEN до OD 600 0,4. Бактерии трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим 5 мМ EDTA, а затем дважды промывали PBS с центрифугированием при 12000 × g в течение 10 мин при 4 ° C между каждой промывкой. Бактериальные гранулы обезвоживали путем нагревания до 95 ° C в течение ночи. Регистрировали сухую массу клеточного материала, а затем ресуспендировали в 35% HNO 3 . Содержание ионов металлов в растворенном клеточном материале измеряли на масс-спектрометре с индуктивно связанной плазмой Agilent 7500cx (Adelaide Microscopy).
Количественный анализ иммуноблоттинга и qRT-PCR.
Бактерии дикого типа и мутантные бактерии S. pneumoniae выращивали в тех же условиях, что и в экспериментах по накоплению ионов металлов в цельной клетке. После того, как культуры достигли ОП 600 0,4, они были разделены на образцы для обработки для экстракции белка и РНК. Для экстракции белка клетки инкубировали с 0,1% дезоксихолатом натрия (Sigma-Aldrich) при 37 ° C в течение 60 минут для индукции лизиса. Определяли концентрации белка (анализ белка DC Bio-Rad; Bio-Rad), и 20 мкг общего белка загружали в каждую дорожку.После электрофоретического разделения с помощью SDS-PAGE белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану с помощью системы iBlot (Life Technologies). Блоты инкубировали с ранее созданной мышиной антисывороткой против соответствующего белка Pht (16). Затем блоты инкубировали с антимышиным IRDye 800 и сканировали с использованием системы инфракрасной визуализации Odyssey (LI-COR Biosciences). Интенсивность полос измеряли с помощью прикладного программного обеспечения производителя. Для измерения абсолютных молярных количеств белка стандартная кривая с диапазоном количеств соответствующего очищенного белка Pht была включена в Вестерн-блот и использовалась для калибровки интенсивностей полос, измеренных для клеточных лизатов, относительно абсолютных количеств, а также прогнозируемых молекулярных масс белки использовали для перевода в молярные количества (16).
Для экстракции РНК и анализа ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) 500 мкл культуры смешивали с 1 мл RNA protect (Qiagen). РНК экстрагировали и очищали с использованием мини-набора RNeasy Protect Bacteria (Qiagen) после ферментативного лизиса с использованием лизоцима и мутанолизина в соответствии с инструкциями производителя. Образцы тотальной РНК обрабатывали ДНКазой I (Roche), и количественную ОТ-ПЦР (qRT-PCR) проводили с использованием набора SuperScript III для одноступенчатой ОТ-ПЦР (Invitrogen) на циклере реального времени LC480 (Roche). .Уровни транскрипции проанализированных генов были нормализованы к уровням, полученным для 16S рРНК. Последовательности праймеров показаны в.
ТАБЛИЦА 2
Олигонуклеотидные праймеры, использованные для кОТ-ПЦР в этом исследовании
Беспородных самок мышей CD1 (Swiss) в возрасте 5-6 недель использовали во всех экспериментах на животных. Мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (Nembutal; Rhone-Merieux) в дозе 66 мкг на г веса тела с последующим интраназальным введением 50 мкл бактериальной суспензии, содержащей равную смесь двух мутантных штаммов с всего примерно 1 × 10 7 КОЕ. Доза контрольного заражения и соотношение ввода были подтверждены ретроспективно путем серийных разведений и посева на кровяной агар с последующим нанесением пятен колоний на чашки с кровяным агаром с антибиотиком и без него, чтобы позволить различить два штамма.
Через 24 и 48 ч после заражения мышей умерщвляли удушением CO 2 . Кровь собирали из задней полой вены с помощью шприца. Плевральную полость промывали 1 мл стерильного PBS, содержащего 2 мМ EDTA, введенного через диафрагму. Легочную сосудистую сеть перфузировали инфузией стерильного PBS через сердце. Впоследствии легкие были вырезаны. Затем трахею обнажали, и 1 мл PBS, содержащего 0,5% (мас. / Об.) Трипсина (Life Technologies), вводили в трахеальный конец верхних дыхательных путей и собирали из носа (носовая промывка).В последнюю очередь иссекали носоглотку / верхнее небо (ткань носа). Ткани гомогенизировали, все образцы серийно разбавляли и высевали на кровяной агар. Впоследствии колонии накладывали на чашки с кровью с соответствующим антибиотиком и без него, чтобы позволить различить два мутантных штамма и определить выходное соотношение. Затем рассчитывались индексы конкуренции (отношение одного мутантного штамма к другому мутантному штамму относительно входного отношения) и сравнивались с теоретическим значением 1 (которое указывало бы на отсутствие разницы в приспособленности между штаммами) с помощью тестов t на одной выборке. .
Все процедуры, выполненные в этом исследовании, были проведены с целью минимизировать дискомфорт животных и использовать минимальное количество животных для получения воспроизводимых и статистически значимых данных. Все эксперименты были одобрены Комитетом по этике животных Университета Аделаиды (номер гарантии благополучия животных A5491-01; номер утверждения проекта S-2013-053) и проводились в строгом соответствии с руководящими принципами, продиктованными Австралийским кодексом практики по уходу и использованию. животных для научных целей.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Рост штаммов с дефицитом
pht в условиях низкой доступности Zn 2+ .
Чтобы изучить вклад отдельных белков Pht в гомеостаз Zn 2+ , были сконструированы мутантные штаммы, не содержащие всех возможных комбинаций трех из четырех генов pht (Δ phtBDE , Δ phtADE , Δ phtABE и Δ phtABD мутанты). Наше предыдущее исследование показало, что вклад белков Pht в приобретение Zn 2+ с помощью AdcAII был наиболее выражен, когда другой Zn 2+ -рекрутирующий субстрат-связывающий белок (SBP), AdcA, отсутствовал (9).Следовательно, мы также удалили ген adcA из всех штаммов, чтобы избежать его влияния на поглощение Zn 2+ . Следовательно, полученные мутантные штаммы полностью зависели от AdcAII и только от PhtA, PhtB, PhtD или PhtE для импорта Zn 2+ . Полный список штаммов, использованных в этом исследовании, приведен в.
Для экспериментов по выращиванию была подготовлена катионно-определяемая среда (CDM), и ее концентрация Zn 2+ была измерена с помощью ICP-MS. Поскольку Zn 2+ не может быть полностью удален из любой культуральной среды, мы затем ограничили биодоступность Zn 2+ с помощью хелатирующего агента TPEN в эквимолярной концентрации до Zn 2+ , как определено с помощью ICP-MS. CDM, чтобы получить культуральную среду CDM-TPEN, как описано ранее (9, 20).CDM-TPEN содержит незначительное количество биодоступного Zn 2+ , поскольку TPEN имеет K D (константа равновесной диссоциации) для Zn 2+ ∼2,6 × 10 −16 M. Как следствие, бактерии выросли. в этой среде критически зависят от бактериальных белков, рекрутирующих Zn 2+ с высоким сродством, которые экспериментально сообщили о K D s для Zn 2+ в наномолярном диапазоне. Первоначально сравнивали рост штаммов дикого типа Δ adcA , Δ phtABDE Δ adcAII и Δ phtABDE Δ adcA ().Из двух последних штаммов только мутант Δ phtABDE Δ adcAII был способен расти (хотя и в гораздо меньшей степени, чем штамм дикого типа), что согласуется с нашим предыдущим наблюдением, что AdcAII в большей степени зависит от белков Pht для получения Zn 2+ , чем AdcA (9). Затем мы исследовали штаммы только с одним из четырех генов pht в отсутствие AdcA (). Эти мутантные штаммы показали гораздо более низкую скорость роста и более низкую конечную плотность клеток, чем мутант Δ adcA , который рос не отличим от дикого типа.Однако все мутантные штаммы, содержащие единственный ген pht , показали лучший рост по сравнению со штаммом Δ phtABDE Δ adcA , который не был способен расти в CDM-TPEN. Отсутствует дефект роста любого из штаммов в отсутствие TPEN (), что указывает на то, что наблюдаемые различия были вызваны отсутствием доступного Zn 2+ в среде. Таким образом, эти результаты показывают, что все четыре белка Pht способны вносить вклад в рекрутирование Zn 2+ с помощью AdcAII.Однако эти результаты также показывают, что белки Pht не являются полностью избыточными в том смысле, что они необязательны, поскольку штаммы, продуцирующие только один белок Pht, не росли так эффективно, как когда присутствовали все четыре белка.
Измерения роста пневмококковых штаммов in vitro . (A и B) Указанные штаммы выращивали в CDM-TPEN (т.е. в условиях, ограниченных Zn 2+ ) при 37 ° C, и рост контролировали с помощью измерений OD 600 каждые 30 минут. Поглощение при 600 нм или OD 600 показано в произвольных единицах (AU).(C) Контроль роста в CDM без добавок (т.е. в условиях полного Zn 2+ ). Данные представляют собой репрезентативное среднее (плюс стандартная ошибка среднего [SEM] [шкала ошибок]) OD 600 измерений из трех независимых биологических экспериментов.
Поверхностное прикрепление белков Pht необходимо для набора Zn
2+ .
В предыдущем исследовании мы идентифицировали аминокислоты в PhtD и PhtE, которые имеют решающее значение для поверхностного прикрепления белков. Мы также показали, что значительная часть (до 50% в штамме D39) от общего количества каждого продуцируемого белка Pht высвобождалась в культуральную среду во время роста планктона, даже у штаммов дикого типа (19).Неясно, какую биологическую роль выполняет этот материал, если таковая имеется. Как следствие, мы стремились исследовать, требуется ли поверхностное прикрепление белков Pht для приобретения Zn 2+ . Для оценки этого мы использовали штаммы, содержащие только один белок Pht, в который были введены специфические аминокислотные замены R26A, h37A и Q28A в PhtD или Q27A, h38A и R29A в PhtE, что привело к полной потере прикрепления к поверхности. белки (19). Эти мутантные штаммы также были созданы без adcA , чтобы выяснить влияние поверхностного прикрепления PhtD или PhtE на поглощение AdcAII Zn 2+ на этом фоне.Рост полученных штаммов (PhtD 3 Ala Δ adcA и PhtE 3 Ala Δ adcA ) в CDM-TPEN сравнивали со штаммами Δ phtABE Δ adcA и Δ phtABD Δ adcA . Результаты, представленные в, демонстрируют, что штаммы PhtD 3 Ala Δ adcA и PhtE 3 Ala Δ adcA не могут расти в CDM-TPEN, что указывает на то, что поверхностное прикрепление PhtD и PhtE является важным для их вклада в Zn . 2+ приобретение.
Сравнение роста in vitro штаммов с поверхностно-прикрепленными белками Pht или без них. Бактерии выращивали в CDM-TPEN (т.е. в условиях, ограниченных Zn 2+ ) при 37 ° C, и рост контролировали с помощью измерений OD 600 каждые 30 минут. Данные представляют собой репрезентативное среднее (плюс стандартная ошибка среднего) OD 600 измерений из трех независимых биологических экспериментов. WT, дикий тип.
Белки Pht не помогают в защите от внеклеточного стресса Zn
2+ .
Результаты этой работы и предшествующих исследований подтверждают участие белков Pht в облегчении получения Zn 2+ из окружающей среды в условиях, когда его доступность строго ограничена (9). Однако также вероятно, что они могут помочь защитить пневмококк, когда во внеклеточной среде присутствует избыток иона металла, который оказывает токсическое действие на бактерии, нарушая физиологическую функцию пермеазы ABC, PsaBCA, при импорте незаменимый ион переходного металла марганец (20, 21).Было высказано предположение, что белки Pht могут способствовать защите пермеазы PsaBCA от внеклеточного Zn 2+ , связывая избыточные ионы и действуя как «сток» (12, 22). Чтобы проверить эту гипотезу, пневмококки дикого типа и Δ phtABDE сначала выращивали в CDM-TPEN, чтобы вызвать максимальную экспрессию генов pht (6, 9), а затем субкультивировали в CDM с увеличивающимися концентрациями ZnSO 4 ( ). Как и ожидалось, высокие внеклеточные концентрации Zn 2+ нарушали рост бактерий и приводили к снижению конечной плотности клеток.Однако не было очевидных фенотипических различий между штаммами дикого типа и Δ phtABDE в любых условиях культивирования, что указывает на то, что белки Pht не защищали пневмококк от внеклеточного стресса Zn 2+ в исследованных условиях.
Сравнение роста in vitro штаммов дикого типа и Δ phtABDE , выращенных в условиях высокого внеклеточного стресса Zn 2+ . Бактерии выращивали в CDM с добавлением ZnSO 4 при 37 ° C, и рост контролировали с помощью измерений OD 600 каждые 30 минут.Данные представляют собой репрезентативное среднее (плюс стандартная ошибка среднего) OD 600 измерений из трех независимых биологических экспериментов.
Накопление ионов металлов
pht -дефицитных штаммов в условиях низкой доступности Zn 2+ .
Для дальнейшего изучения влияния наличия только одного гена pht , накопление металла в цельной клетке было измерено для всех соответствующих мутантных штаммов после роста в CDM-TPEN до OD 600 0,4 (). Следует отметить, что всем мутантам потребовалось приблизительно 5 часов для достижения этой плотности, за исключением контрольного штамма Δ phtABDE Δ adcA , для которого потребовалось приблизительно 8 часов.Этот штамм также имел наименьшее количество внутриклеточного Zn 2+ , и, поскольку приобретение Zn 2+ было основным ограничивающим фактором для его роста, мы пришли к выводу, что 30 мкг Zn 2+ на 1 г клеток (сухой вес ) было обнаружено, что он содержит минимум, необходимый для жизнеспособности пневмококков. Напротив, приобретение Zn 2+ в штамме Δ phtABDE Δ adcAII , где AdcA был единственным присутствующим белком, ответственным за поглощение металла, было нарушено в меньшей степени, что согласуется с нашими предыдущими результатами (9). .У штаммов, несущих только один из четырех генов pht , накопление Zn 2+ было больше, чем у штамма Δ phtABDE Δ adcA . Это показало, что все белки Pht были способны способствовать приобретению Zn 2+ через AdcAII, что согласуется с экспериментами по фенотипическому росту (2). Интересно, что штамм Δ phtABD Δ adcA (т.е. присутствующие AdcAII и PhtE) показал большее накопление Zn 2+ , чем другие штаммы с одним геном pht .Статистический анализ с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с посттестом Даннета для сравнения всех штаммов с мутантом Δ phtABDE Δ adcA показал значительные различия во всех случаях, за исключением Δ phtBDE Δ adcA и Δ phtADE Δ adcA штаммов. Тот же тест применяли также для сравнения всех штаммов с мутантом Δ adcA ; Из штаммов только с одним геном pht только мутант Δ phtABD Δ adcA не показал значимой разницы.Взятые вместе, эти результаты показывают, что продукция только одного белка Pht позволяет накопить больше Zn 2+ , чем когда все четыре белка Pht отсутствуют, но меньше, чем когда присутствуют четыре белка Pht.
Цельноклеточный Zn 2+ Накопление мутантных штаммов дикого типа и pht или adc , определенное методом ICP-MS. Планки погрешностей указывают на SEM. Все штаммы сравнивали с мутантами Δ adcA и Δ phtABDE Δ adcA (белые столбцы) с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием посттеста Даннета, и статистическая значимость была указана следующим образом: нс, не значимо; *, P <0.05; **, P <0,01; ***, P <0,001. Данные представляют собой средние значения (плюс SEM) минимум из трех биологических повторов.
Уровни экспрессии отдельных генов
pht в штаммах, дефицитных по pht .
В дополнение к вышеприведенному анализу измеряли изменения уровней экспрессии каждого из белков Pht в Zn 2+ -полных и Zn 2+ -голодных условиях. Мы предположили, что штаммы, в которых отсутствуют adcA и три из четырех генов pht , будут демонстрировать более высокие уровни экспрессии одного оставшегося гена pht в условиях голодания по Zn 2+ , чем мутант adcA , поскольку, как показано согласно предыдущим экспериментам, они не могут накапливать столько Zn 2+ и сталкиваются с более серьезной проблемой роста в CDM-TPEN.Напротив, было также возможно, что не будет различий в экспрессии pht между этими штаммами, если экспрессия pht уже была максимально дерепрессирована в мутанте Δ adcA . Чтобы исследовать это, штаммы выращивали в CDM-TPEN, и уровни экспрессии мРНК и белка каждого из генов и белков pht измеряли с помощью qRT-PCR и вестерн-блоттинга, соответственно, и сравнивали с уровнем экспрессии белка дикого типа, выращенного в CDM (). Результаты показывают, что в целом экспрессия pht была максимальной у штаммов, лишенных adcA и трех из четырех генов pht , что согласуется с трудностями, с которыми эти штаммы испытывают при получении достаточных количеств Zn 2+ для роста.Кроме того, транскриптов phtA и phtD было больше в их соответствующих тройных мутантных штаммах pht , чем в штамме, лишенном только adcA . Напротив, уровни экспрессии phtB и phtE были сходными в мутанте Δ adcA и соответствующем мутанте Δ adcA triple pht , хотя для phtE наблюдалась небольшая, но статистически значимая разница. Для контроля экспрессию оставшихся интактных белков Pht в тройных мутантах измеряли после роста в CDM, и не было обнаружено никаких отличий от экспрессии дикого типа, что указывает на то, что индукция экспрессии была специфически вызвана добавлением TPEN к носитель (данные не показаны).
Анализ уровней экспрессии Pht у дикого типа (белые полосы), Δ adcA (светло-серые полосы) или Δ phtXXX ( XXX представляет три локуса pht ) Δ adcA (темно-серые полосы ) штаммы, выращенные в CDM-TPEN, по сравнению со штаммом дикого типа, выращенным в CDM (черные столбцы). (A и B) показаны уровни экспрессии мРНК (A) и белка (B), нормализованные к уровням дикого типа, выращенного в CDM. Для мРНК измерения были сделаны относительно 16S рРНК. Планки погрешностей отображают SEM.Штаммы сравнивали со штаммами дикого типа, выращенными в CDM, с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием посттеста Даннета, и статистически значимые различия, где они присутствуют, указаны следующим образом: *, P <0,05; **, P <0,01. (C) Абсолютные уровни экспрессии белков PhtA, PhtB, PhtD и PhtE, выраженные в фемтомолях на 10 мкг бактериального лизата. Результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов.
В дополнение к этому анализу мы также количественно определили абсолютный уровень экспрессии каждого из белков Pht, поскольку, если бы один из белков был намного более распространенным в молярном отношении, чем любой из других, можно было бы предположить, что он будет играть роль более важную роль в импорте Zn 2+ .Однако, как показано на фиг.4, количества белка Pht были в значительной степени аналогичными в данных мутантных штаммах, за исключением PhtE в диком типе, выращенном в CDM. Экспрессия этого белка, по-видимому, более сильно подавляется в этой среде, что дает возможность более кратного увеличения при выращивании штаммов в CDM-TPEN.
В совокупности эти данные показывают, что экспрессия PhtB и PhtE уже была максимально дерепрессирована в мутанте Δ adcA и не могла быть дополнительно увеличена, даже когда степень голодания по Zn 2+ была увеличена удалением трех других pht гены.Напротив, в этих обстоятельствах PhtA и PhtD могут подвергнуться дальнейшей дерепрессии.
Избыточность белков Pht
in vivo : четыре Phts лучше, чем один.
Для сравнения пригодности штаммов , дефицитных по pht , in vivo , была проведена серия конкурентных экспериментов, в которых мышей интраназально инфицировали смешанной культурой двух мутантных штаммов. Через 24 и 48 ч мышей умерщвляли и подсчитывали бактерии из указанных ниш.Результаты отображаются в виде показателей конкурентоспособности, рассчитанных как отношение количества устойчивых к антибиотикам бактерий к контрольному штамму по отношению к входному соотношению ().
In vivo конкуренция между мутантом Δ adcA и штаммами, лишенными трех из четырех генов pht (Δ phtBDE Δ adcA [верхние графики] и Δ phtABE Δ adcA [нижние графики] ] мутанты). На каждую временную точку использовали восемь мышей. Результаты представлены как средние (± SEM) показатели конкуренции (отношение бактерий Δ phtXXX Δ adcA к бактериям Δ adcA с поправкой на входное соотношение).Средний индекс конкурентоспособности сравнивали с теоретическим средним значением 1 (пунктирная линия) с помощью тестов t для одной выборки, и статистическая значимость указывалась следующим образом: *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001; нс, не имеет значения.
Сначала мы попытались изучить влияние потери трех из четырех генов pht in vivo , поэтому мутант Δ adcA использовался в конкуренции с мутантами Δ phtBDE Δ adcA и с мутантами Δ phtABE Δ adcA мутанты.Эксперименты были ограничены этими мутантными штаммами из-за этических соображений относительно количества мышей, необходимого для оценки каждого штамма. Штаммы «только для PhtA» и «только для PhtD» были отобраны, поскольку PhtD является ведущим кандидатом на вакцину и, следовательно, представляет наибольший интерес, в то время как PhtA кодируется в локусе гена, отличном от локуса гена, кодирующего PhtD, и может дать иное представление о функциональные роли этих белков. Через 24 ч штамм, экспрессирующий только PhtA (Δ phtBDE Δ adcA мутант), был значительно менее конкурентоспособен, чем контрольный мутант Δ adcA во всех нишах, кроме плевральной жидкости лаважа, в то время как штамм, экспрессирующий только PhtD (Δ phtABE Δ adcA мутант) был значительно менее конкурентоспособен во всех нишах, за исключением ткани носа в этот момент времени.Через 48 часов штамм, экспрессирующий только PhtA, был значительно ослаблен в жидкости для промывания носа и носовой ткани, а штамм, экспрессирующий только PhtD, был значительно ослаблен только в жидкости для промывания носа. Эти результаты предполагают, что белки Pht не полностью дублируют in vivo , поскольку штаммы, содержащие только один из четырех генов pht , были значительно менее конкурентоспособными в ряде случаев по сравнению с мутантом Δ adcA , который имел все четыре гена pht не повреждены.Также очевидно, что продукция всех четырех белков Pht может иметь наибольшее значение на ранней стадии инфекции, поскольку в большинстве ниш различия, присутствующие через 24 часа, больше не проявляются через 48 часов.
Белки Pht играют роль не только в содействии приобретению Zn
2+ через AdcAII.
Также представляло интерес оценить, играют ли белки Pht роль (и) за пределами облегчения приобретения Zn 2+ через AdcAII. Для достижения этого был проведен конкурентный эксперимент с использованием штаммов Δ adcAII и Δ phtABDE Δ adcAII .Результаты соревновательного эксперимента представлены в. Мутант Δ adcAII был значительно более конкурентоспособным через 24 часа в легких, жидкости плеврального лаважа и крови, что указывает на то, что белки Pht действительно вносят вклад в патогенез независимо от AdcAII в этот момент времени. Однако через 48 часов этого не произошло. Интересно, что штамм, лишенный генов pht , был значительно более конкурентоспособным в жидкости для промывания носа в этот момент времени. Для справки, абсолютные числа КОЕ, извлеченные из всех экспериментов на животных моделях (в отличие от конкурентных индексов), показаны в.
In vivo конкуренция между мутантами Δ phtABDE Δ adcAII и Δ adcAII . На каждый момент времени использовали восемь мышей. Результаты представлены в виде средних (± SEM) показателей конкурентоспособности (отношение бактерий Δ phtABDE Δ adcAII к бактериям Δ adcAII с поправкой на входное соотношение). Средний индекс конкурентоспособности сравнивался со средним теоретическим значением 1 (пунктирная линия) с помощью тестов t для одной выборки, и статистическая значимость указывалась следующим образом: *, P <0.05; **, P <0,01; ***, P <0,001; нс, не имеет значения.
Количество КОЕ, выделенных в экспериментах на животных моделях. Значения показаны как средние плюс SEM.
ОБСУЖДЕНИЕ
Белки Pht представляют собой важное семейство поверхностно-ассоциированных факторов вирулентности, которые могут быть использованы в новых вакцинах на основе пневмококковых белков (13, –16). В этой работе мы исследовали, действуют ли четыре белка Pht избыточно, способствуя гомеостазу Zn 2+ .В условиях низкой доступности Zn 2+ присутствие любого из четырех белков обеспечивало лучший рост и увеличивало внутриклеточное накопление Zn 2+ по сравнению с тем, когда все четыре отсутствовали. Эти данные демонстрируют, что все четыре белка Pht способствуют усвоению пневмококком Zn 2+ с помощью AdcAII. Примечательно, что они также проясняют дебаты по поводу вклада PhtE, наиболее расходящегося члена семейства с точки зрения первичной структуры (32% идентичности с другими членами семьи по сравнению с более чем 60% идентичности, разделяемой между PhtA, PhtB и PhtD [ 2]), к гомеостазу Zn 2+ .Действительно, штамм Δ phtABD Δ adcA показал наибольшее накопление Zn 2+ в цельных клетках среди штаммов, продуцирующих только один белок Pht. Однако, несмотря на это наблюдение, эксперименты по выращиванию не выявили каких-либо устойчивых различий между четырьмя мутантными штаммами с одним геном pht . Таким образом, эти данные показывают, что каждый белок Pht обладает сходной способностью облегчать импорт Zn 2+ через AdcAII. Мы также наблюдали, что поверхностное прикрепление необходимо для белков, чтобы играть эту роль, тем самым исключая возможность подобного сидерофору механизма рекрутирования Zn 2+ .Кроме того, наши данные также показывают, что белки Pht не способствуют защите от внеклеточного стресса Zn 2+ .
Недавнее исследование пришло к выводу, что передача Zn 2+ от PhtD к AdcAII включает прямое взаимодействие (12). Поскольку сайт связывания с металлом AdcAII скрыт на ~ 10-15 Å под поверхностью белка (23), свободные ионы Zn 2+ не могут быть легко захвачены этим сайтом. Прямое взаимодействие с загруженным Zn 2+ белком Pht может сделать возможным связывание иона металла за счет индукции конформационного изменения в AdcAII, чтобы представить Zn 2+ на сайте связывания металла.Это взаимодействие может играть роль, аналогичную предполагаемому захвату Zn 2+ в AdcA его ZinT-подобным доменом и областью петли, богатой гистидином (9). Хотя возможность прямого взаимодействия AdcAII с PhtA, PhtB и PhtE не исследовалась, мы можем предположить, что они также будут действовать для доставки Zn 2+ в AdcAII таким прямым образом. Предположительно, это будет преимущественно задействовать высококонсервативные N-концы белков Pht, которые также находятся ближе к клеточной мембране (и, следовательно, к AdcAII), чем более открытые на поверхности С-концевые области.Однако эксперименты по иммунопреципитации, описанные Bersch et al. (12) использовали очищенные клеточные мембраны, которые могут неточно отражать условия, обнаруженные в интактных клетках; кроме того, стабильный комплекс между PhtD и AdcAII не может быть обнаружен с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в их исследовании (12). Предыдущие доказательства перекрестного связывания, якобы показывающие, что два очищенных белка взаимодействуют друг с другом in vitro , также были несколько слабыми, поскольку только небольшая часть очищенного PhtD стала ассоциироваться с AdcAII, несмотря на то, что последний присутствовал в 8-кратном размере. молярный избыток (6).Следовательно, нельзя сбрасывать со счетов возможность того, что перенос Zn 2+ в AdcAII белками Pht может происходить в отсутствие физического взаимодействия. Перенос Zn 2+ в AdcAII может вместо этого просто зависеть от белков Pht, увеличивающих локальную концентрацию металла около клеточной мембраны, тем самым увеличивая частоту встречи металла с AdcAII. Потребуются дальнейшие экспериментальные исследования, чтобы различать прямые и непрямые модели доставки Zn 2+ к AdcAII белками Pht.
Предыдущие исследования либо указывали на полную избыточность среди белков Pht (3, 17), либо наблюдали фенотипическое влияние, когда был удален только один ген pht , что согласуется с отсутствием избыточности белков (4). В этом исследовании мы наблюдали частичную избыточность, при которой штаммы, продуцирующие только один белок Pht, демонстрировали фенотип роста и уровни накопления Zn 2+ , промежуточные между уровнями штаммов, продуцирующих все четыре белка Pht или не продуцирующих белок Pht. Проще говоря, с точки зрения приобретения Zn 2+ , производство одного белка Pht было лучше, чем его отсутствия, но не так эффективно, как получение всех четырех.Таким образом, белки Pht имеют перекрывающуюся функциональность, и хотя данные отражают, что все они помогают в приобретении Zn 2+ через AdcAII, они не являются избыточными в том смысле, что их можно обойтись, поскольку удаление трех из четырех генов привело к к фитнесу стоили как in vitro , так и in vivo .
Это также отражалось в наблюдаемых уровнях экспрессии каждого из белков Pht, которые в целом увеличивались пропорционально серьезности проблемы получения достаточного количества Zn 2+ , испытываемой конкретным исследуемым штаммом. .Таким образом, штаммы, в которых отсутствовали три из четырех генов pht (а также adcA ), показали самые высокие уровни экспрессии pht при выращивании в CDM-TPEN. Однако наблюдались различия между белками Pht в отношении того, когда их экспрессия становилась максимально дерепрессированной. Экспрессия белков PhtB и PhtE, по-видимому, полностью дерепрессирована при ограничении Zn 2+ , независимо от того, присутствовали ли другие гены pht . Напротив, экспрессия PhtA и PhtD демонстрировала дальнейшую дерепрессию в отсутствие других белков Pht.Таким образом, существуют различия в степени регуляции генов pht в ответ на ограничение Zn 2+ и в способности пневмококка приобретать его. Это может указывать на то, что наличие четырех генов pht может быть полезным для приобретения пневмококком Zn 2+ , позволяя несколько «слоистых» повышений экспрессии белков, необходимых для этого процесса, в зависимости от точной степени сложности, с которой сталкиваются бактерии. в приобретении достаточного количества металла.Это наблюдение также отражает наши предыдущие данные о том, что кратное изменение экспрессии AdcAII больше, чем у AdcA, когда сравниваются условия с ограничением Zn 2+ и полным Zn 2+ . Это открытие привело к выводу, что роль AdcA заключается в обеспечении базового уровня рекрутирования Zn 2+ , а AdcAII обеспечивает большее усиление захвата Zn 2+ , когда иона особенно мало (9). Интересно отметить, что PhtE показал более сильное изменение уровней белка, чем другие белки Pht, и это может быть связано с несколько повышенным накоплением Zn 2+ в «только PhtE» Δ phtABD Δ adcA Мутант по сравнению с другими мутантами, лишенными трех из четырех генов pht .Присутствие шести мотивов гистидиновой триады в PhtE, что на один больше, чем обнаружено в трех других пневмококковых белках Pht, также может способствовать увеличению накопления Zn 2+ у этого мутанта. Кроме того, эти результаты дополнительно подтверждают представление о перекрывающейся функциональности белков Pht, поскольку они предполагают, что нарушение роста штаммов, лишенных трех генов pht , происходит из-за более низкого общего количества белка Pht, экспрессируемого в каждом штамме. Интересно, что степень перекрестной реактивности наблюдалась в Вестерн-блоттинге между различными членами семейства Pht для каждой антисыворотки (антисыворотки были созданы против отдельных белков Pht [16]), как наблюдалось ранее (13).Поэтому иммунизации только одним белком Pht может быть достаточно для индукции защитного иммунитета, нацеленного на нескольких членов семейства белков.
Результаты экспериментов на животных согласуются с выводом из работы in vitro о том, что все Pht-белки способны выполнять одну и ту же роль в поглощении Zn 2+ , но они не являются незаменимыми без нарушения приспособленности. Стоимость. Явное ослабление пригодности in vivo наблюдалось для штаммов, продуцирующих только PhtA или PhtD, по сравнению с контрольным штаммом Δ adcA (), что согласуется с продуцированием более чем одного белка Pht, благоприятного для пневмококкового патогенеза.Мы также наблюдали, что в отсутствие AdcAII белки Pht все еще вносят вклад в патогенез через 24 часа после инфицирования. Наши эксперименты до сих пор ясно продемонстрировали роль белков Pht в содействии приобретению Zn 2+ с помощью AdcAII, но окончательно не определили, вносят ли они также вклад в функциональность AdcA; такая роль могла бы объяснить наблюдаемые здесь результаты. Альтернативно, предполагаемая адгезия и свойства связывания фактора H белков Pht или комбинация всех этих ролей могут объяснять этот независимый от AdcAII вклад в патогенез (3, –5).Обнаружение того факта, что мутант Δ phtABDE Δ adcAII был более конкурентоспособным при смывании носа через 48 часов, также может быть объяснено тем, что белки Pht играют роль в прикреплении к поверхностям хозяина, поскольку можно ожидать, что этот штамм будет прикрепляться более слабо. чем мутант Δ adcAII и, таким образом, будет чрезмерно представлен в образце смывки для носа.
В обеих сериях экспериментов на животных можно видеть, что в большинстве случаев мутанты, лишенные генов pht , были значительно аттенуированы в различных нишах через 24 часа после заражения, но они выздоравливали через 48 часов.Это означает, что проблема получения достаточного количества Zn 2+ является более серьезной для пневмококка на ранних стадиях инфекции. Действительно, это подтверждается нашим предыдущим наблюдением, что одиночные мутанты, лишенные adcA или adcAII , ослаблены по сравнению с диким типом в носоглотке через 24, но не через 48 часов после инфицирования (9). Мы можем предположить, что массив Zn 2+ -связывающих белков, используемый S. pneumoniae , отражает серьезность этой проблемы.Пневмококк необычен среди патогенных бактерий, поражающих носоглотку, поскольку он обладает двумя специфическими для Zn 2+ SBP. Они, в сочетании с белками Pht, могут обеспечить преимущество перед другими микроорганизмами, с которыми пневмококку приходится конкурировать за колонизацию носоглотки, поскольку они могут обеспечить более эффективное получение ограниченных количеств доступного Zn 2+ . Ранее мы показали, что через 48 часов после инфицирования уровни Zn 2+ в организме хозяина повышаются и что это может быть иммунный механизм, используемый для воздействия на пневмококк токсичного избытка Zn 2+ (20).Высвобождение Zn 2+ согласуется с восстановлением (с точки зрения конкурентных индексов) штаммов с дефицитом поглощения Zn 2+ в этот момент времени, наблюдаемого в этом исследовании, поскольку увеличение количества металла означает его приобретение больше не будет представлять серьезной проблемы. Кроме того, такое восстановление для штаммов, лишенных генов pht , также согласуется с белками Pht, не способствующими защите от токсичности Zn 2+ , как мы обнаружили в случае in vitro .
У других стрептококков гомологи adcAII часто обнаруживаются только с одним геном pht в геноме (24). Учитывая, что мы показали, что все четыре белка Pht из S. pneumoniae имеют перекрывающиеся функциональные возможности в отношении помощи в доставке Zn 2+ в AdcAII, неясно, каково преимущество получения четырех таких белков по сравнению с возможно, просто производя большее количество одного белка Pht. Потребуются дальнейшие исследования, чтобы изучить, действительно ли каждый белок Pht вносит определенный вклад в приспособленность к пневмококкам, либо с точки зрения поглощения Zn 2+ , либо с точки зрения альтернативной роли вирулентности.Такое понимание будет иметь решающее значение для руководства будущей разработкой вакцины, нацеленной на это интригующее семейство поверхностных белков.
БЛАГОДАРНОСТИ
Эта работа была поддержана Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) (программный грант 565526; JCP и проектный грант 1022240 для CAM) и Австралийским исследовательским советом (гранты на открытие проекта DP120101432; и DP120103957 для JCP и САМ соответственно). J.C.P. является старшим научным сотрудником NHMRC.
Сноски
Опубликованы досрочно 28 июля 2014 г.
ССЫЛКИ
1.
Walker CLF, Rudan I, Liu L, Nair H, Theodoratou E, Bhutta ZA, O’Brien KL, Campbell H, Black RE.
2013.
Глобальное бремя детской пневмонии и диареи. Ланцет
381: 1405–1416. 10.1016 / S0140-6736 (13) 60222-6 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2.
Plumptre CD, Огунний А.Д., Патон JC.
2012 г.
Белки полигистидиновой триады патогенных стрептококков. Trends Microbiol.20: 485–493. 10.1016 / j.tim.2012.06.004 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3.
Огунний А.Д., Грабович М., Махди Л.К., Кук Дж., Гордон Д.Л., Садлон Т.А., Патон Дж.
2009 г.
Белки гистидиновой триады пневмококков регулируются Zn 2+ -зависимым репрессором AdcR и ингибируют отложение комплемента за счет рекрутирования фактора комплемента H. FASEB J.
23: 731–738. 10.1096 / fj.08-119537 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 4.
Хан М.Н., Пичичеро М.Е.
2012 г.
Вакцины-кандидаты PhtD и PhtE Streptococcus pneumoniae представляют собой адгезины, которые вызывают у человека функциональные антитела.Вакцина
30: 2900–2907. 10.1016 / j.vaccine.2012.02.023 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5.
Каллио А., Сеппонен К., Херманд П., Деноэль П., Годфроид Ф., Мелин М.
2014 г.
Роль пневмококковых белков гистидиновой триады (Pht) в прикреплении Streptococcus pneumoniae к клеткам респираторного эпителия. Заразить. Иммун.
82: 1683–1691. 10.1128 / IAI.00699-13 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6.
Луазель Э., Чималапати С., Буго С., Имберти А., Галле Б., Ди Гильми А.М., Браун Дж., Верне Т., Дурморт К.2011 г.
Биохимическая характеристика белка гистидиновой триады PhtD как цинк-связывающего белка пневмококка на клеточной поверхности. Биохимия
50: 3551–3558. 10.1021 / bi200012f [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 7.
Бейл Л., Чималапати С., Шон Дж., Браун Дж., Верне Т., Дурморт К.
2011 г.
Поглощение цинка Streptococcus pneumoniae зависит как от AdcA, так и от AdcAII и имеет важное значение для нормальной морфологии и вирулентности бактерий. Мол. Microbiol.
82: 904–916. 10.1111 / j.1365-2958.2011.07862.x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8.Льюис В.Г., член парламента Вина, Макдевитт, Калифорния.
2012 г.
Роль переносчиков кассет, связывающих АТФ, в патогенности бактерий. Протоплазма
249: 919–942. 10.1007 / s00709-011-0360-8 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9.
Plumptre CD, Eijkelkamp BA, Morey JR, Behr F, Couñago RM, Ogunniyi AD, Kobe B, O’Mara ML, Paton JC, McDevitt CA.
2014 г.
AdcA и AdcAII используют различные механизмы усвоения цинка и вносят дополнительный вклад в гомеостаз цинка у Streptococcus pneumoniae. Мол. Microbiol.
91: 834–851. 10,1111 / ммi.12504 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10.
Honsa ES, Johnson MDL, Rosch JW.
2013.
Роль переходных металлов в физиологии и патогенезе Streptococcus pneumoniae. Передний. Клетка. Заразить. Microbiol.
3:92. 10.3389 / fcimb.2013.00092 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11.
Шафик С., Койперс О.П., Клоостерман Т.Г.
2013.
Роль цинка во взаимодействии между патогенными стрептококками и их хозяевами. Мол. Microbiol.
88: 1047–1057. 10.1111 / mmi.12256 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12.Bersch B, Bougault C, Roux L, Favier A, Vernet T, Durmort C.
2013.
Новые сведения о белках гистидиновой триады: структура раствора домена PhtD Streptococcus pneumoniae и перенос цинка в AdcAII. PLoS One
8: e81168. 10.1371 / journal.pone.0081168 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13.
Годфроид Ф., Херманд П., Верлан В., Деноэль П., Пулман Дж. Т..
2011 г.
Доклиническая оценка белков Pht как потенциальных антигенов пневмококковой вакцины с перекрестной защитой. Заразить. Иммун.
79: 238–245.10.1128 / IAI.00378-10 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14.
Adamou JE, Heinrichs JH, Erwin AL, Walsh W., Gayle T., Dormitzer M, Dagan R, Brewah YA, Barren P, Lathigra R, Langermann S, Koenig S, Johnson S.
2001 г.
Идентификация и характеристика нового семейства пневмококковых белков, защищающих от сепсиса. Заразить. Иммун.
69: 949–958. 10.1128 / IAI.69.2.949-958.2001 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15.
Зайберлинг М., Болога М., Брукс Р., Очс М., Го К., Невеу Д., Камчоуа Т., Лэшли П., Юань Т., Гурунатан С.2012 г.
Безопасность и иммуногенность кандидата вакцины пневмококковой гистидиновой триады белка D у взрослых. Вакцина
30: 7455–7460. 10.1016 / j.vaccine.2012.10.080 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16.
Plumptre CD, Огунний А.Д., Патон JC.
2013.
Вакцинация против Streptococcus pneumoniae с использованием укороченных производных белка полигистидиновой триады D. PLoS One
8: e78916. 10.1371 / journal.pone.0078916 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17.
Rioux S, Neyt C, Di Paolo E, Turpin L, Charland N, Labbe S, Mortier MC, Mitchell TJ, Feron C, Martin D, Poolman JT.2011 г.
Регуляция транскрипции, возникновение и предполагаемая роль семейства Pht Streptococcus pneumoniae. Микробиология
157: 336–348. 10.1099 / mic.0.042184-0 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18.
Макаллистер Л.Дж., Ценг Х.Дж., Огунний А.Д., Дженнингс М.П., МакЭван А.Г., Патон Дж.С.
2004 г.
Молекулярный анализ комплекса пермеазы psa Streptococcus pneumoniae. Мол. Microbiol.
53: 889–901. 10.1111 / j.1365-2958.2004.04164.x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20.
Макдевитт CA, Огунний А.Д., Валков Э., Лоуренс М.К., Коби Б., МакЭван А.Г., Патон Дж.2011 г.
Молекулярный механизм восприимчивости бактерий к цинку. PLoS Pathog.
7: e1002357. 10.1371 / journal.ppat.1002357 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21.
Эйкелькамп Б.А., Мори-младший, член парламента Вина, Онг Си-Лай, МакЭван А.Г., Патон Дж.К., Макдевитт, Калифорния.
2014 г.
Внеклеточный цинк конкурентно ингибирует поглощение марганца и нарушает управление окислительным стрессом у Streptococcus pneumoniae. PLoS One
9: e89427. 10.1371 / journal.pone.0089427 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22.Лишер Дж. П., Гедрок Д. П..
2013.
Приобретение марганца и гомеостаз на границе «хозяин-патоген». Передний. Клетка. Заразить. Microbiol.
3:91. 10.3389 / fcimb.2013.00091 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23.
Луазель Э., Жакваме Л., Серр Л., Бовуа С., Феррер Дж. Л., Верне Т., Ди Гильми А.М., Дюрморт К.
2008 г.
AdcAII, новый пневмококковый Zn-связывающий белок, гомологичный переносчикам ABC: биохимический и структурный анализ. J. Mol. Биол.
381: 594–606. 10.1016 / j.jmb.2008.05.068 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24.Шао Z-Q, Чжан И-М, Пан X-Z, Ван Б., Чен Дж-Кью.
2013.
Понимание эволюции семейства белков гистидиновой триады (HTP) у Streptococcus. PLoS One
8: e60116. 10.1371 / journal.pone.0060116 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Варианты семейств PHT адаптируют солевой кресс-салат к ограничению фосфатов при засолении — Уровень — 2021 — Растения, клетки и окружающая среда
pce14027- sup-0001-Supinfo.docxWord документ 2007 г.
, 1.8 МБ
Таблица S1.Праймеры , используемые для qRT-PCR, клон PHT1, , промоторы EsABF5 и , и конструирование вектора.
Таблица S2. Сводка по 27 предполагаемым переносчикам Pi в кресс-салате.
Таблица S3. Известные связанные со стрессом цис- -элементов в промоторных областях до 2000 п.н. выше сайта начала транскрипции.
РИСУНОК S1. Субклеточная локализация, анализ активности транслокации Pi EsPHT1; 9 и активность промотора EsPHT1; 9 .(а) Субклеточная локализация EsPHT1; 9 в корнях трансгенного Arabidopsis. FM4-64 используется в качестве маркера плазматической мембраны. (b) Анализ комплементации EsPHT1; 9 генов в дрожжевом мутанте PAM2. Пустой вектор, штамм PAM2, содержащий пустой вектор вектор p416GPD; Штамм дрожжей дикого типа YPh599. Серийные разведения наносили на среду YNB, содержащую различные концентрации Pi (0,04 или 1 мМ). Изображения были сделаны через 3 дня. Желтый цвет и более темный коричнево-красный цвет отражают соответственно хороший и худший рост дрожжевых клеток.(c) Экспрессия GUS, управляемая промотором EsPHT1; 9 . Однонедельные трансгенные проростки pEsPHT19 :: GUS Arabidopsis, выращенные на среде 1/2 MS, подвергали LP или 100 мМ NaCl в течение 5 дней. Масштабная линейка = 3 мм. (d, e) Относительная экспрессия EsPHT1; 9 (d) и AtPHT1; 9 (e) в трансгенных проростках Arabidopsis, проанализированных с помощью qRT-PCR с использованием их специфических праймеров. Однонедельные проростки трансгенного Arabidopsis, выращенные на среде 1/2 MS, подвергали воздействию 100 мМ NaCl в течение 2 дней.Гены EF1α из Arabidopsis использовали в качестве внутреннего контроля.
РИСУНОК S2. Структура и филогенетический анализ EsABF5. (а) Аминокислотное выравнивание EsABF5 с белками AtABF из кресс-салата и арабидопсиса. Красные прямоугольники — это домены C1, C2, C3 и C4, а зеленые прямоугольники — домен bZIP. (б) Филогенетический анализ EsABF5. Филогенетическое дерево было построено методом Neighbor-Joining с помощью MEGA6.0, значения начальной загрузки взяты из 1000 повторов.EsABF1 (JQ971971), EsABF2 (JQ971972), EsABF3 (JQ971973) и EsABF4 (JQ971974) происходят из соленого кресс-салата. AtABF1 (AF093544), AtABF2 (AF093545) AtABF3 (AF093546), AtABF4 (AF093547), AtDBPF4 (AF334209), AtbZIP13 (BN000023), AtbZIP14 (BN000021), AtbZIP15 (AJN0000), AtbZIP15 (AJN000000), AtbZIP15 (AJN40000) (U01823), AtAREB3 (AB017162) и AtDPBF2 (AJ419600) происходят от Arabidopsis. OsABF1 (LOC_Os01g64730) и OsABF2 (LOC_Os06g10880) получают из риса. BnaABF1 (AGG35955), BnaABF2 (CCE88374), BnaABF3 (AGG35956) и BnaABF4 (AGG35957) происходят из Brassica napus .NtABF2 (AHD24943) происходит от Nicotiana tobacum . PtABF2 (ABN58425) происходит от Populus trichocarpa .
РИСУНОК S3. Относительная экспрессия EsPHT1; 9 в кресс-салате дикого типа и нокдаун-линии EsPHT1; 9 . Были взяты образцы десятидневных проростков, выращенных на среде 1/2 MS. Экспрессию гена оценивали с помощью qRT-PCR. Ген EF1α из кресс-салата использовали в качестве внутреннего контроля. Значения представляют собой средние значения ± SE ( n = 3).Звездочки указывают на существенное отличие от WT при ** p <0,01 при тесте t .
РИСУНОК S4. Содержание крахмала в листьях кресс-салата и арабидопсиса, выращенных при различных концентрациях Pi. Трехнедельные кресс-салаты и растения арабидопсиса, выращенные в растворе Хогланда половинной концентрации, переносили в HP (1 мМ KH 2 PO 4 ) и раствор LP (0,01 мМ KH 2 PO 4 ). Десять дней спустя соленый кресс-салат и листья Arabidopsis трех растений собирали в полдень (через 8 часов в световой фазе), соответственно.Крахмал экстрагировали из остатка путем измельчения в 0,5 мл 50 мМ ацетата натрия (pH 4,8), содержащего -амилазу (10 ед.) И амилоглюкозидазу (6 ед.). Экстракт инкубировали в течение 36 часов при 37 ° C для преобразования крахмала в глюкозу, что определяли с использованием набора для анализа Suc / D-Glc / D-Fru (Megazyme, Ирландия). Значения представляют собой средние значения ± SE ( n = 3). Звездочки указывают на существенное отличие от Arabidopsis при тех же концентрациях Pi при p <0,05 на t -тест.
РИСУНОК S5. Относительная экспрессия AtABF4 и AtPHT1; 9 в Arabidopsis дикого типа и мутанте abf4 . (а) Относительная экспрессия ABF4 у Arabidopsis WT и мутанта abf4 . (b) Относительная экспрессия AtPHT1; 9 у Arabidopsis WT и мутанта abf4 . Были взяты образцы десятидневных проростков, выращенных на среде 1/2 MS. Экспрессию гена оценивали с помощью qRT-PCR. Ген EF1α из Arabidopsis использовали в качестве внутреннего контроля.Значения представляют собой средние значения ± SE ( n = 3). Звездочки указывают на существенное отличие от WT при ** p <0,01 при тесте t .
Программа детской легочной гипертензии | Исследования и инновации
Врачи Бостонской программы детской легочной гипертензии внесли большой вклад в новые разработки в этой быстро развивающейся области.Эти взносы включают:
ранние исследования ингаляционного оксида азота для лечения легочной гипертензии (ЛГ)
участие в клинических испытаниях препаратов для лечения ЛГ, включая силденафил, амбризентан и трепростинил, а также оренитрам
Использование внутрисосудистой процедуры Поттса для лечения тяжелой ЛГ
Использование экстракорпорального мембранного оксигенатора в качестве моста к трансплантации легких
участвуют в научно-педагогических конференциях в У.S. и по всему миру
Последние клинические испытания включают :
Многоцентровое открытое 24-недельное неконтролируемое исследование для оценки безопасности, переносимости и фармакокинетики пероральных таблеток трепростинила с пролонгированным высвобождением после перехода от ремодулина или ингаляционной терапии простациклином или в качестве дополнения к существующей терапии ЛАГ у детей с простациклином de novo в возрасте от 7 до 17 лет с легочной артериальной гипертензией (TED-PH-206).
Внутривенный ремодулин (трепростинил) в качестве дополнительной терапии для лечения стойкой легочной гипертензии у новорожденных: рандомизированное плацебо-контролируемое исследование безопасности и эффективности (RIV-PN-201).
Объединение данных — масштабируемый реестр с открытым исходным кодом, расширяющий возможности исследований детских легочных сосудов
Масштабируемая совместная инфраструктура для обучающейся системы здравоохранения
TOPP-2 Международный регистр результатов и практики отслеживания легочной гипертензии у детей
Последние исследования и публикации включают :
Krishnan U, Feinstein JA, Adatia I, Austin ED, Mullen MP , Hopper RK, Hanna B, Romer L, Keller RL, Fineman J, Steinhorn R, Kinsella JP, Ivy DD, Rosenzweig EB, Raj U, Humpl T , Абман Ш. Сеть педиатрической легочной гипертензии (PPHNet).«Оценка и лечение легочной гипертензии у детей с бронхолегочной дисплазией». Педиатрический журнал . 2017, 20 июня.
Гева А., Гронсбелл Дж. Л., Кай Т., Кай Т., Мерфи С. Н., Лайонс Дж. К., Хайнц М. М., Наттер, доктор медицины, Патибандла Н., Бикель Дж., Маллен М. П. , Мандл К. Д.; Сеть педиатрической легочной гипертензии и Национальный институт сердца, легких и крови. Результаты исследования педиатрических легочных сосудистых заболеваний. Биоинформатика. Координационный центр клинических исследований. Вычислимый фенотип улучшает определение когорты в регистре детской легочной гипертензии. Педиатрический журнал . 2017, 15 июня
Ong MS, Mullen MP , Austin ED, Szolovits P, Natter M, Geva A, Cai T., Kong SW, Mandl KD. «Изучение основанной на коморбидности таксономии детской легочной гипертензии». Циркуляционные исследования . 13 июня 2017 г.
Маллен М.П., Кулик Т.Дж. .«Легочная гипертензия у детей: классификация, оценка и диагностика» и «Легочная гипертензия у детей: ведение и прогноз». Дата обновления . 2017.
Abman SH, Hansmann G, Archer SL, Ivy DD, Adatia I, Chung WK, Hanna BD, Rosenzweig EB, Raj JU, Cornfield D, Stenmark KR, Steinhorn R, Thebaud B, Fineman JR, Kuehne T., Feinstein JA, Friedberg MK, Earing M, Barst RJ, Keller RL, Kinsella JP, Mullen M , Deterding R, Kulik T , Mallory G, Humpl T, Wessel DL, Совет Американской кардиологической ассоциации по сердечно-легочным КПК, Реанимация, Совет по клиническому C , Совет по сердечно-сосудистым заболеваниям в Y, Совет по сердечно-сосудистым заболеваниям, Вмешательство, Совет по сердечно-сосудистым заболеваниям, анестезия, Американский торакальный S.«Детская легочная гипертензия. Рекомендации Американской кардиологической ассоциации и Американского торакального общества ». Тираж . 2015; 132: 2037-2099
Mullen MP , Andrus J, Labella MH, Forbes PW, Rao S, Harris JE , Kulik TJ , DeMaso DR. «Качество жизни и родительская адаптация при детской легочной гипертензии». Сундук . 2014; 145 (2): 237-244.
Исходы беременностей с легочной гипертензией для матери и плода: опыт специализированного центра
https: // doi.org / 10.1016 / j.tjog.2017.10.032Получить права и контент
Реферат
Цель
Беременности, осложненные ЛГТ, являются серьезной проблемой для акушеров из-за высокого риска осложнений у матери и плода. Целью исследования было представить наши материнско-фетальные исходы у беременных с легочной гипертензией.
Материалы и методы
Это исследование было выполнено с использованием данных, извлеченных из медицинских карт 23 беременностей 18 пациенток с ПГТ, находившихся под наблюдением в отделении акушерства и гинекологии.
Результаты
Средний возраст составил 27,09 ± 6,97 (диапазон: 14–38) лет. Наиболее частыми патологиями сердца у матери были пороки клапанов сердца (митральная или аортальная недостаточность) (n = 4), дефект межпредсердной перегородки (n = 3), митральный стеноз (n = 3), дефект межжелудочковой перегородки (n = 2) и аритмия ( п = 2). Кесарево сечение и нормальные вагинальные роды были выполнены при 13 и 7 родах соответственно. Лечебная дилатация и выскабливание выполнены 3 пациентам. Преждевременные роды произошли при 4 беременностях, 2 случая задержки внутриутробного развития, 1 преэклампсия и 2 отека легких у матери.Одной пациентке через 5 дней после родов была проведена повторная лапаротомия из-за гематомы матки. Всего родилось 20 новорожденных (14 девочек, 6 мальчиков). Большинство осложнений было замечено в продвинутых классах PHT.
Заключение
Уход за беременными с ПГТ требует хорошо спланированного, мультидисциплинарного подхода с упором на тщательный мониторинг до, во время и после родов. Такой подход может способствовать снижению неблагоприятных исходов для матери и плода.
Получение ежемесячного и межгодового общего уровня pH (pHT) на шельфе Восточно-Китайского моря с помощью искусственной нейронной сети: ANN-pHT-v1
Alin, SR, Feely , Р. А., Диксон, А. Г., Эрнандес-Айон, Дж. М.,
Джуранек, Л. В., Оман, М. Д., Герике, Р.: Надежный эмпирический анализ
соотношения для оценки карбонатной системы в южной Калифорнии
Текущая система и приложение к гидрографическим круизным данным CalCOFI
(2005–2011), Дж.Geophys. Res., 117, C05033, https://doi.org/10.1029/2011JC007511, 2012.
Bai, Y., Cai, WJ, He, XQ, Zhai, WD, Pan, D., Dai, MH, и Ага.
С .: Механистический полуаналитический метод дистанционного зондирования морской поверхности. p CO 2 в прибрежных океанах с преобладанием рек: тематическое исследование с Востока
Китайское море, J. Geophys. Res.-Ocean., 120, 2331–2349,
https://doi.org/10.1002/2014JC010632, 2015.
Бейтс, Н. Р., Астор, Ю. М., Черч, М. Дж., Карри, К., Дор, Дж.E.,
Гонсалес-Давила, М., Лоренцони, Л., Мюллер-Каргер, Ф., Олафссон, Дж.,
и Сантана-Касиано, Дж. М .: Взгляд временного ряда на изменение химического состава океана.
из-за поглощения океаном антропогенного CO 2 и закисления океана,
Oceanography, 27, 126–141, https://doi.org/10.5670/oceanog.2014.16, 2014.
Bostock, H.C., Mikaloff Fletcher, S.E., и Williams, M.J.M .: Оценка
карбонатные параметры по гидрографическим данным для среднего и глубинного
воды океанов Южного полушария, Biogeosciences, 10, 6199–6213,
https: // doi.org / 10.5194 / bg-10-6199-2013, 2013.
Cai, W. J., Hu, X. P., Huang W. J., Murrell, M. C., Lehrter, J. C., Lohrenz,
С. Е., Чжоу, В. К., Чжай, В. Д., Холлибо, Дж. Т., Ван, Ю. К., Чжао, П.
С., Го, X. Х., Гундерсен, К., Дай, М. Х. и Гонг, Г. С. Подкисление
подземные прибрежные воды, усиленные эвтрофикацией, Nat. Геоши., 4,
766–770, https://doi.org/10.1038/NGEO1297, 2011.
Цао, З.М., Дай, М.Х., Чжэн, Н., Ван, Д., Ли, К., Чжай, В.Д., Мэн, Ф .
Ф. и Ган Дж.П .: Динамика карбонатной системы на крупном континенте.
шельфовая система под воздействием как речного шлейфа, так и прибрежных
апвеллинг, J. Geophys. Res., 116, G02010, https://doi.org/10.1029/2010JG001596, 2011.
Картер, Б. Р., Уильямс, Н. Л., Грей, А. Р. и Фили, Р. А .: Локально.
интерполированная регрессия щелочности для оценки общей щелочности, Лимнол.
Oceanogr.-Meth., 14, 268–277, https://doi.org/10.1002/lom3.10087, 2016.
Картер, Б. Р., Фили, Р. А., Уильямс, Н.Л., Диксон, А. Г., Фонг, М. Б.,
и Такешита, Ю.: Обновленные методы для глобальных локально интерполированных
оценка щелочности, pH и нитратов, Лимнол. Океаногр-мет., 16,
119–131, https://doi.org/10.1002/lom3.10232, 2018.
Chen, C. S., Xue, P. F., Ding, P. X., Beardsley, R. C., Xu, Q. C., Mao, X.
М., Гао, Г. П., Ци, Дж. Х., Ли, Ч. Ю., Линь, Х. К., Коулз, Г., и Ши, М.
К .: Физические механизмы для морского отряда Чанцзян
Разбавленная вода Восточно-Китайского моря, J. Geophys.Res., 113, C02002,
https://doi.org/10.1029/2006JC003994, 2008.
Чен С.Л. и Ху К.М .: Оценка солености морской поверхности в северной
Мексиканский залив по данным спутниковых измерений цвета океана, Remote Sens.
Environ., 201, 115–132, https://doi.org/10.1016/j.rse.2017.09.004, 2017.
Chou, WC, Gong, GC, Sheu, DD, Hung, CC и Tseng, TF:
Распределение параметров химического состава углерода на поверхности Восточно-Китайского моря
летом 2007 г. J. Geophys. Res., 114, C07026, https: // doi.org / 10.1029 / 2008JC005128,
2009.
Chou, W. C., Gong, G. C., Tseng, C. M., Sheu, D. D., Hung, C. C., Chang, L.
П., Ван Л. В .: Карбонатная система в Восточно-Китайском море зимой, март.
Chem., 123, 44–55, https://doi.org/10.1016/j.marchem.2010.09.004, 2011.
Чжоу, В. К., Гонг, Г. К., Хунг, К. С., и Ву, Ю. Х .: Карбонатный минерал.
состояния насыщения в Восточно-Китайском море: настоящее и будущее
сценарии, Биогеонаука, 10, 6453–6467, https://doi.org/10.5194/bg-10-6453-2013, 2013.
Чиа, П., Сабин, К., Бала, Г., Бопп, Л., Бровкин, В., Канаделл, Дж.,
Чхабра, А., ДеФрис, Р., Галлоуэй, Дж., Хейманн, М., Джонс, К., Ле
Quéré, C., Myneni, R. B., Piao, S., and Thornton, P .: Carbon and
Другие биогеохимические циклы, в: Изменение климата 2013: Физическая наука
Основа. Вклад Рабочей группы I в Пятый отчет об оценке
Межправительственная группа экспертов по изменению климата, под редакцией: Stocker, T. F., Qin, D.,
Платтнер, Г. К., Тиньор, М., Аллен, С. К., Бошунг, Дж., Науэльс, А., Ся, Й., Бекс, В., и
Мидгли, П. М., Cambridge University Press, Кембридж, Соединенное Королевство
и Нью-Йорк, Нью-Йорк, США, 465–570, 2014.
Дай, А. и Тренберт, К. Э .: Оценки расхода пресной воды из
континенты: широтные и сезонные вариации, J. Hydrometeorol., 3,
660–687, 2002.
Дор, Дж., Лукас, Р., Сэдлер, Д., Черч, М., и Карл, Д.: Физические и
биогеохимическая модуляция закисления океана в центральной части Севера
Pacific, P. Natl. Акад. Sci. США, 106, 12235–12240, 2009.
Фридрих, Т. и Ошлис, А .: Оценки севера на основе нейронных сетей.
Поверхность Атлантики p CO 2 по спутниковым данным: методологическое исследование, J.
Geophys. Res., 114, C03020, https://doi.org/10.1029/2007JC004646, 2009.
Ge, JZ, Ding, PX, Chen, CS, Hu, S., Fu, G., and Wu, LY: An
интегрированная модельная система Восточно-Китайского моря и Чанцзянского лимана с целью
разрешение многомасштабной динамики региона – шельф – эстуарий, Ocean Dynam., 63,
881–900, https: // doi.org / 10.1007 / s10236-013-0631-3, 2013.
Gong, G. C., Liu, K. K., Chiang, K. P., Hsiung, T. M., Chang, J., Chen, C.
Ч., Хунг, Ч. К., Чжоу, В. Ч., Чанг, Ч. Ч., Чен, Х. Й., Шиа, Ф. К., Цай,
A. Y., Hsieh, C. H., Shiao, J. C., Tseng, C. M., Hsu, S. C., Lee, H. J.,
Ли М.А., Линь И.И. и Цай Ф.: наводнения на реке Янцзы усиливают прибрежные
биомасса фитопланктона океана и потенциальное производство рыбы, Geophys. Res.
Lett., 38, L13603, https://doi.org/10.1029/2011GL047519, 2011.
Гонсалес-Давила, М., Сантана-Касиано, Дж. М., Руэда, М. Дж., И Ллинас, О.: Распределение параметров карбонатной системы в водной толще на участке ESTOC с 1995 по 2004 г., Biogeosciences, 7, 3067–3081, https://doi.org/ 10.5194 / bg-7-3067-2010, 2010.
Гуо, XH, Zhai, WD, Dai, MH, Zhang, C., Bai, Y., Xu, Y., Li, Q., и
Ван, Г. З .: Воздушно-морские потоки CO 2 в Восточно-Китайском море на основе
многолетние текущие наблюдения, Biogeosciences, 12, 5495–5514,
https://doi.org/10.5194/bg-12-5495-2015, 2015.
Итикава, Х. и Бердсли, Р.К .: Современная система в Желтом и Восточном регионах
Китайские моря, J. Oceanogr., 58, 77–92,
https://doi.org/10.1023/A:1015876701363, 2002.
Исобе, А. и Мацуно, Т .: Процесс переноса питательных веществ на большие расстояния в
Шлейф реки Чанцзян на шельфе Восточно-Китайского моря летом, J. Geophys.
Res.-Ocean., 113, C04006, https://doi.org/10.1029/2007JC004248, 2008.
Juranek, L. W., Feely, R.A., Gilbert, D., Freeland, H., and Miller, L.A .:
Оценка pH и насыщенности арагонита в реальном времени с Argo
поплавки для профилирования: перспективы автономной стратегии наблюдения за углеродом,
Geophys.Res. Lett., 38, L17603, https://doi.org/10.1029/2011GL048580, 2011.
Laruelle, G. G., Landschützer, P., Gruber, N., Tison, J. L., Delille,
Б. и Ренье П.: Ежемесячно в глобальном масштабе с высоким разрешением стр. CO 2 климатология
для прибрежного океана, полученного с помощью интерполяции нейронной сети,
Biogeosciences, 14, 4545–4561, https://doi.org/10.5194/bg-14-4545-2017, 2017.
Лаувсет, С.К., Грубер, Н., Ландшютцер, П., Ольсен, А. и Тджипутра,
Дж .: Тенденции и движущие силы глобального pH поверхностного океана за последние 3 десятилетия,
Биогеонауки, 12, 1285–1298, https: // doi.org / 10.5194 / bg-12-1285-2015, 2015.
Le Quéré, C., Andrew, RM, Friedlingstein, P., Sitch, S., Hauck, J., Pongratz, J., Pickers, PA, Корсбаккен, Дж. И., Питерс, Г. П., Канаделл, Дж. Г., Арнет, А., Арора, В. К., Барберо, Л., Бастос, А., Бопп, Л., Шевалье, Ф., Чини, Л. П., Киаис, П., Дони, С.К., Гкрицалис, Т., Голл, Д.С., Харрис, И., Хаверд, В., Хоффман, Ф.М., Хоппема, М., Хоутон, Р.А., Хертт, Г., Ильина, Т., Джайн, А.К., Йоханнесен, Т., Джонс, К.Д., Като, Э., Килинг, Р.Ф., Гольдевийк, К.К., Ландшютцер, П., Лефевр, Н., Линерт, С., Лю, З., Ломбардоцци, Д., Мецл, Н., Манро, Д.Р., Набель, JEMS, Накаока, С., Нил, К., Олсен, А., Оно, Т., Патра, П., Перегон, А., Петерс, В., Пейлин, П., Пфейл, Б., Пьеро, Д., Поултер, Б., Редер, Г., Респланди, Л., Робертсон, Э., Роше, М., Роденбек, К., Шустер, У., Швингер, Дж., Сефериан, Р., Скельван, И., Штайнхофф, Т., Саттон, А., Танс, П.П., Тиан, Х., Тилбрук, Б., Тубиелло, Ф.Н., ван дер Лаан-Луйкс, ИТ, ван дер Верф, Г.Р., Виови, Н., Уокер, А. П., Уилтшир, А. Дж., Райт, Р., Зейле, С., и Чжэн, Б.: Глобальный углеродный бюджет 2018, Earth Syst. Sci. Data, 10, 2141–2194, https://doi.org/10.5194/essd-10-2141-2018, 2018.
Li, X .: Исходный код модели ИНС для оценки pH, Zenodo, https: / /doi.org/10.5281/zenodo.3519219, последний доступ: 25 октября 2019 г.
Li, X .: Среднемесячные входные переменные (T, S, DO, N, P, Si) и полученный pH, Zenodo, https://doi.org/10.5281/zenodo.3519236, последний доступ: 25 Октябрь 2019 г.
Li, X .: Производительность приложения модели ИНС на полке ECS, Zenodo, https://doi.org/10.5281/zenodo.3491747, последний доступ: 16 октября 2019 г.c.
Li, X .: Ежемесячное распределение поверхностного pH на шельфе Восточно-Китайского моря с 2000 по 2016 год, Zenodo, https://doi.org/10.5281/zenodo.2672943, последний доступ: 7 мая 2019 г.d.
Li, X .: Распределение профиля pH на 31N на шельфе Восточно-Китайского моря с 2000 по 2016 год, Zenodo, https://doi.org/10.5281/zenodo.2672929, последний доступ: 7 мая 2019e.
Ли, Х. Дж. И Чо, К. Х .: Сезонные схемы циркуляции Желтых и
Восточно-Китайские моря, полученные на основе спутниковых траекторий дрифтеров и
гидрографические наблюдения, Прог. Океаногр., 146, 121–141,
https://doi.org/10.1016/j.pocean.2016.06.004, 2016.
Люкер Т.Дж., Диксон А.Г. и Килинг К.Д .: Оушен стр. CO 2 рассчитывается на основе растворенного неорганического углерода, щелочности и уравнений для
K 1 и K 2 : Подтверждение на основе лабораторных измерений CO 2 в газе и морской воде при равновесии, мар.Chem., 70, 105–119,
https://doi.org/10.1016/S0304-4203(00)00022-0, 2000.
Мур-Мали, Б. Л., Аллен, С. Э., Иэнсон, Д.: Местные межгодовые
изменчивость приповерхностного pH и Ω A в проливе Джорджия,
J. Geophys. Res.-Ocean., 121, 1600–1625, https://doi.org/10.1002/2015JC011118, 2016.
Олден, Дж. Д. и Джексон, Д. А. Освещение «черного ящика»: a
рандомизационный подход для понимания вклада переменных в
искусственные нейронные сети, Ecol.Модель, 154, 135–150,
https://doi.org/10.1016/S0304-3800(02)00064-9, 2002.
Олден, Дж. Д., Джой, М. К., и Смерть, Р. Г.: точное сравнение
методы количественной оценки важности переменных в искусственных нейронных сетях
с использованием смоделированных данных, Ecol. Модель, 178, 389–397,
https://doi.org/10.1016/j.ecolmodel.2004.03.013, 2004.
Палац, А. П., Джон, М. А. С., Брюин, Р. Дж. У., Хирата, Т., и Грегг, В.
W .: Распределение функциональных типов фитопланктона в высоконитратовом,
воды с низким содержанием хлорофилла в новой диагностической модели экологических индикаторов,
Биогеонауки, 10, 8103–8157, https: // doi.org / 10.5194 / bgd-10-8103-2013,
2013.
Цюй, Б. X., Сун, Дж. М., Юань, Х. М., Ли, X. Г., Ли, Н., Дуань, Л. К., Чен,
X., и Lu, X .: Летняя динамика химического состава карбонатов в южной части желтого цвета.
Море и Восточно-Китайское море: региональные различия и меры контроля, продолжение. Полка
Res, 111, 250–261, https://doi.org/10.1016/j.csr.2015.08.017, 2015.
Raitsos, D. E., Lavender, S. J., Maravelias, C. D., Haralabous, J.,
Ричардсон А. Дж. И Рид П. К. Идентификация четырех фитопланктонов.
функциональные типы из космоса: экологический подход, Лимнол.Океаногр., 53,
605–613, https://doi.org/10.4319/lo.2008.53.2.0605, 2008.
Реджиани, Э. Р., Кинг, А. Л., Норли, М., Жаккар, П., Соренсен, К., и
Беллерби, Р. Дж. Дж .: Мониторинг pH смешанного слоя с помощью FerryBox.
Норвежское прибрежное течение, J. Mar. Syst., 162, 29–36,
https://doi.org/10.1016/j.jmarsys.2016.03.017, 2016.
Сабин, К. Л., Фили, Р. А., Грубер, Н., Ки, Р. М., Ли, К., Буллистер, Дж.
Л., Ваннинкхоф, Р., Вонг, К. С., Уоллес, Д. В. Р., Тилбрук, Б., Миллеро,
Ф.Дж., Пэн, Т. Х., Козырь, А., Оно, Т., и Риос, А. Ф .: Океанический сток для
антропогенный CO 2 , Science, 305, 367–371, 2004.
Sasse, T. P., McNeil, B. I., and Abramowitz, G .: новый метод для
диагностика сезонной и межгодовой динамики углерода поверхностного океана от
данные о бутылках с использованием нейронных сетей, Biogeosciences, 10, 4319–4340,
https://doi.org/10.5194/bg-10-4319-2013, 2013.
Sauzède, R., Claustre, H., Jamet, C., Uitz, J., Ras, J., Mignot, A ., а также
Д’Ортенцио, Ф.: Получение вертикального распределения хлорофилла-а
концентрация и состав сообщества фитопланктона in situ
профили флуоресценции: метод, основанный на нейронной сети с потенциалом
приложения глобального масштаба, J. Geophys. Рес.-Океан., 120, 451–470,
https://doi.org/10.1002/2014JC010355, 2015.
Sauzède, R., Claustre, H., Uitz, J., Jamet, C., Dall’Olmo, G.,
Д’Ортенцио Ф., Джентили Б., Пото А. и Шмехтиг К.
сетевой метод объединения цвета океана и данных Арго для увеличения поверхности
биооптические свойства до глубины: восстановление обратного рассеяния частиц
коэффициент, Дж.Geophys. Res.-Ocean., 121, 2552–2571,
https://doi.org/10.1002/2015JC011408, 2016.
Sauzède, R., Bittig, H.C., Claustre, H., de Fommervault, O.P.,
Гаттузо, Дж. П., Лежандр, Л., Джонсон, К. С .: Оценки водяного столба.
Концентрации питательных веществ и параметры карбонатной системы в Мировом океане:
Новый подход на основе нейронных сетей, Front. Мар. Наук, 4, 128,
https://doi.org/10.3389/fmars.2017.00128, 2017.
Шим, Дж. Х., Ким, Д., Кан, Ю. К., Ли, Дж. Х., Янг, С.Т., и Ким, К. Х .:
Сезонные колебания p CO 2 и его контролирующие факторы на поверхности
морская вода северной части Восточно-Китайского моря, конт. Полка Рес., 27, 2623–2636, г.
https://doi.org/10.1016/j.csr.2007.07.005, 2007.
Тамура С. и Татейши М .: Возможности четырехуровневой прямой связи
Нейронная сеть: четыре уровня против трех, транзакции IEEE на нейронной сети
Сети, 8, 251–255, https://doi.org/10.1109/72.557662, 1997.
Ууситало, Л .: Преимущества и проблемы байесовских сетей в
экологическое моделирование, Экол.Модель, 203, 312–318,
https://doi.org/10.1016/j.ecolmodel.2006.11.033, 2007.
Вело, А., Перес, Ф. Ф., Танхуа, Т., Гилкото, М., Риос, А. Ф., и
Ки, Р. М .: Оценка общей щелочности с использованием MLR и нейронной сети.
методы, J. Mar. Syst., 111/112, 11–18,
https://doi.org/10.1016/j.jmarsys.2012.09.002, 2013.
Уильямс, Н. Л., Джуранек, Л. В., Джонсон, К. С., Фили, Р. А., Райзер, С. К.,
Талли, Л. Д., Рассел, Дж. Л., Сармиенто, Дж. Л. и Ваннинкхоф, Р.:
Эмпирические алгоритмы оценки pH водной толщи Южного океана,
Geophys.Res. Lett., 43, 3415–3422, https://doi.org/10.1002/2016GL068539, 2016.
Вуттон, Дж. Т. и Пфистер, К. А.: Измерения углеродной системы и потенциал
Климатические факторы в условиях быстро падающего pH океана, PLoS ONE, 7,
e53396, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053396, 2012.
Вуттон, Дж. Т., Пфистер, К. А., и Форестер, Дж. Д .: Динамические модели и
экологические последствия снижения pH океана в многолетнем
набор данных, P. Natl. Акад. Sci. США, 105, 18848–18853,
https: // doi.org / 10.1073 / pnas.0810079105, 2008.
Чжай, В. Д. и Дай, М. Х .: О сезонных колебаниях CO между воздухом и морем 2 потоки во внешнем устье Чанцзян (река Янцзы), Восточно-Китайское море, март.
Chem., 117, 2–10, https://doi.org/10.1016/j.marchem.2009.02.008, 2009.
Zhai, WD, Zhao, HD, Zheng, N., and Xu, Y .: Подкисление берегов в
летние донные бедные кислородом воды в северо-западной и северной части Бохайского моря от
С июня по август 2011 г., Чин. Sci. Бюл., 57, 1062–1068,
https: // doi.org / 10.1007 / s11434-011-4949-2, 2012.
Zhai, W. D., Zheng, N., Huo, C., Xu, Y., Zhao, H. D., Li, Y. W., Zang, K.
П., Ван, Дж. Й. и Сюй, X. М.: Подземный pH и состояние карбонатной насыщенности
арагонита на китайской стороне Северного Желтого моря: сезонные
вариации и контроль, Биогеонаука, 11, 1103–1123,
https://doi.org/10.5194/bg-11-1103-2014, 2014.
Чжан Г., Чжан Дж. и Лю С. М .: Характеристика питательных веществ в
атмосферные влажные и сухие осаждения, наблюдаемые на двух участках мониторинга в течение
Желтое море и Восточно-Китайское море, Дж.Атмос. Chem., 57, 41–57,
https://doi.org/10.1007/s10874-007-9060-3, 2007.
Заболевание околощитовидной железы | Сидарс-Синай
Не то, что вы ищете?
Обзор
Паращитовидные железы отличаются от щитовидной железы, хотя названия похожи. Четыре паращитовидных железы обычно находятся на задней стороне щитовидной железы, но могут располагаться вокруг челюсти или шеи.
Паращитовидные железы выделяют гормон, называемый PHT.PHT регулирует обмен кальция между кровью и костями. Когда паращитовидная железа чрезмерно активна, из костей выводится слишком много кальция. Это называется гиперпаратиреозом или заболеванием паращитовидных желез.
Костям для прочности нужен кальций. Мозгу необходим кальций, чтобы думать, а мышцам — кальций, чтобы сокращаться. Недостаток кальция в костях вызывает серьезное заболевание, называемое остеопорозом (болезнь хрупкости костей). Избыток кальция в крови увеличивает риск инсульта и может вызвать тошноту.
Симптомы
Симптомы гиперпаратиреоза включают:
Совсем нет симптомов
Путаница, туманное мышление
Мышечные судороги. Покалывание в руках и ногах.
Потеря энергии, постоянная усталость
Проблемы со сном, просыпаться ночью.
Чувствую себя плохо, но не могу сказать причину
Потеря интереса к деятельности, невозможность концентрироваться
Изменения личности, более раздражительные или капризные
Боль в костях, особенно в ногах
Изжога (ГЭРБ)
Снижение полового влечения
Частые головные боли
Истончение волос
Учащенное сердцебиение (аритмия), высокое кровяное давление
Депрессия
Никогда не следует повышать уровень кальция в крови.Даже немного повышенный уровень кальция — это ненормально. Люди с немного повышенным уровнем кальция могут по-прежнему иметь пораженную паращитовидную железу.
Причины и факторы риска
Причина большинства аденом паращитовидных желез неизвестна. Чаще всего гиперпаратиреоз развивается в возрасте от 40 до 75 лет, но может возникнуть в любом возрасте. Средний возраст — 59 лет.
Эти факторы также могут увеличить риск:
Наследственность. Если у других членов семьи был гиперпаратиреоз, вы подвергаетесь большему риску развития этого заболевания.
Синдромы множественной эндокринной неоплазии (MEN1, MEN2a, MEN2b). Это условия, при которых опухоли могут расти в паращитовидных железах, гипофизе и поджелудочной железе. Это состояние также называют множественным эндокринным аденоматозом и синдромом Вермера. Обычно он передается по наследству (передается в семье).
История применения радиоактивного йода для лечения рака щитовидной железы.
Детский анамнез лучевого лечения прыщей или других состояний в области головы и шеи (обычное дело в 1940–1950-х годах).
Радиационное облучение в результате аварий на атомных электростанциях или от других источников.
Гиперплазия паращитовидных желез
Гиперплазия паращитовидных желез — это заболевание, отличное от гиперпаратиреоза. При гиперплазии все четыре паращитовидные железы увеличиваются в размерах, но аденома не растет внутри желез. Причина неизвестна. Длительное употребление лития (психиатрического препарата) может увеличить риск развития гиперплазии.
Диагностика
Врачи измеряют уровни паратиреоидного гормона и кальциевого гормона для диагностики гиперпаратиреоидного заболевания.Если оба повышены, это указывает на рост опухоли (аденомы). Аденома может все еще расти, если уровень паратироидного гормона в норме.
Сканирование Sestamibi помогает определить, какая паращитовидная железа поражена. Ваш врач также может назначить МРТ паращитовидных желез.
Лечение
Паращитовидные железы редко заболевают раком, но увеличенную железу необходимо удалить, поскольку она увеличивает содержание кальция в крови. Лекарства не могут контролировать уровень кальция.Хирургия — единственное лечение.
Люди могут нормально функционировать, имея только ½ одной паращитовидной железы.
Для стандартной хирургии околощитовидной железы требуется разрез от 6 до 8 дюймов в нижней части шеи.
В малоинвазивной хирургии паращитовидных желез (MIRP) используется специальный зонд для определения местоположения пораженной железы. MIRP требует только разреза в 1 дюйм.
Поглощение и отток холестерина нарушены в клетках трофобласта человека от беременностей с супрафизиологической гиперхолестеринемией матери
Исследовательские группы
Человеческие плаценты были получены от 55 нормальных доношенных беременностей из больницы Clinico UC-CHRISTUS (HCUC 43), Чили, n = и Lindenhofgruppe (Швейцария, n = 12). Расследование соответствовало принципам, изложенным в Хельсинкской декларации.Утверждение этических норм было получено от медицинского факультета Папского католического университета Чили (PUC, ID 11–066) и от кантона Берн, Швейцария (Basec Nr. 2016-00250). Информированное согласие и клинические данные пациентов были получены, как описано ранее 9 . Общие материнские (т. Е. Возраст, рост, вес, артериальное давление и уровень глюкозы) и неонатальные (т. Е. Пол, гестационный возраст, вес и рост) переменные были получены из историй болезни. В материнской и пуповинной крови уровни TC; холестерин липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), ЛПНП и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП); и триглицериды (Tg) определялись при сроке беременности (третий триместр).
Беременные женщины с TC <280 мг / дл были включены в группу MPH, а женщины с TC ≥ 280 md / dL в группу MSPH. Пороговое значение для MSPH отражало значения, при которых ранее сообщалось о фетоплацентарной эндотелиальной и сосудистой дисфункции 1,2,4,5,7,8,9,24 . Критериями исключения были материнское ожирение на сроке беременности, прегестационный и гестационный диабет, преэклампсия, ограничение внутриутробного развития, пороки развития плода и другие материнские патологии, как описано ранее 9 .
Анализы оттока на HDL и ApoA-I были выполнены на образцах из Чили и Швейцарии. Все остальные определения проводились только на образцах от чилийских женщин.
Определение материнского холестерина и триглицеридов
Уровни TC, HDL, LDL, VLDL и Tg определяли в материнской крови, полученной из плечевой венозной крови, и в пуповинной крови во время родов, как описано 9 . Определение липидов проводили в клинической лаборатории HCUC с помощью стандартных ферментно-колориметрических анализов, как описано ранее 9 .Концентрации ТС в образцах, взятых у женщин из Швейцарии, измеряли с помощью наборов ферментов, приобретенных в Biomérieux.
Первичная культура трофобласта человека (PHT)
PHT была получена путем выделения термина цитотрофобласта из свежей ткани ворсинок плаценты. После выделения клетки культивировали до 72 ч для получения дифференцированного синцитиотрофобласта, как описано 25,26 . Вкратце, после полоскания в физиологическом растворе (10 ммоль / л Hepes, pH 6,95 плюс 0,9% p / v NaCl) ткань плаценты тщательно измельчали и 30 г трижды (30 мин, 37 ° C) переваривали в физиологическом растворе. Раствор Хенкса / HEPES (HBSS; ммоль / л 5.37 KCl; 0,44 KH 2 PO 4 ; 136,9 NaCl; 0,34 Na 2 HPO 4 ; 5,55 глюкозы; 100 HEPES; 1,26 CaCl 2 ; 0,81 MgSO 4 · 7H 2 O; pH 7,4) плюс ДНКаза I (Worthington, США) (общая активность: 60,000, 40,000 и 30,000 килобайт соответственно для каждого расщепления) и трипсин (Thermo Fisher Scientific, США) (общая активность: 615,000, 410,000 и 315,000 единиц BAEE соответственно. , для каждого переваривания). После каждой стадии переваривания раствор фильтровали.Переваривание останавливали сывороткой новорожденного теленка (конечная концентрация: 20%) и центрифугировали (975 RCF, 20 ° C, 10 мин). Осадки клеток ресуспендировали в DMEM и разделяли центрифугированием (RCF 1500, 20 ° C, 20 мин) в градиенте Перколла (10–70%) (GE Healthcare, США). Клетки цитотрофобласта получали из фракций градиента от 35 до 55%. Клетки высевали при плотности 100000 клеток / см 2 в культуральную среду DMEM / F12 с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS, 10%) и 100 Ед / мл пенициллин-стрептомицин в стандартных условиях (37 ° C, 5% CO. 2 ) на 72 ч.Все запасы питательной среды были от Thermo Fisher Scientific (США). Чистоту культуры PHT (93–99%) определяли путем окрашивания клеток специфическими маркерами антицитокератина 7 (CK7), анти-виментина, анти-E-кадгерина и / или фактора фон Виллебранда (vWF). ) (Novus Biologicals, США) с последующим анализом проточной цитометрии в FACSDiva (BD Biosciences, США), как описано 27 . Синциализацию подтверждали визуализацией под микроскопом и определением хорионического гонадотропина человека в культуральных средах с помощью ELISA (R&D Systems, США).Все эксперименты начинали после 72 ч культивирования.
Вестерн-блоттинг
Срезы плаценты гомогенизировали для получения белковых экстрактов. Образцы лизировали в растворе 1 (ммоль / л 10 EDTA, 50 трис-HCl, pH 8,3), смешанном с равным объемом раствора 2 (4% SDS, 20% глицерин, 125 ммоль / л Tris / HCl, pH 6,8). , нагревают (50 ° C, 10 мин), обрабатывают ультразвуком (6 циклов, 10 с, 100 Вт, 4 ° C) и замедляют вращение (15000 RCF, 20 мин), как описано 9,28 . PHT лизировали в буфере для экстракции белков (100 ммоль / л NaCl, 0.5% Triton X-100, 1% SDS, 50 ммоль / л Tris / HCl, pH 7,4), содержащий смесь ингибиторов протеаз. Экстракты обрабатывали ультразвуком и определяли содержание белка с помощью набора для анализа белков бицинхониновой кислоты (микро BCA) (Thermo Fisher Scientific, США), как описано 28 .
Белки разделяли, как описано 9 , электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих и восстанавливающих условиях, переносили на поливинилидендифторидные мембраны и позже зондировали первичными кроличьими поликлональными анти-LDLR, анти-аполипопротеином B 100 (ApoB), анти-аполипопротеином AI ( ApoA-I) (Abcam, Великобритания), анти-SR-BI, анти-ABCA1 и анти-ABCG1 (Novus Biological, США), (1: 1000, 18 ч, 4 ° C) и мышиные моноклональные анти-3-гидрокси -3-метилглутарил-КоА редуктаза (HMGCR, 1: 500, 18 часов, 4 ° C) (Santa Cruz Biotechnology, США) и анти-β-актин (1: 5000, 1 час, комнатная температура) (Sigma-Aldrich, США) антитела.После промывки мембраны инкубировали (1 ч, комнатная температура) со вторичными козьими антикроличьими или антимышиными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Thermo Fisher Scientific, США), как описано 9 . Белки детектировали по усиленной хемилюминесценции и количественно определяли денситометрией. Необрезанные кляксы находятся в дополнительных данных.
Иммунофлуоресценция
Фиксированные формалином биоптаты плаценты (10% забуференный раствор формалина, 24 часа, 4 ° C) обрабатывали для рутинной заливки парафином и деления срезов (5 мкм) для гистологического анализа, как описано 9,28 .Для иммунолокализации срезы депарафинизировали и регидратировали серийными инкубациями в этаноле (100, 98, 75, 50%, 5 мин). Затем срезы кипятили в цитратном буфере (10 ммоль / л, 20 мин, pH 6,0), промывали в растворе фосфатного буфера (PBS, ммоль / л: 130 NaCl, 2,7 KCl, 0,8 Na 2 HPO 4 , 1,4 KH 2 PO 4 , pH 7,4) и инкубировали (1 ч, комнатная температура) в блокирующем буфере (100 ммоль / л NaCl, 0,05% Triton X-100, 5% бычий сывороточный альбумин (BSA), 50 ммоль / L Трис / HCl, pH 7.5). Срезы плаценты инкубировали (18 ч, 4 ° C) с первичными антителами к ферропортину-1 (FPN-1, маркер базальной мембраны синцитиотрофобласта), щелочной фосфатазой плаценты (PLAP, маркер апикальной мембраны синцитиотрофобласта), CD31 (маркер эндотелия), LDLR. , SR-BI, ApoB, ApoA-I, ABCA1 и ABCG1 и / или мышиные моноклональные анти-CK7 (Sigma-Aldrich, США) в блокирующем буфере (1:30). После двукратной промывки блокирующим буфером вторичные антитела козы против кролика, конъюгированные с Alexa Fluor 488 (H + L, λexc / λem: 495/568 нм, разведение 1: 1000), и конъюгированные с Alexa Fluor 568 козьи антимышиные IgG ( H + L, λexc / λem: 578/603 нм, разведение 1: 1000) (Thermo Fisher Scientific, США) в блокирующем буфере, содержащем 0.Добавляли 1 мкг / мл DAPI (4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид) (Invitrogen, США), как описано 28 . Срезы тканей закрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После двукратного промывания PBS (комнатная температура) покровные стекла исследовали в конфокальном микроскопе Nikon Eclipse C2. Изображения обрабатывались программой ImageJ версии 1.48 (NIH, США).
Выделение и маркировка липопротеинов
Для анализов поглощения и оттока липопротеины от небеременных доноров выделяли ультрацентрифугированием, как описано 29 .Вкратце, получали сыворотку и добавляли сахарозу (конечная концентрация: 10%), EDTA (10 ммоль / л, pH 7,4), апротинин (2 мкг / мл) и фенилметилсульфонилфторид (PMSF, 1 ммоль / л). Плотность сыворотки доводили с помощью KBr до 1,24 г / мл. К образцам (1,7 мл) добавляли PBS (3,3 мл, плотность: 1,006 г / мл) для создания градиента плотности путем ультрацентрифугирования (ротор SW55Ti, 287000 RCF, 15 ° C, 4 ч). Полосы, соответствующие LDL, HDL и сыворотке с обедненными липопротеинами (LPDS), выделяли из градиента.После диализа в физиологическом растворе (ммоль / л 150 NaCl, 0,34 EDTA, pH 7,4, 4 ° C, 48 ч), LDL и HDL хранили при 4 ° C в герметичной пробирке, насыщенной азотом. Концентрацию белка определяли, как описано в разделе вестерн-блоттинга. Правильное выделение липопротеинов определяли разделением SDS-PAGE с последующим окрашиванием Кумасси R-250 и вестерн-блоттингом для ApoB и ApoA-I.
Для анализов поглощения ЛПНП и ЛПВП метили липофильным флуоресцентным красителем 1,1′-диоктадецил-3,3,3 ‘, 3’-тетраметилиндокарбоцианина перхлорат (DiI, Invitrogen, США), как описано 30,31 .ЛПНП или ЛПВП (1 мг) смешивали с LPDS (2,5 мг / мл) и инкубировали с DiI (3 мг / мл в ДМСО, 15 ч, 37 ° C). Затем реакционную смесь центрифугировали (400 RCF, 20 ° C, 5 мин), и плотность супернатанта доводили до 1,24 г / мл с помощью KBr. LDL-DiI и HDL-DiI ультрацентрифугировали, выделяли, диализовали и хранили, как описано в предыдущем абзаце.
Анализы поглощения
Измеряли поглощение повышенных концентраций LDL-DiI (0–200 мкг / мл, 2 часа, 37 ° C) и HDL-DiI (0–50 мкг / мл, 4 часа, 37 ° C). в PHT, культивированных в течение 72 часов, которые предварительно инкубировали (в течение ночи) в DMEM / F12, содержащем 5% FBS, путем модификации ранее описанных протоколов 31,32,33,34 .После инкубации клетки промывали жирной кислотой, свободной от PBS-BSA (FFA) (2 мг / мл), и количественно определяли флуоресценцию (λexc / λem: 550/595) (Infinite M200Pro, Tecan, Австрия). Затем клетки лизировали 0,5 н. КОН, и концентрацию белков в каждом образце определяли с помощью набора реагентов Брэдфорда (Bio-Rad, США). Кроме того, была подготовлена стандартная кривая LDL-DiI и HDL-DiI (0–200 мкг / мл) и измерена флуоресценция. Поглощение выражали как нг липопротеина / мг клеточного белка (нг HDL-DiI или LDL-DiI / мг белка).Значения были скорректированы по гиперболе Михаэлиса-Ментен, и максимальная скорость (V max ) и кажущаяся константа Михаэлиса-Ментен (K m ) были рассчитаны, как описано ранее 7 .
Анализы оттока
Отток [ 3 H] -холестерина из PHT в ApoA-I или HDL определяли с небольшими модификациями, как описано 35,36 . Вкратце, PHT культивировали в течение 72 часов, которые предварительно инкубировали в течение 24 часов с DMEM / F12, содержащим 10% FBS с добавлением [ 3 H] -холестерина (0.5 мкКи / мл). После инкубации культуральную среду удаляли, и клетки промывали PBS с добавлением BSA-FFA (2 мг / мл). Затем клетки инкубировали с небеременными изолированными HDL (0–50 мкг / мл, 6 часов, 37 ° C) или ApoA-I (10 мкг / мл, 6 часов, 37 ° C) (Sigma-Aldrich, USA ). Впоследствии культуральную среду восстанавливали, и клетки лизировали КОН. Радиоактивность определяли как в культуральной среде, так и в клеточных лизатах, а отток оценивали как долю радиоактивного сигнала в среде по сравнению с общим сигналом в среде и клетках.Значения были скорректированы по гиперболе Михаэлиса-Ментен, и V max и K m были рассчитаны, как описано ранее 7 .
Чтобы определить относительный вклад SR-BI в отток холестерина, был проведен анализ путем ингибирования функции рецептора с помощью указанного ингибитора BLT-1 (0-50 мкмоль / л, 6,5 ч, 37 ° C) за 30 мин до инкубации ЛПВП 19,37 . В качестве контроля были выполнены параллельные анализы для определения сообщаемого эффекта BLT-1 как ингибитора SR-BI-опосредованного поглощения HDL.Поглощение HDL-DiI (50 мкг / мл, 6 часов, 37 ° C) определяли, как описано в предыдущем разделе, в присутствии или в отсутствие BLT-1 (10 мкмоль / л, за 1 час до анализа поглощения, 37 ° C). ) 37 .
Содержание холестерина в клетках
Экстракцию Фолча проводили на 70 мкг белка из лизата PHT, как описано 38 . Лизаты инкубировали с метанолом / хлороформом (1: 2 об. / Об., 30 мин, 50 ° C). Затем добавляли 1 объем воды (18 ч, 4 ° C) и реакционную смесь центрифугировали (750 RCF, 20 мин, 4 ° C).Фазу метанол / вода удаляли, а фазу хлороформа, содержащую клеточный холестерин, выделяли и полностью упаривали в атмосфере азота. Холестерин, экстрагированный из PHT, определяли с помощью анализа Amplex Red Cholesterol (Invitrogen, США) в присутствии или в отсутствие фермента холестеринэстеразы для определения общего (TC) и свободного холестерина (FC) соответственно. Сложные эфиры холестерина определяли как разницу между TC и FC. FC также определяли окрашиванием на филиппин (Sigma-Aldrich, США), как описано 39 .Клетки PHT фиксировали 4% параформальдегидом, их автофлуоресценцию гасили глицином в PBS (1,5 мг / мл, 20 мин, 20 ° C), а затем инкубировали с филиппином (25 мкг / мл, 30 мин, 20 ° C). ). Изображения получали в системе визуализации EVOS FL (Life Technologies, США), а флуоресценцию количественно оценивали с помощью ImageJ версии 1.48 (NIH, США).
Статистический анализ
Значения материнских и неонатальных характеристик представлены как среднее ± стандартное отклонение, как описано 9 .Для анализов in vitro значения представлены в виде среднего значения ± S.E.M., где n указывает количество использованных плаценты или клеточных культур (MPH = 3–9 и MSPH = 3–9). Сравнение между двумя или более группами было выполнено с помощью t-критерия Стьюдента или ANOVA (ANOVA используется только на рис. 1E). Статистически значимым считалось р <0,05. Для анализа данных использовалось программное обеспечение GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., США).
Рисунок 1
Синцитиотрофобласт и эндотелиальные маркеры в плаценте.
Тариф — основной (для юридических лиц)
Тарифы для государственных предприятий, организаций или учреждений, организаций, финансируемых из государственного бюджета
Тарифы для Кыргызского общества слепых и глухих
Тарифы для некоммерческих, религиозных и общественных организаций
Тарифы для организаций, созданных в соответствии с международными соглашениями, и лиц, работающих в международных проектах
Тарифы для индивидуальных предпринимателей
Тарифы для наемных работников, занятых в текстильном и швейном производствах
Тарифы для работников Парка высоких технологий и его дирекции
Тарифы для сельскохозяйственных кооперативов
Тарифы для общих категорий
Из них 6% тарифа могут идти на формирование пенсионных накоплений, а 16% – на формирование страховой пенсии, а могут, по выбору гражданина, все 22% идти на формирование страховой пенсии.
/ТАСС/. Фитнес-индустрия попросила Госдуму рассмотреть возможность снижения страховых взносов для работников всех субъектов фитнес-бизнеса как представителей социально-ориентированной отрасли на 2021-2022 годы. Об этом говорится в документах Ассоциации операторов фитнес-индустрии (АОФИ), подготовленных по итогам встречи представителей отрасли с депутатами Госдумы и ФНС (есть в распоряжении ТАСС).
Все это существенно затрудняет восстановление отрасли», — сообщила ТАСС президент АОФИ Ольга Киселева.
Арендодателей, снизивших плату не менее чем на 50%, АОФИ предлагает освободить от налога на имущество и земельного налога.
«Мы как законодатели готовы оказать поддержку в этом деле, проработать механизмы, которые бы позволили реализовать эти намерения. Например, это могли бы быть стимулирующие меры для предприятий, чтобы те направляли своих сотрудников на занятия фитнесом, а также меры, которые сделали бы фитнес более доступными для граждан. В частности, закон о налоговом вычете на спорт, который сейчас находится в Госдуме, — как раз один из шагов в этом направлении», — сказал Пайкин, его слова приводит пресс-служба.
1 января 2021 года налоговая служба автоматически переведет вас на ОСН. При этом важно помнить, что ОСН нельзя совмещать с упрощёнкой.
Проходим в раздел «Классификаторы» на вкладку «Страховые взносы»:
Данные видны, если пройти на вкладку меню «Зарплата и кадры», далее раздел «Справочники и настройки» пункт «Начисления».
Аналогичную информацию можно просмотреть в проводках документа:
Однако для оптимального роста и накопления цинка in vitro и выживания и пролиферации пневмококков in vivo требовалось продуцирование всех четырех белков Pht, что указывает на то, что, несмотря на их перекрывающуюся функциональность, эти белки нельзя обойтись без затрат на приспособленность. Мы также показываем, что поверхностно-прикрепленные формы белков Pht необходимы для рекрутирования цинка и что они не вносят вклад в защиту от внеклеточного цинкового стресса.
Однако на сегодняшний день основное внимание сосредоточено на их вкладе в гомеостаз ионов металлов.
Недавно мы показали, что рост мутанта Δ phtABDE Δ adcA был сильно ослаблен в средах, содержащих низкую концентрацию доступного Zn 2+ , по сравнению с ростом штамма Δ adcA и штамма in vivo. Фитнес мутанта Δ phtABDE Δ adcA был значительно ниже, чем у штамма Δ phtABDE Δ adcAII (9).В совокупности эти данные согласуются с тем, что AdcA может приобретать Zn 2+ независимо, тогда как AdcAII требует присутствия белков Pht для оптимальной функциональности (9).
Эффективность этих составов может зависеть от стимуляции опсонофагоцитарного ответа антител против этих поверхностных антигенов, а также от блокады их функции связыванием антител (13, –16). Как следствие, если белки Pht являются избыточными, потребуется перекрестно-реактивные антитела, которые связываются со всеми четырьмя белками, чтобы вызвать защиту, основанную на блокаде функции (функций) белков, тогда как, если они не являются избыточными, такая защитная эффект может быть получен из отдельных антител, специфичных к белку Pht.Хотя белки Pht обладают высоким сходством последовательностей, что позволяет предположить, что все они могут выполнять одну и ту же функцию, только phtD котранскрибируется с adcAII . Таким образом, вполне вероятно, что только PhtD может способствовать приобретению Zn 2+ . Ограниченное количество предыдущих исследований пролили некоторый свет на проблему избыточности в семействе белков. Огунний и др. обнаружили, что делеция всех четырех генов pht приводит к увеличению отложения комплемента на поверхности пневмококка и увеличению времени выживания после внутрибрюшинного заражения на мышиной модели заболевания по сравнению с диким типом (3).
Однако штаммы с одним или двумя удаленными генами pht не показали значительных отличий от дикого типа, что позволяет сделать вывод о функциональной избыточности белков Pht (3). Однако тройные мутанты pht (т.е. штаммы только с одним геном pht ) не тестировались в этом исследовании, что ограничивает силу выводов, которые можно было сделать. В другом исследовании Rioux et al. сообщили, что делеция всех четырех генов pht была необходима для наблюдения фенотипа нарушения роста в химически определенной среде с дефицитом катионов, тогда как одиночные, двойные или тройные (Δ phtBDE ) мутанты вели себя аналогично дикому типу (17) .Однако было показано, что делеция отдельных генов pht вызывает значительное снижение адгезии пневмококков к линиям клеток носоглотки и легких, что позволяет предположить, что белки Pht не полностью дублируют эту роль (4, 5).
Чтобы разрешить ранее противоречивые данные относительно избыточности белка Pht, мы оценили их функциональность более комплексно, чем это было выполнено ранее, путем создания и изучения фенотипов всех четырех возможных тройных мутантов pht (Δ phtBDE , Δ phtADE , Δ phtABE и Δ phtABD ), что позволяет исследовать способность каждого белка Pht вносить вклад в приобретение Zn 2+ в отсутствие трех других белков Pht.
ПЦР, секвенирование ДНК и иммуноблоттинг были использованы для подтверждения того, что желаемые мутации были внесены. Полный список штаммов, использованных в этом исследовании, приведен в. Варианты непрозрачной фазы использовались во всех экспериментах. Бактерии обычно выращивали при 37 ° C в атмосфере, обогащенной CO 2 , на колумбийском агаре с добавлением 5% (об. / Об.) Лошадиной крови. Если бактерии использовались для заражения мышей, их выращивали в сывороточном бульоне (10% инактивированной нагреванием лошадиной сыворотки в питательном бульоне). В качестве альтернативы использовали среду с определением катионов (CDM) (приготовленную, как описано ранее [9, 20]).Чтобы оценить эффект Zn 2+ голодания, хелатирующий агент N , N , N ‘, N ‘ -тетракис (2-пиридилметил) этилендиамин (TPEN) был добавлен в эквимолярной концентрации до Zn 2+ определено как находящийся в CDM с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) для получения CDM-TPEN.
Одна партия CDM использовалась для всех экспериментов в этом исследовании, и она была дополнена 13 мкМ TPEN для получения CDM-TPEN, когда это необходимо.
Интенсивность полос измеряли с помощью прикладного программного обеспечения производителя. Для измерения абсолютных молярных количеств белка стандартная кривая с диапазоном количеств соответствующего очищенного белка Pht была включена в Вестерн-блот и использовалась для калибровки интенсивностей полос, измеренных для клеточных лизатов, относительно абсолютных количеств, а также прогнозируемых молекулярных масс белки использовали для перевода в молярные количества (16).
Об авторе